BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ PHƢƠNG DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH (ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG) BIFIDOBACTERIUM LONGUM TRONG CÁC CHẾ PHẨM PROBIOTICS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ PHƢƠNG DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH (ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG) BIFIDOBACTERIUM LONGUM TRONG CÁC CHẾ PHẨM PROBIOTICS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ 60 72 04 10 Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Việt Hùng HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Luận văn này được hoàn thành tại khoa Vi Sinh – Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương – Bộ Y tế. Để có được bản luận văn tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Việt Hùng, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt tôi trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu này. Xin chân thành cám ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc chất và các Bộ môn khác của trường Đại Học Dược Hà Nội đã giúp tôi trang bị tri thức, tạo môi trường, điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đoàn Cao Sơn – Viện trưởng Viện kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương, Ban Giám Đốc Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương, các đồng nghiệp trong khoa và Th s. Khổng Thị Minh Huệ đã hỗ trợ, giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ và hoàn thành khóa học theo đúng thời hạn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã luôn ở bên tôi động viên, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua Hà Nội 27 tháng 8 năm 2014 Dược sỹ Trịnh Thị Phương Dung MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTICS 3 1.1.1. Định nghĩa 3 1.1.2. Ứng dụng của probiotics trong ngành Dược 3 1.1.3. Các vi sinh vật thường được sử dụng trong chế phẩm probiotics 4 1.1.4. Tổng quan về tiêu chuẩn chất lượng probiotics 4 1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI BIFIDOBACTERIUM 6 1.2.1. Đặc điểm chung của chi Bifidobacterium [30], [33], 6 1.2.2. Bifidobacteria với vai trò là probiotics. 6 1.3. TỔNG QUAN VỀ B. LONGUM 7 1.3.1. Đặc điểm hình thái 7 1.3.2. Khả năng chuyển hóa carbohydrat [31]. 8 1.3.3. Cấu trúc gen cuả B. longum [24] 8 1.3.4. Vai trò của B. longum [9], [11], [24], [26] , [15], [33], [35]. 9 1.3.5. Phương pháp kiểm nghiệm B. longum trong chế phẩm probiotics 10 1.3.6. Tình hình nghiên cứu định tính và định lượng B. longum trong các chế phẩm probiotics trong những năm gần đây 17 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. PHƢƠNG TIỆN DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 20 2.1.1. Môi trường, hoá chất, dung môi, thiết bị 20 2.1.1.1. Môi trường 20 2.1.1.2. Hoá chất, dung môi 22 2.1.1.3. Thiết bị, dụng cụ 23 2.1.2. Phần mềm xử lý kết quả: Apiweb của hãng BioMérieux. 24 2.1.3. Chủng vi sinh vật chuẩn 24 2.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 25 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1. Phương pháp định lượng B. longum trong chế phẩm 26 2.3.2. Phương pháp định danh vi sinh vật bằng kit API 20A 27 2.3.2.1. Nguyên tắc chung 27 2.3.2.2. Tiến hành 28 2.3.3. Định danh đến loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 31 2.3.3.1. Sơ đồ chung định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 31 2.3.3.2. Tách DNA vi khuẩn bằng WizardR Genomic DNA Purification Kit 32 2.3.3.3. Định lượng DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm (A 260 ) 33 2.3.3.4. Nghiên cứu, thiết kế mồi đặc hiệu 33 2.3.3.5. Kiểm tra khả năng tách DNA 34 2.3.3.6. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR 35 2.3.3.7. Nhân dòng và giải trình tự 36 2.3.4. Thẩm định quy trình đã xây dựng 39 2.3.4.1. Thẩm định phương pháp định lượng B. longum 39 2.3.4.2. Thẩm định qui trình định danh bằng kit API 20A 41 2.3.4.3. Thẩm định qui trình định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 41 2.3.5. Ứng dụng quy trình chuẩn để định lượng và định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics đang lưu hành trên thị trường 44 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 45 3.1. XÁC ĐỊNH SỐ LƢỢNG VI SINH VẬT TRONG CHẾ PHẨM PROBIOTICS 45 3.2. ĐỊNH DANH VI SINH VẬT BẰNG KIT API 20A 46 3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 51 3.3.1. Kết quả tách DNA 51 3.3.1.1 Tách DNA bằng Wizard R Genomic DNA Purification kit của hãng Promega 51 3.3.1.2. Kiểm tra khả năng tách DNA 51 3.3.2. Nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng vi sinh vật thuộc đối tượng nghiên cứu 52 3.3.3. Nhân dòng và giải trình tự 55 3.3.3.1.Tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các vi sinh vật phân lập từ các mẫu nghiên cứu bằng bộ kit Fermentas 55 3.3.3.2. Nhân dòng các đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng và biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α 56 3.3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu trong plasmid tái tổ hợp 57 3.3.3.4. Giải trình tự mẫu chứa phân đoạn 831 bp 60 3.4. ĐÁNH GIÁ PHƢƠNG PHÁP 62 3.4.1. Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trường định lượng BSM agar . 62 3.4.2. Độ lặp lại của phép định lượng 63 3.4.3. Thẩm định độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kit API 20A 64 3.4.4. Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật PCR 65 3.4.5. Xác định ngưỡng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum bằng cặp mồi đặc hiệu. 68 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN 71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 PHỤ LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AA: Acid acetic AL: Acid lactic ATCC: American Type Culture Collection B. longum: Bifidobacterium longum dATP: Deoxy adenosine Triphosphat dCTP: Deoxy cytosineTriphosphat dGTP: Deoxy guanine Triphosphat DNA: Deoxyribo nucleic acid dNTP: Deoxy nucleic Triphosphat dTTP: Deoxy thymin Triphosphat E. coli : Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FISH: fluorescence in situ hydridization JCM: Japan Colletion of Microorganisms LAB: Lactic acid bacteria LB Luria Bertani PCR: Polymerase Chain Reaction rRNA: Ribosome Ribonucleic acid VSV: Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Mồi đặc hiệu 22 Bảng 2.2 Hóa chất, dung môi 22 Bảng 2.3 Các vi sinh vật chuẩn được sử dụng 24 Bảng 2.4 Cách đọc kết quả kit Api 20A 30 Bảng 2.5 Trình tự các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR 34 Bảng 2.6 Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra DNA mới tách 35 Bảng 2.7 Thành phần của phản ứng PCR đơn mồi 36 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector 38 Bảng 2.9 Các chủng chuẩn kiểm tra tính chọn lọc của môi trường BSM agar 40 Bảng 2.10 Công thức tính độ đặc hiệu 42 Bảng 2.11 Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng của sản phẩm PCR 43 Bảng 3.1 Số lượng vi sinh vật trong chế phẩm 45 Bảng 3.2 Theo dõi phản ứng định danh vi sinh vật bằng kit API 20A 48 Bảng 3.3 Kết quả định danh vi sinh vật bằng phần mềm Apiweb 50 Bảng 3.4 Kết quả đo quang các dung dịch DNA mới tách 51 Bảng 3.5 Thành phần của phản ứng PCR 53 Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trường BSM agar 62 Bảng 3.7 Kết quả đếm số lượng vi khuẩn trong mẫu A 64 Bảng 3.8 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi BlonF/BlonR trên 20 chủng 66 Bảng 3.9 Kết quả đếm số lượng vi khuẩn B. longum 68 Bảng 3.10 Kết quả xác định ngưỡng phát hiện 69 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình ảnh B. longum trên kính hiển vi điện tử 8 Hình 1.2 Hình ảnh genom B. longum 8 Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase 14 Hình 1.4 Hình minh họa kỹ thuật PCR 14 Hình 2.1 Sơ đồ định tính B. longum bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 31 Hình 3.1 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu A bằng kit API 20A 46 Hình 3.2 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu B bằng kit API 20A 46 Hình 3.3 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu C bằng kit API 20A 47 Hình 3.4 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu D bằng kit API 20A 47 Hình 3.5 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu E bằng kit API 20A 47 Hình 3.6 Quan sát giếng ESC dưới đèn UV ở bước sóng 365nm 48 Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA bằng cặp mồi ID16R08F và IDL16R09R 52 Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum bằng cặp mồi BlonF/BlonR 54 Hình 3.9 Kết quả điện di mẫu tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu phân lập từ các mẫu nghiên cứu trên gel agarose 1% 55 Hình 3.10 Sơ đồ vector nhân dòng pGEMT-eseay 56 Hình 3.11 Kết quả biến nạp sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. Coli DH5α. và cấy trải trên môi trường nuôi cấy có bổ sung ampicillin 100µg/ml 57 Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang các đoạn gen có kích thước 831bp 58 Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp mang các phân đoạn 831 bp bằng enzym EcoRI 59 Hình 3.14 Hình thái khuẩn lạc B. longum trên môi trường BSM agar 63 Hình 3.15 Định danh B. longum JCM 1217 bằng kit Api 20A 65 Hình 3.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum 67 Hình 3.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định ngưỡng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum 70 [...]... xác định (định tính, định lượng) Bifidobacterium longum trong các chế phẩm probiotics với các mục tiêu: - Xây dựng quy trình chuẩn định tính, định lượng B longum trong các chế phẩm đa thành phần - Ứng dụng quy trình đã thiết lập để khảo sát chất lượng của một số chế phẩm probiotics có chứa B longum đang lưu hành trên thị trường 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ PROBIOTICS 1.1.1 Định nghĩa Hàng... cả các chế phẩm chứa B longum Đa số các tiêu chuẩn cơ sở của các thuốc và thực phẩm chức năng trong nước cũng như nhập khẩu chưa định lượng riêng cũng như chưa định tính được B longum trong các chế phẩm có chứa hỗn hợp nhiều vi sinh vật Xuất phát từ nhu cầu thực tế và tính cấp thiết về yêu cầu kiểm tra chất lượng của các chế phẩm probiotics, chúng tôi tiến hành đề tài: Xây dựng quy trình xác định (định. .. vật trong các chế phẩm probiotics giảm nhiều trong thời gian bảo quản Như vậy, việc định tính, định lượng các loài vi khuẩn probiotics trong các chế phẩm là rất quan trọng, đảm bảo chất lượng của chế phẩm, mang lại hiệu quả cho người dùng Thị trường thuốc Việt Nam hiện có hàng trăm chế phẩm probiotics dưới dạng thuốc và thực phẩm chức năng, trong đó có rất nhiều chế phẩm có chứa Bifidobacterium longum. .. dụng rộng rãi trong các chế phẩm thuốc, thực phẩm chức năng, sữa 9 1.3.5 Phƣơng pháp kiểm nghiệm B longum trong chế phẩm probiotics 1.3.5.1 Phương pháp định lượng vi sinh vật trong chế phẩm [14], [19], [21] a Phương pháp đếm trên đĩa thạch Phương pháp đếm trên đĩa thạch được sử dụng nhiều nhất để định lượng B longum trong chế phẩm Probiotics do có độ chính xác cao, đơn giản, dễ thực hiện ở quy mô phòng... nhiên chưa có nghiên cứu nào về việc định lượng và phân lập riêng B longum trong thuốc và thực phẩm chức năng Việc định lượng chỉ dừng lại ở định lượng hỗn hợp vi sinh vật trong chế phẩm Đồng thời việc định danh B longum cũng chưa được nghiên cứu thấu đáo Trong một số tiêu chuẩn cơ sở của các nhà sản xuất trong nước đã sử dụng kít Api 20A để định danh B longum trong chế phẩm [1], [2] Tuy nhiên, việc sử... longum (B longum là một vi khuẩn thuộc nhóm LAB) dưới dạng đơn hoặc đa thành phần Mặc dù trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu để định tính và định lượng B longum trong các chế phẩm đa thành phần, tuy nhiên ở Việt Nam việc kiểm soát chất lượng của các chế phẩm probiotics còn đang bỏ 1 ngỏ Cụ thể là Việt Nam chưa có một tài liệu chính thức nào hướng dẫn kiểm soát chất lượng các chế phẩm probiotics. .. của cơ thể chủ” [32] Các probiotics thường có trong các chế phẩm là vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) trong đó bao gồm chi Lactobacillus và chi Bifidobacterium, vi khuẩn sinh bào tử Bacillus, nấm Saccharomyces cerevisiae… Theo Robin Temmerman (2001) trong số 55 mẫu khảo sát chỉ có khoảng 20% chế phẩm có chứa vi khuẩn đúng như trên nhãn, 16% chế phẩm không chứa một trong các chủng probiotics được liệt... Một số Bifidobacteria hay được dùng trong các chế phẩm thuốc, thực phẩm chức năng với vai trò là probiotics là Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium breve… 1.3 TỔNG QUAN VỀ B LONGUM 1.3.1 Đặc điểm hình thái B longum thuộc nhóm vi sinh vật sinh acid lactic và thuộc chi Bifidobacterium B longum là vi khuẩn Gram dương, hình que... 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phƣơng pháp định lƣợng B longum trong chế phẩm Sử dụng phương pháp đếm trên đĩa thạch Trên cơ sở tham khảo các công trình nghiên cứu có liên quan, chúng tôi lựa chọn môi trường BSM agar để định lượng B longum trong hỗn hợp [19], [25] Chuẩn bị hỗn dịch thử: Cân và xác định khối lượng trung bình của 20 gói chế phẩm Cân chính xác khoảng 10,0g bột thuốc vào bình nón vô trùng,... cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA 1.3.6 Tình hình nghiên cứu định tính và định lƣợng B longum trong các chế phẩm probiotics trong những năm gần đây - Trên thế giới Phương pháp định lượng B longum phổ biến vẫn là phương pháp đếm trên đĩa thạch Bên cạnh đó các nhà khoa học đã nghiên cứu thêm một số phương pháp mới đó . tài: Xây dựng quy trình xác định (định tính, định lượng) Bifidobacterium longum trong các chế phẩm probiotics với các mục tiêu: - Xây dựng quy trình chuẩn định tính, định lượng B. longum trong. NỘI TRỊNH THỊ PHƢƠNG DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH (ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG) BIFIDOBACTERIUM LONGUM TRONG CÁC CHẾ PHẨM PROBIOTICS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC . NỘI TRỊNH THỊ PHƢƠNG DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH (ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG) BIFIDOBACTERIUM LONGUM TRONG CÁC CHẾ PHẨM PROBIOTICS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC