BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VÕ THỊ VIỆT TRINH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CARBAMAZEPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VÕ THỊ VIỆT TRINH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CARBAMAZEPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS: Phan Thị Phương Dung 2. ThS: Tạ Mạnh Hùng Nơi thực hiện: Trung tâm đánh giá tương đương sinh học - Viện kiểm nghiệm thuốc TW HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện khóa luận với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình tới những người đã quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Trước tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn TS. Phan Thị Phương Dung, ThS. Tạ Mạnh Hùng và Th.S Trần Lan Hương là những người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn tôi từng ngày trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị tại Trung tâm đánh giá tương đương sinh học – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã tận tâm dạy dỗ, trang bị cho tôi các kiến thức và kỹ năng trong học tập, nghiên cứu suốt 5 năm qua. Chân thành cảm ơn những người anh chị em cùng những người bạn của tôi đã luôn sát cánh, quan tâm, giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn khi thực hiện đề tài để tôi có thể đi đến ngày hôm nay. Cuối cùng, với tất cả tình yêu thương, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất dành cho gia đình của tôi - những người thân yêu đã luôn tin tưởng, động viên và chăm sóc tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Võ Thị Việt Trinh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về carbamazepin (CBZ) 2 1.1.1. Công thức cấu tạo và đặc điểm hóa lý 2 1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng 2 1.1.3. Dược động học 3 1.1.4. Chỉ định và chống chỉ định 4 1.1.5. Một số chế phẩm trên thị trường 4 1.1.6. Một số phương pháp định lượng CBZ trong dịch sinh học bằng HPLC 5 1.2. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 8 1.2.1. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao 8 1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC 8 1.2.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký 9 1.2.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 11 1.2.5. Phương pháp định lượng bằng HPLC 14 1.3. Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học 15 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 19 2.2. Nội dung nghiên cứu 20 2.3. Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1. Chuẩn bị mẫu trong nghiên cứu 21 2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích 22 2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích 23 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng CBZ trong huyết tương 27 3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và nội chuẩn 27 3.1.2. Khảo sát và tìm điều kiện xử lý mẫu có CBZ 31 3.1.3. Qui trình phân tích CBZ trong huyết tương 33 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 33 3.2.1. Tính chọn lọc-đặc hiệu 33 3.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 35 3.2.3. Giới hạn định lượng dưới 36 3.2.4. Độ đúng – độ lặp lại trong ngày và khác ngày 37 3.2.5. Tỷ lệ thu hồi của phương pháp 38 3.2.6. Độ ổn định của mẫu huyết tương 41 3.3. Bàn luận 41 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CBZ : Carbamazepin CBZ-E : Carbamazepine 10, 11- epoxide CV : Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation) HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ cao (High Quality Control Sample) HT : Huyết tương IS : Nội chuẩn (Internal Standard) LLOQ : Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit Of Quantification) LQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ thấp (Lower Quality Control Sample) MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol MQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ trung bình (Middle Quality Control Sample) P.A : Tinh khiết phân tích (pure analysis) QC : Mẫu kiểm soát chất lượng (Quality Control Sample) SKĐ : Sắc ký đồ SPE : Chiết pha rắn (Solid-phase extration) US-FDA : Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (The United States Food and Drug Administration) UV-VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet - Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1.1 Các chế phẩm carbamazepin trên thị trường 5 1.2 Một số nghiên cứu định lượng carbamazepin trong dịch sinh học 6 2.1 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 19 2.2 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu 20 2.