BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN GIANG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP LIOTHYRONIN TỪ L-TYROSIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN GIANG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP LIOTHYRONIN TỪ L-TYROSIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2013 CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ MÃ SỐ: 60720402 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện 2. ThS. Nguyễn Thị Ngọc Hà LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện, người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành được luận văn này. Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Văn Hân, ThS. Nguyễn Thị Ngọc Hà và toàn thể các thầy cô, anh chị Bộ môn Công nghiệp dược, những người luôn động viên và giúp đỡ tôi rất nhiệt tình trong suốt thời gian qua. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt luận văn này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người luôn động viên, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2013 Học viên Nguyễn Văn Giang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về các hormon tuyến giáp 2 1.1.1. Một số đặc điểm giải phẫu sinh lý tuyến giáp 2 1.1.2. Một số bệnh về tuyến giáp 3 1.2. Tổng quan về liothyronin mononatri 4 1.2.1. Cấu trúc và tính chất 4 1.2.2. Tác dụng dược lý và chỉ định 5 1.2.3. Phương pháp tổng hợp liothyronin 8 Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Thiết bị, dụng cụ, nguyên liệu, hoá chất 21 2.1.1. Thiết bị 21 2.1.2. Dụng cụ 22 2.1.3. Nguyên liệu và hoá chất 22 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.2.1. Tổng hợp hóa học 23 2.2.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết và tinh chế sản phẩm 23 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc 24 2.2.4. Kiểm nghiệm liothyronin mononatri theo tiêu chuẩn USP 34 24 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1. Tổng hợp hóa học 25 3.1.1. Tổng hợp 3,5-dinitro-L-tyrosin (3a) 25 3.1.2. Tổng hợp 3,5-dinitro-N-acetyl-L-tyrosin (3b) 26 3.1.3. Tổng hợp 3,5-dinitro-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester (3c) 27 3.1.4. Tổng hợp 3,5-dinitro-4-p-methoxyphenoxy-N-acetyl-L- phenylalanin ethyl ester (25) (phản ứng tạo diaryl ether). 29 3.1.5. Tổng hợp 3,5-diamino-4-p-methoxyphenoxy-N-acetyl-L-phenyl alanin ethyl ester (26) 31 3.1.6. Tổng hợp 3,5-diiodo-4-p-methoxyphenoxy-N-acetyl-L-phenyl alanin ethyl ester (24). 33 3.1.7. Tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin 37 3.1.8. Tổng hợp 3,5,3‟-triiodo-L-thyronin mononatri 39 3.1.9. Kiểm nghiệm liothyronin mononatri theo tiêu chuẩn USP 34 41 Chƣơng 4. BÀN LUẬN 42 4.1. Về các phản ứng tổng hợp hóa học 43 4.1.1. Về quá trình tổng hợp 3,5-dinitro-L-tyrosin 43 4.1.2. Về phản ứng N-acetyl hóa 3,5-dinitro-L-tyrosin 44 4.1.3. Về phản ứng tạo ethyl ester từ 3,5-dinitro-N-acetyl-L-tyrosin 44 4.1.4. Vế phản ứng tạo cầu nối diaryl ether 45 4.1.5. Về quá trình khử hóa tạo hợp chất diamin 46 4.1.6. Về quá trình diazo hóa và iodo hóa trong cùng một giai đoạn 46 4.1.7. Về phản ứng thủy phân và demethyl hóa tạo 3,5-diiodo-L- thyronin 47 4.1.8. Về quá trình tạo liothyronin 47 4.2. Về cấu trúc của chất trung gian và sản phẩm tổng hợp đƣợc 48 4.2.1. Phổ hồng ngoại 48 4.2.2. Phổ khối lượng 49 4.