BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ THÚY QUỲNH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CỎ SỮA LÁ LỚN (Euphorbia hirta L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÚY QUỲNH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CỎ SỮA LÁ LỚN (Euphorbia hirta L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Nguyễn Thu Hằng 2. ThS. Nguyễn Mạnh Thắng Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. NGUYỄN THU HẰNG (Bộ môn Dược liệu - Trường đại học Dược Hà Nội), người thầy đã luôn giành thời gian, tâm huyết để tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên và khích lệ tôi trong suốt quãng thời gian tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Mạnh Thắng, DS. Nguyễn Ngọc Cầu và DS. Nguyễn Thanh Tùng, những người đã luôn ở bên hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi để tôi có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Dược liệu trường Đại Học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận. Xin gửi lời cảm ơn đến TS. Hoàng Quỳnh Hoa, TS. Nguyễn Quốc Huy cùng các thầy cô của bộ môn Thực vật đã tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới những người thân yêu trong gia đình tôi, các anh chị, các bạn và các em sinh viên làm đề tài tại bộ môn Dược liệu đã luôn ủng hộ, cổ vũ và khích lệ tôi trong trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Thúy Quỳnh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Đặc điểm thực vật loài Euphorbia hirta L. 2 1.2. Phân bố 3 1.3. Thành phần hóa học 3 1.4. Tác dụng sinh học 11 1.5. Công dụng 14 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 15 2.1.1. Nguyên liệu 15 2.1.2. Hóa chất và dụng cụ 15 2.1.3. Thiết bị và máy móc sử dụng 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật 16 2.3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học 17 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật 18 3.1.1. Mô tả đặc điểm hình thái 18 3.1.2. Xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu 19 3.1.3. Đặc điểm vi phẫu 20 3.1.4. Đặc điểm bột dược liệu 22 3.2. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học 26 3.2.1. Định tính các nhóm hợp chất trong BPTMĐ cỏ sữa lá lớn bằng phản ứng hóa học 26 3.2.2. Định tính các phân đoạn dịch chiết BPTMĐ cỏ sữa lá lớn bằng sắc ký lớp mỏng 28 3.2.3. Định lượng flavonoid toàn phần trong BPTMĐ cỏ sữa lá lớn 33 3.3. Bàn luận 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AST Ánh sáng thường BHA Butyl hydroxyanisol BHT Butyl hydroxytoluen BPTMĐ Bộ phận trên mặt đất dd dung dịch ĐT Định tính IL Interleukin iNOS inducible nitric oxide synthase NXB Nhà xuất bản R Hệ số tương quan R 2 Hệ số xác định R f Hệ số lưu RSD Độ lệch chuẩn tương đối SD Độ lệch chuẩn SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự TLTK Tài liệu tham khảo TNF Tumour necrosis factor TT Thuốc thử UV Ultra violet UV-254 Ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm UV-366 Ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Các hợp chất flavonoid trong cây cỏ sữa lá lớn 3 1.2 Các hợp chất dimer hydroellargic tanin trong cây cỏ sữa lá lớn 6 1.3 Các galloyl-β-D-glucose trong cây cỏ sữa lá lớn 7 1.4 Các monomer tanin khác trong cây cỏ sữa lá lớn 7 1.5 Các triterpen trong cây cỏ sữa lá lớn 8 1.6 Các diterpen trong cây cỏ sữa lá lớn 10 3.1 Kết quả định tính các nhóm hợp chất trong BPTMĐ cỏ sữa lá lớn 27 3.2 Kết quả định tính phân đoạn dịch chiết n-hexan bằng SKLM với hệ dung môi cyclohexan-diethyl ether-acid acetic (2:8:0,1) 