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 20 2.4 Các mẫu huyết tương trắng trong nghiên cứu 20 2.5 Chuẩn bị đường chuẩn 22 2.6 Chuẩn bị mẫu kiểm tra 22 2.7 Chuẩn bị mẫu kiểm tra xác định độ đúng 24 3.1 Kết quả xác định ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời gian lưu của carbamazepin và nội chuẩn 35 3.2 Kết quả thẩm định đường chuẩn 35 3.3 Kết quả thẩm định giới hạn định lượng dưới 36 3.4 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày 37 3.5 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại giữa các ngày 38 3.6 Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi nội chuẩn 39 3.7 Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi carbamazepin 40 3.8 Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn nội trong thời gian ngắn 41 3.9 Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn carbamazepin gốc dài ngày 41 3.10 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông–rã 42 3.11 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn 43 3.12 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở thời gian dài ở nồng độ thấp 44 3.13 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở thời gian dài ở nồng độ cao 44 3.14 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu sau xử lý 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Nội dung Trang 1.1 Cấu trúc cột LC-DB 12 1.2 Cấu trúc cột có gốc isopropyl 13 3.1 Phổ hấp thụ UV – VIS của carbamazepin 27 3.2 Sắc ký đồ khảo sát trimetazidin làm nội chuẩn 28 3.3 Sắc ký đồ khảo sát olanzapin làm nội chuẩn 28 3.4 Sắc ký đồ khảo sát acid fenofibric làm nội chuẩn 28 3.5 Sắc ký đồ khảo sát propylparaben làm nội chuẩn 28 3.6 Sắc ký đồ của carbamazepin và nội chuẩn trong pha động MeOH : đệm phosphat pH 7,0 (60:40) và tốc độ dòng 1,0 mL/phút 30 3.7 Sắc ký đồ của carbamazepin và nội chuẩn trong pha động MeOH : đệm phosphat pH 7,0 (58:42) và tốc độ dòng 1,0 mL/phút 30 3.8 Sắc ký đồ của carbamazepin và nội chuẩn trong pha động MeOH : đệm phosphat pH 7,0 (58:42) và tốc độ dòng 1,3ml/phút 30 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn carbamazepin và nội chuẩn với quy trình xử lý mẫu được chọn 32 3.10 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng thẩm định độ chọn lọc 34 3.11 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn carbamazepin (nồng độ 0,1µg/mL) và nội chuẩn 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh động kinh được định nghĩa là sự rối loạn từng cơn chức năng của thần kinh trung ương do sự phóng điện đột ngột, quá mức, đồng thời của các neuron. Bệnh xuất hiện ở tất cả mọi nơi trên thế giới và có thể ở mọi lứa tuổi. Trong số các bệnh nhân động kinh, khoảng 50% trẻ em có vấn đề khó khăn về nhận thức, 6% bệnh nhân có bất thường về vận động, 6% rối loạn tâm thần nặng, 1/15 bệnh nhân phụ thuộc vào người khác cho các công việc hằng ngày vì lý do bệnh động kinh và mức độ tàn phế liên quan đến nó. Trên thế giới người mắc bệnh động kinh chiếm khoảng 0,5% dân số và tại Việt Nam khoảng 2% dân số bị động kinh trong đó gần 60% số bệnh nhân là trẻ em [1], [20], [26]. Carbamazepin là một dẫn xuất của iminostiben, được xem là một trong những thuốc cơ bản hàng đầu để điều trị bệnh động kinh, đặc biệt là động kinh cục bộ và động kinh thể co cứng giật rung. Tuy nhiên khoảng điều trị của carbamazepin hẹp, cơ chế tác dụng phức tạp, nhiều tương tác, tương kỵ và có nhiều trường hợp bệnh nhân ngộ độc thuốc. Hơn nữa trong thực tế điều trị, tính cá thể thường thể hiện rất rõ và phức tạp. Do đó việc nghiên cứu về sinh khả dụng, dược động học, dược lâm sàng của các chế phẩm carbamazepin, đặc biệt kiểm soát nồng độ carbamazepin trong huyết tương bệnh nhân để điều chỉnh liều cho phù hợp với từng cá thể là hết sức cần thiết. Tại Việt Nam, năm 2010, Bộ Y Tế đã quy định các thuốc chứa hoạt chất carbamazepin phải có báo cáo, số liệu đánh giá tương đương sinh học invivo mới được cấp phép đăng ký và lưu hành trên thị trường Việt Nam [7]. Với mong muốn xây dựng phương pháp xác định nồng độ carbamazepin trong huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị và đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm chứa hoạt chất carbamazepin, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 2 mục tiêu: 1. Khảo sát, xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA. 2. Thẩm định phương pháp xây dựng theo qui định của US-FDA. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CARBAMAZEPIN (CBZ) 1.1.1. Công thức cấu tạo và đặc điểm hóa lý 1.1.1.1. Công thức cấu tạo - Công thức phân tử: C 15 H 12 N 2 O. - M=236,27g/mol. - Tên khoa học: 5H-Dibenz[b,f]azepine-5-carboxamide [10], [21]. 1.1.1.2. Đặc điểm hóa lý - Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng. - Rất khó tan trong nước và ether, hơi tan trong aceton và ethanol (96%), dễ tan trong dicloromethan, methylen clorid, chloroform. - Nhiệt độ nóng chảy: 189-193 ° C [3], [5], [10], [14]. 