BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ VIỆT NGÂN XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT NHÓM ANTHOCYANIN TRONG RAU CỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ VIỆT NGÂN XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT NHÓM ANTHOCYANIN TRONG RAU CỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Lê Đình Chi 2. TS. Lê Thị Hồng Hảo Nơi thực hiện : 1. Bộ môn hóa phân tích – độc chất 2. Viện kiểm nghiệm ATVSTP Quốc gia HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với sự giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo, tôi đã hoàn thành khóa luận của mình. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn tới TS. Lê Đình Chi đã tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết khóa luận. Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS. Lê Thị Hồng Hảo đã tạo điều kiện, giúp em hoàn thành đề tài. Em xin chân thành cảm ơn TS. Lê Thị Hồng Hảo, ThS. Vũ Thị Trang đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Em gửi lời cảm ơn tới các anh chị, những người làm việc ở Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã quan tâm, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho em hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đã luôn bên em, chia sẻ khó khăn, động viên, và giúp đỡ trong học tập cũng như trong cuộc sống. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không tránh những thiếu sót. Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn sinh viên. Hà Nội, Ngày 11 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Lê Việt Ngân MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ANTHOCYANIN 3 1.1. Giới thiệu 3 1.2. Cấu trúc hóa học của Anthocyanin 3 1.3. Tính chất của Anthocyanin 4 1.4. Tác dụng của Anthocyanin 6 1.5. Sự phân bố của Anthocyanin 8 1.6. Một số phương pháp phân tích Anthocyanin 9 1.7. Tổng quan về HPLC 10 1.7.1. Khái niệm chung 10 1.7.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký 10 1.7.3. Thiết bị sắc ký lỏng 12 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Đối tượng nghiên cứu 17 2.2. Nguyên vật liệu - thiết bị 17 2.2.1. Nguyên vật liệu 17 2.2.2. Thiết bị 18 2.2.3. Nội dung nghiên cứu 19 2.3. Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích Anthocyanin bằng HPLC 19 2.3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 20 2.3.3. Thẩm định quy trình 21 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu 21 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1. Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích một số Anthocyanin bằng phương pháp HPLC 22 3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện 22 3.1.2. Khảo sát điều kiện chạy sắc ký 23 3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu 28 3.2.1. Khảo sát thời gian thủy phân 28 3.2.2. Khảo sát nhiệt độ thủy phân 30 3.2.3. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu 31 3.3. Thẩm định phương pháp 33 3.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc 33 3.3.2. Khoảng tuyến tính 34 3.3.3. Độ lặp lại 37 3.3.4. Độ thu hồi 40 3.3.5. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 43 3.4. Kết quả áp dụng phương pháp xác định Anthocyanin trong một số thực phẩm rau củ 44 3.5. Bàn luận 44 3.5.1. Lựa chọn phương pháp 44 3.5.2. Điều kiện xử lý mẫu 45 3.5.3. Xây dựng phương pháp định lượng 45 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1. Kết luận 47 4.2.Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt AOAC Association of Official Analytical Community Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức HPLC High high performance liquidchromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPTLC High performance thin layer chromatography sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao IS Ionspray Voltage Thế phun ion LC- MS/MS Liquid chromatography tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MS Mass spectrometry Khối phổ R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn TEM Ion source Temperature Nhiệt độ nguồn PDA Photodiode Array Mảng diod quang DEL Delphinidin CYA Cyanidin PEL Pelargonidin DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1: Cấu trúc của 6 chất phổ biến nhất trong nhóm anthocyanin 4 Bảng 1.2: Hàm lượng anthocyanin toàn phần có trong một số mẫu thực vật tại Việt Nam 8 Bảng 1.3: Một số phương pháp phân tích anthocyanin 9 Bảng 2.1: Danh mục các pha động HPLC khảo sát 20 Bảng 3.1: Chương trình gradient 1 24 Bảng 3.2: Chương trình gradient 2 25 Bảng 3.3: Chương trình gradient 3 26 Bảng 3.4: Chương trình gradient 4 27 Bảng 3.5: Hàm lượng các chất theo thời gian thủy phân 29 Bảng 3.6: Hàm lượng các chất tại các nhiệt độ thủy phân khác nhau 30 Bảng 3.7: Hàm lượng các chất tại các tỷ lê dung môi chiết khác nhau 32 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn delphinidin 35 Bảng 3.9: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn cyanidin 36 Bảng 3.10: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn pelargonidin 37 Bảng 3.11: Độ lặp lại delphinidin trên nền mẫu rau 38 Bảng 3.12: Độ lặp lại cyanidin trên nền mẫu rau 38 Bảng 3.13: Độ lặp lại pelargonidin trên nền mẫu rau 39 Bảng 3.14: Độ lặp lại cyanidin trên nền mẫu củ 39 Bảng 3.15: Độ lặp lại pelargonidin trên nền mẫu củ 40 Bảng 3.16: Độ thu hồi của delphinidin trên nền mẫu rau 41 Bảng 3.17: Độ thu hồi của cyanidin trên nền mẫu rau 41 Bảng 3.18: Độ thu hồi của pelargonidin trên nền mẫu rau 42 Bảng 3.19: Độ thu hồi của delphinidin trên nền mẫu củ 42 Bảng 3.20: Độ thu hồi của cyanidin trên nền mẫu củ 42 Bảng 3.21: Độ thu hồi của pelargonidin trên nền mẫu củ 43 Bảng 3.22: Kết quả phân tích một số mẫu rau củ 44 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình Trang Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon của anthocyanin 4 Hình 1.2: Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH 5 Hình 1.3: Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 13 Hình 3.1: Phổ hấp thụ của delphinidin 22 Hình 3.2: Phổ hấp thụ của cyanidin 23 Hình 3.3: Phổ hấp thụ của pelargonidin 23 Hình 3.4: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 3 chất với chương trình gradient 1 25 Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch dung dịch 3 chất chuẩn với chương trình gradient 2 (trên) và mẫu thực rau (dưới) 26 Hình 3.6: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 3 chất với chương trình gradient 3 26 Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 3 chất với chương trình gradient 4 27 Hình 3.8: Hàm lượng các chất khi thủy phân trong thời gian khác nhau (60, 90, 120, 150 phút) 29 Hình 3.9: Hàm lượng các chất tại nhiệt độ thủy phân khác nhau 30 Hình 3.10: Hàm lượng các chất theo phần trăm HCl 2N trong dung môi chiết mẫu 31 Hình 3.11: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 33 Hình 3.12: Sắc ký đồ của mẫu rau không chứa anthocyanin 34 Hình 3.13: Sắc ký đồ của mẫu rau không chứa anthocyanin được thêm chuẩn hỗn hợp 34 Hình 3.14: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ delphinidin 35 Hình 3.15: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ cyanidin 36 Hình 3.16: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ pelargonidin 37 [...]... Xác định một số hợp chất nhóm Anthocyanin trong rau củ bằng phương pháp HPLC Với các mục tiêu sau đây: 2 1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định một số hợp chất nhóm anthocyanin trong rau củ bằng phương pháp HPLC 2 Áp dụng quy trình kỹ thuật đã xây dựng để phân tích một số mẫu rau củ trên thị trường 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ANTHOCYANIN 1.1 Giới thiệu Các Anthocyanin thuộc một trong những nhóm. .. giới đã có rất nhiều quy trình xác định hàm lượng tổng Anthocyanin hay hoạt chất nhóm Anthocyanin bằng các kỹ thuật như: HPLC, UV-VIS, HPTLC, LC-MS [21], [15], [27] Tại Việt Nam cũng có nhiều nghiên cứu xác định hàm lượng Anthocyanin trong thực phẩm hay thực phẩm chức năng [3], [4], [6] Tuy nhiên thì việc xác định từng hoạt chất trong nhóm Anthocyanin trong thực phẩm rau củ thì rất ít Xuất phát từ thực... loài khoai lang tím (Ipomoea batatas (L.) Poir.) 0,46 7 Vỏ của loài nho (Vitis vinifera L.) 1,27 8 Lá của loài mơ leo (Paederia scandens (Lour.) Merr.) 1,05 9 Lá của loài rau dền tía (Amaranthucs tricolor L.) 1,74 1.6 Một số phương pháp phân tích Anthocyanin Bảng 1.3: Một số phương pháp phân tích anthocyanin Stt 1 2 3 Kỹ thuật phân tích HPLC HPLC HPLCPDAMS/MS Mẫu phân tích Điều kiện phân tích - Cột: C18... gian tM của chất không lưu giữ (tốc độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động) Thời gian lưu hiệu chỉnh: tR’ = tR – tM Hệ số phân bố K: K= CS CM CS, CM: Nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh, pha động K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Các chất trong hỗn hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn Hệ số dung... thể tích của pha tĩnh, pha động k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất 2 pha vào hệ số VS/VM Thông thường chọn k’ = 1 – 5 Hệ số chọn lọc α: Hệ số chọn lọc α đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B: α= K B k ' B t R B  t M   K A k ' A t R  A  t M KB, KA lần lượt là hệ số phân bố của chất B, A (A là chất ra trước) k’A, k’B tương ứng là hệ số dung lượng của chất A, B... −OH −OCH3 −OH −OH −H −OH Các aglycon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí R1 và R2, thường là H, OH hoặc OCH3 [3] 1.3 Tính chất của anthocyanin Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực [3] 5 Anthocyanin hòa tan tốt trong H2O, C2H5OH, CH3OH, …, trong đó khả năng tan trong CH3OH – HCl và C2H5OH – HCl là... phận lưu trữ dữ liệu của các thiết bị HPLC hiện nay thường là các máy vi tính hiện đại có khả năng ghi nhận, lưu giữ, biên tập, xử lý các thông tin hết sức hiệu quả 17 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng của Anthocyanin trong thực phẩm rau củ Đối tượng mẫu phân tích là anthocyanin và đối... phần dải bức xạ tương ứng với một khoảng bước sóng hẹp Qua đó, toàn bộ phổ UV-Vis theo thời gian lưu sẽ được ghi lại Ưu điểm của detector này là tạo được phổ UV của các chất phân tích trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và định danh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc ký với phổ của một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết trước [1],... Pelargonidin, Peonidin, Cyanidin, Malvidin, Petunidin và Delphinidin [25] Trong bài báo cáo này chúng tôi tiến hành xác định Pelargonidin, Cyanidin, Delphinidin trong thực phẩm rau củ 4 R1 OH B + OH O 3 7 5 R2 3 A OH OH Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon của anthocyanin Bảng 1.1: Cấu trúc của 6 chất phổ biến nhất trong nhóm anthocyanin Cấu trúc cơ bản Anthocyanidin R3′ R4′ R5′ R3 R5 R6 R7 Cyanidin... 800C trong 150 phút - Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút - Gạn lấy phần dịch trong, định mức 50 mL bằng cùng dung môi và lọc qua màng lọc 0,45 µm 21 - Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha loãng nếu cần) 2.3.3 Thẩm định quy trình Phương pháp xử lý mẫu và điều kiện phân tích Anthocyanin bằng HPLC được thẩm định về các tiêu chí: - Tính chọn lọc, đặc hiệu - Độ lặp lại hệ thống - Khoảng tuyến tính - Độ lặp lại phương . tài: Xác định một số hợp chất nhóm Anthocyanin trong rau củ bằng phương pháp HPLC Với các mục tiêu sau đây: 2 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định một số hợp chất nhóm anthocyanin. DƯỢC HÀ NỘI LÊ VIỆT NGÂN XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT NHÓM ANTHOCYANIN TRONG RAU CỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng. dụng phương pháp xác định Anthocyanin trong một số thực phẩm rau củ 44 3.5. Bàn luận 44 3.5.1. Lựa chọn phương pháp 44 3.5.2. Điều kiện xử lý mẫu 45 3.5.3. Xây dựng phương pháp định