29 3.3 Kết quả định tính phân đoạn dịch chiết chloroform bằng SKLM với hệ dung môi toluen-chloroform-methanol (2:5:1) 31 3.4 Kết quả định tính phân đoạn dịch chiết ethyl acetat bằng SKLM với hệ dung môi toluen-ethyl acetat-methanol-acid formic (3:6:1:1) 32 3.5 Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ quercitrin chuẩn 35 3.6 Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong BPTMĐ cỏ sữa lá lớn 37 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang 1.1 Khung cấu trúc các galloyl-β-D-glucose trong cây cỏ sữa lá lớn 7 2.1 Ảnh chụp BPTMĐ cỏ sữa lá lớn nghiên cứu 15 3.1 Ảnh chụp toàn cây cỏ sữa lá lớn 19 3.2 Ảnh chụp các đặc điểm cây cỏ sữa lá lớn 20 3.3 Ảnh chụp vi phẫu lá cỏ sữa lá lớn 21 3.4 Ảnh chụp vi phẫu thân cỏ sữa lá lớn 22 3.5 Ảnh chụp các đặc điểm bột lá cỏ sữa lá lớn dưới kính hiển vi 24 3.6 Ảnh chụp các đặc điểm bột thân cỏ sữa lá lớn dưới kính hiển vi 24 3.7 Ảnh chụp các đặc điểm bột hoa cỏ sữa lá lớn dưới kính hiển vi 25 3.8 Ảnh chụp các đặc điểm bột quả cỏ sữa lá lớn dưới kính hiển vi 25 3.9 Sơ đồ định tính các nhóm hợp chất trong dịch cồn, dịch chiết nước và dịch chiết ether dầu hỏa BPTMĐ cỏ sữa lá lớn 26 3.10 Sơ đồ định tính các nhóm hợp chất khác trong BPTMĐ cỏ sữa lá lớn 26 3.11 Ảnh chụp sắc ký đồ phân đoạn dịch chiết n-hexan với hệ dung môi cyclohexan-diethyl ether-acid acetic (2:8:0,1) 29 3.12 Ảnh chụp sắc ký đồ phân đoạn dịch chiết chloroform với hệ dung môi toluen-chloroform-methanol (2:5:1) 30 3.13 Ảnh chụp sắc ký đồ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat với hệ dung môi toluen-ethyl acetat-methanol-acid formic (3:6:1:1) 32 3.14 Hình ảnh phổ quercitrin chuẩn tạo phức với nhôm clorid 34 3.15 Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ quercitrin 35 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây cỏ sữa lá lớn có tên khoa học là Euphorbia hirta L., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có nguồn gốc từ vùng Trung Mỹ [15], [36] và phân bố phổ biến ở Việt Nam [8]. Theo kinh nghiệm dân gian, cây cỏ sữa lá lớn được sử dụng để chữa các bệnh về đường tiêu hóa: tiêu chảy, kiết lỵ, viêm ruột, nhiễm khuẩn đường ruột [2], [6], [8], các bệnh đường hô hấp: ho, hen, viêm phế quản, khí phế thũng [8], các bệnh đường niệu, sinh dục: bệnh lậu [8], viêm thận, viêm bể thận [2]. Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới gần đây đã chứng minh cỏ sữa lá lớn có các tác dụng sinh học: tác dụng kháng khuẩn kháng nấm [57], [67], chống dị ứng [77], chống viêm [45], [49], ức chế miễn dịch [11], ức chế khối u [53], chống virus [32], tác dụng an thần, giảm đau [44], bảo vệ gan [23], tác dụng trên hệ thống thận [39] và đáng chú ý là các tác dụng hạ đường huyết [42], [50], [60] và tác dụng chống oxy hóa [20], [41], [65]. Về thành phần hóa học, các flavonoid [72], triterpen [56] và các hợp chất phenol [43], [72] đã được phân lập và xác định là các thành phần chính trong cây cỏ sữa lá lớn. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về cây cỏ sữa lá lớn còn chưa nhiều. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.)” được thực hiện với mục tiêu: 1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây cỏ sữa lá lớn. 2. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn. Kết quả của đề tài sẽ đóng góp thêm những thông tin khoa học về thực vật và hóa học, đặc biệt là hợp chất flavonoid của cây cỏ sữa lá lớn ở Việt Nam. 2 Chương 1. TỔNG QUAN Cây cỏ sữa lá lớn có tên khoa học là Euphorbia hirta L., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) [2]. Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [66], chi Euphorbia thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), bộ Thầu dầu (Euphorbiales), phân lớp Sổ (Dilleniidae), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta), giới Thực vật (Plantae). 1.1. Đặc điểm thực vật của loài Euphorbia hirta L. Cây thảo, sống hằng năm, cao 30-60 (70) cm. Rễ cọc, đường kính 3-5 mm [22]. Thân thường ít phân nhánh, phân nhánh từ giữa hoặc phía trên, mọc thẳng đứng, hiếm khi mọc bò, đường kính 3 mm [22], màu đỏ nhạt [6], [8], có nhựa mủ trắng [2], [8] và có nhiều lông che chở dài màu vàng nâu và lông ngắn hơn màu trắng [22]. Lá đơn, mọc đối, gốc cuống lá có hai lá kèm nhỏ hình tam giác [22] hay hình lông cứng [2], kích thước 0,8-1,7 mm, rụng sớm [22]. Cuống lá dài 1-3,5 mm, phiến lá hình mác-thuôn, elip dài, hoặc hình trứng-mác, kích thước 10-50 x 3-16 mm, màu không đồng đều từ xanh đến đỏ, thỉnh thoảng có các đốm màu đỏ tía dọc theo gân giữa, cả hai mặt đều có lông dày [22], gốc phiến lá tròn, hơi lệch [8], mép lá nửa dưới toàn bộ hoặc một phần có răng cưa, nửa trên có răng cưa nhỏ hơn [22], ngọn lá nhọn [8], [22] hoặc tù [22]. Cụm hoa giống đầu [22], mọc ở nách lá [2], [8], dạng xim, có cuống dài 25 mm, tất cả các bộ phận đều có nhiều lông [22], tổng bao hình chuông [8], [22], kích thước 1×1 mm, có lông, mép chia 5 thùy, hình trứng-tam giác, có 4 tuyến màu đỏ, hình tròn đến elip, ở giữa hơi trũng, phần phụ có màu từ trắng đến đỏ, hình elip đến tam giác, kích thước 0,3-0,2 mm, toàn bộ mép hơi gợn sóng [22]. Hoa đơn tính [22]. Một cụm hoa có 4-5 hoa đực [1]. Hoa đực tiêu giảm chỉ còn 1 nhị, đối diện lá bắc nhỏ [22], bao phấn màu đỏ [22], mở ở đỉnh hoặc cạnh [8]. Hoa cái có cuống ngắn, bầu cao, nhô ra khỏi tổng bao hình chuông, bầu 3 ngăn, có lông thưa thớt, vòi nhụy chia 2 thùy [22]. Quả nang 3 góc, kích thước 1-1,5×1- 1,5 mm, có nhiều lông ngắn, mịn, cuống dài 1,5 mm [22], có 3 hạt [2]. Hạt thuôn, hình lăng trụ bốn mặt, 0,7-0,9×0,4-0,5 mm, hơi xù xì, màu đỏ và không có mào. Số nhiễm sắc thể 2n=18. Mùa hoa và quả từ tháng 6 đến tháng 12 [22]. [...]... (Đức) 2.2 Nội dung nghiên cứu  Nghiên cứu đặc điểm thực vật cây cỏ sữa l l n - Mô tả đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học - Mô tả đặc điểm vi phẫu thân, l - Mô tả đặc điểm bột thân, l , hoa, quả  Nghiên cứu thành phần hóa học cây cỏ sữa l l n - Định tính các nhóm hợp chất bằng phản ứng hóa học - Định tính các phân đoạn dịch chiết n-hexan, chloroform, ethyl acetat bằng sắc ký l p mỏng (SKLM)... BP TMĐ TLTK [75] [75] 7 1.3.2.2 Các monomer hydrolysable tanin  Các galloyl-β-D-glucose trong cây cỏ sữa l l n có khung cấu trúc như hình 1.1 và được trình bày tóm tắt ở bảng 1.3 Hình 1.1 Khung cấu trúc các galloyl-β-D-glucose trong cây cỏ sữa l l n Bảng 1.3 Các galloyl-β-D-glucose trong cây cỏ sữa l l n Ký hiệu Tên chất Cấu trúc hóa học 2,4,6-tri-O- Bộ R1 = R3 = H phận galloyl-β-D- (2 5) glucose... 1,3,4,6-tetra-O- L glucose [43], [75] R2 = R4 = R6 = R2 = H galloyl-β-D- (2 6) TLTK L [43], [75] R1 = R3 = R 4 = R6 = 1,2,3,4,6-pentaO-galloyl-β-D- (2 7) glucose L [75] R1= R2 = R3= R4= R6=  Các monomer tanin khác trong cỏ sữa l l n được trình bày ở bảng 1.4 Bảng 1.4 Các monomer tanin khác trong cây cỏ sữa l l n Ký hiệu Tên chất (2 8) Geraniin Cấu trúc hóa học Bộ phận L TLTK [75] 8 (2 9) Terchebin L [75] L . .. Tinh dầu Thành phần tinh dầu l cỏ sữa l l n gồm: 3,7,11,15-tetramethyl-2-hexadecen-1ol, 