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 KẾT LUẬN 52 KIẾN NGHỊ 53 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẲT VÀ KÍ HIỆU 13 C-NMR : Carbon Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy ( Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon) 1 H-NMR : Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy ( Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) Ac : Acetyl DIT : 3,5-Diiodotyrosin Et : Ethyl HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc kí lỏng hiệu năng cao) IR : Infrared Spectroscopy (phổ hồng ngoại) Me : Methyl MIT : Monoiodotyrosin MS : Mass Spectroscopy (phổ khối lượng) NXB : Nhà xuất bản SKLM : Sắc kí lớp mỏng T 2 : 3,5-diiodo-L-thyronin T 3 : 3,5,3‟-triiodo-L-thyronin T 4 : 3,5,3‟,5‟-tetraiodo-L-thyronin TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng) TRH : Thyrotropin Releasing Hormone (Hormon giải phóng thyrotropin) Ts : p-Toluen sulfonyl TSH : Thyroid Stimulating Hormone (Hormon kích thích tuyến giáp) USP : The United State Pharmacopeia (Dược điển Mỹ) DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1: Chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu liothyronin mononatri trong USP 34 5 Bảng 2.1: Nguyên vật liệu và thuốc thử 22 Bảng 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng khử 32 Bảng 3.2: Kết quả khử hóa sử dụng dung môi EtOH 96% 32 Bảng Bảng 3.3: Kết quả diazo hóa và diiodo hóa diamin (26) 37 Bảng 3.4: Tiêu chuẩn kiểm nghiệm liothyronin mononatri theo USP 34 41 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Tên sơ đồ Trang Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp liothyronin mononatri từ 3,5- diiodo-L-thyronin 9 Sơ đồ 1.2: Quá trình tạo muối liothyronin mononatri 9 Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp liothyronin từ 3,5-diiodo-L-tyrosin 10 Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin theo phương pháp của C. R. Harington 11 Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin theo phương pháp của A. David 12 Sơ đồ 1.6: Quá trình tổng hợp 3,5-diiodo-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester 13 Sơ đồ 1.7: Quá trình tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin theo phương pháp của W. Siedel 14 Sơ đồ 1.8: Quá trình tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin theo phương pháp của Gunther Hillman 15 Sơ đồ 1.9: Quá trình tổng hợp muối 4,4‟-dimethoxy diphenyliodonium bromid 15 Sơ đồ 1.10: Quá trình tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin theo phương pháp của J.K. Chalmer 18 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lý tuyến giáp rất đa dạng, trong đó thiểu năng tuyến giáp là tình trạng bệnh phổ biến. Suy giáp có thể gặp ở nhiều lứa tuổi, người ta ước tính có khoảng 3-5% dân số bị suy giáp. Ở người lớn, tuổi được chẩn đoán suy giáp tập trung ở độ tuổi 40-60, hay gặp ở phụ nữ. Nguyên nhân thường do thiếu hụt hormon tuyến giáp levothyroxin (T 4 ) và liothyronin (T 3 ) [1]. Để điều trị suy giáp, việc cung cấp các hormon tuyến giáp là cần thiết. Levothyroxin là hormon thường lựa chọn sử dụng, nhưng liothyronin lại đặc biệt quan trọng trong những trường hợp cần tác dụng nhanh như hôn mê do suy giáp hay điều trị ung thư tuyến giáp. Ngày nay, liothyronin trên thị trường chủ yếu có nguồn gốc tổng hợp. So với bột giáp đông khô được sản xuất từ tuyến giáp động vật, liothyronin có hoạt tính mạnh, hiệu quả điều trị cao, ít gây dị ứng. Ngoài ra, liothyronin còn được sử dụng với liều điều trị rất thấp, phân liều chính xác, ít bị nấm mốc [37]. Nguyên liệu cho tổng hợp liothyronin là L-tyrosin thu được từ dịch thủy phân sừng, lông, móng gia súc, là nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước. Đề tài “Nghiên cứu tổng hợp levothyroxin và liothyronin làm thuốc điều trị bướu cổ” đã được Bộ Y Tế chọn là nhiệm vụ khoa học công nghệ năm 2013-2014 và giao cho Bộ môn Công nghiệp dược thực hiện nhiệm vụ này. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp liothyronin từ L-tyrosin” góp phần thực hiện nhiệm vụ khoa học công nghệ của Bộ Y Tế. Đề tài được thực hiện với hai mục tiêu: 1. Xây dựng được quy trình tổng hợp liothyronin mononatri từ L-tyrosin ở quy mô phòng thí nghiệm. 2. Tổng hợp được 10,0 g liothyronin mononatri đạt tiêu chuẩn USP 34. 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về các hormon tuyến giáp 1.1.1. Một số đặc điểm giải phẫu sinh lý tuyến giáp 1.1.1.1. Giải phẫu Tuyến giáp là một tuyến nội tiết nằm trước sụn giáp, có 2 thùy và một eo ở giữa. Tuyến giáp nằm trong bao giáp nhưng gắn với sụn giáp nên khi nuốt tuyến giáp di động theo thanh quản. Trọng lượng tuyến khoảng 20-30 g. Tuyến giáp được cấp máu bởi các nhánh động mạch, tĩnh mạch giáp trên và dưới, lượng máu cấp cho mỗi gam tuyến giáp là 4-6 ml/phút. Tuyến giáp được cấu tạo bởi các nang tuyến, trong lòng nang có đầy chất keo với thành phần chủ yếu là thyroglobulin do tế bào nang tiết ra. Hormon tuyến giáp được tổng hợp tại các tế bào nang, sau đó dự trữ tại các tế bào nang dưới dạng liên kết với thyroglobulin trong lòng nang giáp [1]. 1.1.1.2. Sinh tổng hợp hormon tuyến giáp Hormon tuyến giáp được tổng hợp tại tế bào nang giáp, quá trình này gồm 4 giai đoạn - Quá trình bắt iod: iod của thức ăn được hấp thu vào máu, từ máu iod vào tế bào tuyến giáp bằng cơ chế vận chuyển tích cực do màng đáy tế bào nang giáp có khả năng bơm iod vào trong tế bào. Do đó, nồng độ iod trong tế bào tuyến giáp cao gấp 30 lần nồng độ trong máu. - Oxy hóa ion iodid thành dạng oxy hóa của iod nguyên tử nhờ peroxydase, iod nguyên tử có khả năng gắn trực tiếp với tyrosin. - Gắn iod nguyên tử vào tyrosin để tạo monoiodotyrosin (MIT) và diiodotyrosin (DIT). - Trùng hợp MIT và DIT để tạo T 3 và T 4 . Sau khi tạo thành, T 3 và T 4 được gắn với thyroglobulin, rồi được vận chuyển qua màng đỉnh của tế bào nang giáp vào trong lòng nang để dự trữ. [...]... pháp tổng hợp liothyronin và các nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy  Phương pháp tổng hợp liothyronin đi từ nguyên liệu ban đầu l Ltyrosin có nhiều ưu điểm Thứ nhất: Đây l nguyên liệu có thể sản xuất với giá thành rẻ ở trong nước từ các phế, phụ phẩm: sừng, l ng, móng gia súc Thứ hai: Quá trình tổng hợp từ nguyên liệu L- tyrosin không phải qua giai đoạn tách hỗn hợp đồng phân racemic Sản phẩm liothyronin. .. Nguyễn Đình Luyện và cộng sự năm 2010 đã nghiên cứu tổng hợp liothyronin theo phương pháp này [10] Nhưng cũng như phân tích ở trên phương này khó triển khai để tổng hợp liothyronin ở quy mô l n hơn 16 e) Phương pháp của J.K Chalmer và cộng sự năm 1949 Quy trình tổng hợp T2 qua các giai đoạn như sau: Nguyên liệu L- tyrosin được nitro hóa bằng HNO3 68% trong acid sulfuric đặc thu được 3,5-dinitroL-tyrosin... với dung dịch Na2CO3 bão hòa Quá trình này thu được liothyronin mononatri có hàm l ợng 99,1%, [α]D20= +21,5° [47] Sơ đồ 1.2: Quá trình tạo muối liothyronin mononatri 9 Ngoài ra M Grzegorz và cộng sự đã đưa ra quy trình để tổng hợp liothyronin như sau Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp liothyronin từ 3,5-diiodo -L- tyrosin Oxy hóa alcol 3-iodo-4-hydroxybenzylic bằng NaBiO3 thu được 5-iodo1-oxaspiro[2.5]octa-4,7-dien-6-on... 100ml, 250ml - Bình chiết các loại: 50ml, 100ml 250ml, 500ml - Cốc có mỏ, ống đong, pipet, ống nghiệm, đĩa petri, đũa thuỷ tinh, phễu l c, sinh hàn, cánh khuấy,… - Bình phản ứng loại 1 l t, 2 l t, 6 l t, 10 l t 2.1.3 Nguyên liệu và hoá chất Bảng 2.1: Nguyên vật liệu và thuốc thử Tên hoá chất và thuốc thử Nguồn gốc L- Tyrosin Việt Nam Acid acetic băng Merck Anhydrid acetic Merck Acid p-toluen sulphonic... điển Mỹ 2012 qui định hàm l ợng liothyronin mononatri phải đạt từ 95,0 đến 101,0%, tính theo chế phẩm đã l m khô (phương pháp HPLC) 24 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Tổng hợp hóa học 3.1.1 Tổng hợp 3,5-dinitro -L- tyrosin (3a) Theo Chalmaer và cộng sự [17]: O O OH HNO3 /H 2SO 4 O2 N NH 2 HO OH NH 2 HO NO2 Cho vào bình cầu dung tích 6 l t 2,25 l t dung dịch H2SO4 95-98% L m l nh dung dịch này xuống khoảng... 3,5-dinitro-N-acetyl -L- tyrosin ethyl ester (3c) O O O2 N O2 N OH NHAc HO OEt EtOH/TsOH NHAc HO SOCl2 NO2 NO2 Chúng tôi khảo sát với 2 xúc tác TsOH và SOCl2 3.1.3.1 Xúc tác TsOH Theo Chalmaer và cộng sự [17]: Cho vào bình cầu dung tích 500 ml 8,0 g (25,5 mmol) 3,5-dinitro-Nacetyl -L- tyrosin, 0,75 g (4,35mmol) TsOH, 10 ml EtOH (khoảng 171,5mmol), 250 ml CHCl3 Hỗn hợp phản ứng sau đó được hồi l u trong 8h thu... thích hợp (NH3, methylamin, ethylamin hoặc các amin bậc 2…) hoặc sử dụng tác nhân iodo hóa l Niodoacetamid trong methanol khan thu được liothyronin 2 dưới dạng base, sau đó xử l với dung dịch NaOH 50% hoặc dung dịch bão hòa Na2CO3 thu được liothyronin natri 3 Hiệu suất tổng hợp liothyronin từ 1 thay đổi từ 50-95% [18], [21], [22], [32], [33], [35], [36], [38], [40] Quá trình phản ứng trên thì liothyronin. .. có thời gian l u tương ứng với thời gian l u của dung dịch liothyronin chuẩn Góc quay cực +18 đến +220 (C=20mg/ml (hỗn hợp EtOH: dd HCl 1,2M = 4:1) Mất khối l ợng Không quá 4,0% do l m khô Giới hạn Không quá 5,0% levothyroxin natri (Phương pháp HPLC) Định l ợng Hàm l ợng liothyronin natri trong chế phẩm phải từ (Phương pháp 95,0% đến 101,0% tính theo chế phẩm khô HPLC) 1.2.2 Tác dụng dược l và chỉ định... chủ yếu l các hóa chất thông dụng Ngoài ra, các phương pháp tổng hợp hormon giáp trạng chủ yếu tập trung vào quá trình tạo cầu nối diaryl ether Phương pháp đi qua hợp chất nitro cho hiệu suất quá trình này cao (89% theo IT 1302201 B1), các hợp chất sử dụng trong quá trình này tương đối dễ tổng hợp đi từ nguồn nguyên liệu sẵn có Chính vì vậy chúng tôi l a chọn quy trình tổng hợp liothyronin từ Ltyrosin... học Các phương pháp tổng hợp liothyronin chủ yếu đi qua hợp chất trung gian 3,5-diiodo -L- thyronin (T2) Sơ đồ tổng hợp: 8 I HO I NH2 O 1 I 2 /KI (1:1), Base HO COOH CH 3-CO-NH-I I I HO I NH2 O 2 COONa I COOH I NaOH Na2 CO3 NH2 O I 3 Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp liothyronin mononatri từ 3,5-diiodo -L- thyronin Từ 3,5-diodo -L- thyronin 1 thực hiện phản ứng monoiodo hóa với cùng đương l ợng tác nhân KI3 trong . Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1. Tổng hợp hóa học 25 3.1.1. Tổng hợp 3,5-dinitro-L-tyrosin (3a) 25 3.1.2. Tổng hợp 3,5-dinitro-N-acetyl-L-tyrosin (3b) 26 3.1.3. Tổng hợp 3,5-dinitro-N-acetyl-L-tyrosin. phương pháp tổng hợp hóa học [37]. 1.2.3.2. Phương pháp tổng hợp hóa học Các phương pháp tổng hợp liothyronin chủ yếu đi qua hợp chất trung gian 3,5-diiodo-L-thyronin (T 2 ). Sơ đồ tổng hợp: 9. tài: Nghiên cứu tổng hợp liothyronin từ L-tyrosin” góp phần thực hiện nhiệm vụ khoa học công nghệ của Bộ Y Tế. Đề tài được thực hiện với hai mục tiêu: 1. Xây dựng được quy trình tổng hợp liothyronin