1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng Carbamazepin là một hợp chất iminostilben - nhóm cấu trúc dibenzazepine, là một trong những thuốc cơ bản trong điều trị động kinh cục bộ và động kinh co cứng-giật rung. CBZ làm ổn định tình trạng quá kích thích tại màng thần kinh, kìm hãm sự phóng lặp lại các xung thần kinh, giảm sự dẫn truyền synap của các xung kích thích. Sự ức chế cảm ứng điện dòng Na + có thể là cơ chế hoạt động chính của CBZ, nhờ đó CBZ có thể ức chế sự chuyển vận catecholamin, quá trình giải phóng glutamate [2], [4], [23]. Tác dụng chống co giật của CBZ đặc biệt hiệu quả ở các bệnh nhân động kinh cục bộ phức hợp tuy nhiên không hiệu quả trong động kinh cơn vắng. CBZ làm tăng [...]... [12], [13] Tuy nhiên, phương pháp định lượng bằng HPLC vẫn 6 được nhiều nghiên cứu sử dụng nhất do có nhiều ưu điểm Một số phương pháp định lượng CBZ trong huyết tương bằng HPLC được trình bày ở bảng 1.2 Bảng 1.2 Một số nghiên cứu định lượng CBZ trong dịch sinh học TT/ Tài Mẫu liệu 1 [15] Huyết tương người Điều kiện sắc ký Xử lý IS mẫu Chiết 5 (p- lỏng- lỏng metylphenyl) -5- bằng phenylhydantoin chlorofom... ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của phương pháp phân tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm nghiệm của Việt Nam We used a Model Conn 06856) high-pressure liquid 601 (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, 8 1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa... tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu QC Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được với giá trị thực có trong mẫu 2.3.3.5 Độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày Chuẩn bị các lô mẫu QC tương tự như ở mục xác định độ đúng Xác định kết quả định lượng các mẫu QC theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng, tiến hành trong cùng điều kiện Xác định độ... cột sắc ký - Lựa chọn pha động - Lựa chọn tốc độ dòng Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector PDA 2.3.2.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lí mẫu, chiết tách CBZ từ huyết tương trên các mẫu chuẩn CBZ hòa tan trong. .. soát 4 5 Viên nang giải phóng chậm Hỗn dịch uống Carbatol Carbamazepin suspension 100mg 200mg 200mg 300mg Novartis Shire US 100mg/5ml Alpharma 1.1.6 Một số phương pháp định lượng CBZ trong dịch sinh học bằng HPLC Hiện nay, định lượng CBZ nguyên liệu có thể sử dụng phương pháp đo quang hoặc phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Định lượng CBZ trong dịch sinh học có thể sử dụng nhiều phương pháp khác... -35oC ± 5oC 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng Carbamazepin trong huyết tương bằng HPLC - Quy trình chiết tách CBZ: Dựa trên các nguyên lý chiết tách (chiết lỏng – lỏng, tủa loại protein bằng dung môi hoặc acid), khảo sát trên các mẫu huyết tương tự tạo chứa CBZ để lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp 21 - Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp điều kiện phòng thí... CBZ khỏi các thành phần tạp có trong mẫu, cho phép xác định được lượng CBZ trong mẫu với độ đúng độ chính xác đáp ứng các quy định của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học [19], [21] 2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích Thẩm định phương pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát, theo 6 chỉ tiêu: tính đặc hiệu/ chọn lọc, đường chuẩn và khoảng... đó xác định lại độ đúng so với giá trị thực của từng nồng độ 2.3.3.3 Giới hạn định lượng dưới Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn CBZ ở nồng độ khoảng 0,1 µg/mL Dựa theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu LLOQ Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được với giá trị thực có trong mẫu Xác định độ chính xác bằng cách... pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình 1.2.5.2 Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký: phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn, phương... 2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 2.3.3.1 Tính đặc hiệu - chọn lọc Chỉ tiêu độ đặc hiệu – chọn lọc được quy định tại mục 1.3.2.1 Tiến hành phân tích sắc ký các mẫu: - Huyết tương trắng với ít nhất 6 mẫu có nguồn gốc khác nhau - Huyết tương trắng có pha chuẩn nội - Huyết tương trắng có pha chuẩn CBZ ở nồng độ 0,1 µg/mL và IS So sánh các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên 2.3.3.2 Đường . Nghiên cứu định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với 2 mục tiêu: 1. Khảo sát, xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng. 8 1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở. 1.1.6. Một số phương pháp định lượng CBZ trong dịch sinh học bằng HPLC 5 1.2. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 8 1.2.1. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao 8 1.2.2. Nguyên