6,10,14-trimethyl-2-pentadecanon, hexadecanal, phytol, acid n-hexadecanic, 2butoxy ethanol, butyl tetradecyl phthalat, 13-heptadecyn-1-ol, 2-methyl-1-hexadecanol, diisooctyl 1,2-benzen dicarboxylat [51] 1.3.8 Các thành phần khác  Alcol: quercitol [36], myricyl alcol [6], [36], inositol, L- hexacosanol [8]  Ankan:... l p trong cây cỏ sữa l l n đều thuộc nhóm tanin thủy phân 6 1.3.2.1 Các dimer dehydroellagic tanin  Các hợp chất dimer dehydroellagic tanin trong cây cỏ sữa l l n được trình bày tóm tắt ở bảng 1.2 Bảng 1.2 Các hợp chất dimer dehydroellagic tanin trong cây cỏ sữa l l n Cấu trúc hóa học Bộ phận Ký hiệu Tên chất (2 1) Euphorbin A (2 2) Euphorbin B (2 3) Euphorbin C L [74] (2 4) Euphorbin E L [76] BP TMĐ... hưởng đến đào thải Na+ Nghiên cứu cho rằng các thành phần có hoạt tính trong dịch chiết nước l cỏ sữa l l n có cơ chế l i tiểu tương tự như acetazolamid [39] Bên cạnh đó, dịch chiết methanol của l và thân cỏ sữa l l n có tác dụng ức chế men chuyển angiotensin 90% và 50% ở các mức liều tương ứng 500 μg và 150 μg sử dụng xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết enzym (ELISA) Nghiên cứu cho thấy rằng hầu... Định l ợng flavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật - Mô tả đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học: Mẫu cây cỏ sữa l l n được mô tả theo phương pháp mô tả phân tích, đối chiếu với khóa phân loại chi Euphorbia, bản mô tả loài Euphorbia hirta L trong Thực vật chí Trung Quốc [22] và Khóa xác định và hệ thống họ Thầu dầu Việt Nam của. .. chụp các đặc điểm hình thái cây cỏ sữa l l n được trình bày ở hình 3.1 và hình 3.2 3.1.2 Xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu Căn cứ vào đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, đối chiếu với khóa phân loại chi Euphorbia, bản mô tả loài Euphorbia hirta L của Thực vật chí Trung Quốc [22] và Khóa xác định và hệ thống họ Thầu dầu Việt Nam của GS.TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn [7] cùng với sự giúp đỡ của TS Nguyễn... mẫu cỏ sữa l l n nghiên cứu đã được xác định tên khoa học l Euphorbia hirta L. , họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Hình 3.1 Ảnh chụp toàn cây cỏ sữa l l n 20 Hình 3.2 Ảnh chụp các đặc điểm cây cỏ sữa l l n Chú thích: 1, 2 L 7 Hoa cái 11 Hoa đực 14 Quả cắt ngang 3,4 Cụm hoa tổng 8 Bầu 12 Bao phấn 15 Quả cắt dọc 5 Cụm hoa 9 Bầu cắt ngang 13 Quả 16 Hạt 6 Cụm hoa đã bóc tách 10 Bầu cắt dọc 3.1.3 Đặc điểm. .. sữa l l n (Euphorbia hirta L. ) gồm flavonoid, tanin, triterpen, diterpen, sterol, acid hữu cơ, tinh dầu và các thành phần khác 1.3.1 Flavonoid Các hợp chất flavonoid trong cây cỏ sữa l l n được trình bày tóm tắt ở bảng 1.1 Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid trong cây cỏ sữa l l n Ký hiệu Tên chất ( 1) Afzelin ( 2) Euphorbianin ( 3) Epicatechin gallat Cấu trúc hóa học Bộ phận TLTK Toàn [47], cây [48] Toàn . phần hóa học của cỏ sữa l l n (Euphorbia hirta L. ) được thực hiện với mục tiêu: 1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây cỏ sữa l l n. 2. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ sữa l l n. . l n nghiên cứu 15 3.1 Ảnh chụp toàn cây cỏ sữa l l n 19 3.2 Ảnh chụp các đặc điểm cây cỏ sữa l l n 20 3.3 Ảnh chụp vi phẫu l cỏ sữa l l n 21 3.4 Ảnh chụp vi phẫu thân cỏ sữa l l n 22 3.5. phân l p và xác định l các thành phần chính trong cây cỏ sữa l l n. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về cây cỏ sữa l l n còn chưa nhiều. Vì vậy, đề tài Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần