Xây dựng quy trình định lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC và HPTLC

72 1.4K 11
Xây dựng quy trình định lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC và HPTLC

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ THÚY HƯƠNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ANTHOCYANIN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ HPTLC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ THÚY HƯƠNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ANTHOCYANIN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ HPTLC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 6072 04 10 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Tường Vy NCS. Cao Công Khánh HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn sâu sắc tới cô giáo PGS.TS. Nguyễn Tường Vy, NCS Cao Công Khánh là những người đã trực tiếp ở bên hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các anh chị ở labo Hóa độc thực phẩm - Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, những người đã dìu dắt, hướng dẫn và đóng góp rất nhiều ý kiến quý báu giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn các anh chị của nhóm tải báo đã giúp tôi rất nhiều trong việc tìm tài liệu tham khảo cho luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học, các thầy cô đã tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình học tập tại trường và thực hiện luận văn này. Cuối cùng tôi xin dành lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua. Hà Nội, ngày 23 tháng 8 năm 2014. Học viên Đinh Thị Thúy Hương MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC, CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN DANH MỤC HÌNH VẼ TRONG KHÓA LUẬN ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về thực phẩm chức năng 3 1.2. Tổng quan về anthocyanin 3 1.2.1. Cấu trúc anthocyanin 3 1.2.2. Tác dung của anthocyanin 5 1.2.3. Tính chất của Anthocyanin 7 1.2.4. Một số phƣơng pháp phân tích anthocyanin 8 1.3. Tổng quan về HPTLC 10 1.3.1. Sắc ký lớp mỏng 10 1.3.2. HPTLC 12 1.4. Tổng quan về HPLC 14 1.4.1.Khái niệm chung 14 1.4.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký 14 1.4.3. Thiết bị sắc ký lỏng 16 1.5. Tổng quan về chiết pha rắn SPE 20 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.2. Nguyên vật liệu – thiết bị 21 2.2.1.Nguyên vật liệu 21 2.2.2. Thiết bị 22 2.3. Nội dung nghiên cứu 23 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.4.1. Khảo sát các điều kiện phân tích anthocyanin bằng HPLC 23 2.4.2. Khảo sát các điều kiện phân tích anthocyanin bằng HPTLC 25 2.4.3.Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 26 2.4.4. Thẩm định quy trình 27 2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu 27 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 28 3.1.Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích anthocyanin bằng HPLC 28 3.2. Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích Anthocyanin bằng HPTLC 31 3.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu 32 3.4. Thẩm định phƣơng pháp 34 3.4.1. Tính chọn lọc, tính đặc hiệu 34 3.4.2. Tính thích hợp hệ thống 36 3.4.3. Khoảng tuyến tính 38 3.4.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng 33 3.4.5. Độ thu hồi của phƣơng pháp 42 3.4.6. Độ lặp lại của phƣơng pháp 44 3.5. Kết quả áp dụng phƣơng pháp xác định Anthocyanin trong một số sản phẩm 46 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 48 4.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật 48 4.1.1. Lựa chọn phƣơng pháp 48 4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu 48 4.1.3. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng 50 4.1.4. Thẩm định phƣơng pháp đã xây dựng 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 KẾT LUẬN 54 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN AOAC (Association of Official Analytical Chemists) Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức PDA (Photodiod array detector) Detector mảng diod HPLC (high – performance liquid chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPTLC (high – performance thin layer chromatography) Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao LOD (Limit of Detection) Giới hạn phát hiện LOQ (Limit of quantification) Giới hạn định lượng RSD (Relative standard deviation) Độ lệch chuẩn tương đối SD (Standard deviation) Độ lệch chuẩn S Diện tích pic (mAu.s) C Nồng độ HL Hàm lượng t R Thời gian lưu µL microlit TPCN Thực phẩm chức năng m Khối lượng TFA Trifluoroacetic acid TCA Trichloroacetic acid DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Tên bảng Trang Bảng 1.1 Các phương pháp phân tích Anthocyanin 8 Bảng 2.1 Danh mục các mẫu phân tích 21 Bảng 2.2 Danh mục các pha động HPLC khảo sát 24 Bảng 2.3 Gradient hệ pha động HPTLC khảo sát 25 Bảng 3.1 Gradient hệ pha động 1,2 29 Bảng 3.2 Chương trình gradient của hệ pha động, 3 và 4 30 Bảng 3.3 Kết quả định lượng Anthocyanin trong mẫu bột Bilberry theo dung môi dùng để chiết mẫu 33 Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống với dung dịch biberry trên HPLC 37 Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống với dung dịch Bilberry trên HPTLC 38 Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của chất chuẩn cyanidin chloride 39 Bảng 3.7 Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn 39 Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của chất chuẩn bilberry 40 Bảng 3.9 Độ thu hồi của phương pháp HPLC với mẫu thực phẩm chức năng dạng dung dịch 42 Bảng 3.10 Độ thu hồi của phương pháp HPTLC với mẫu thực phẩm chức năng dạng dung dịch 43 Bảng 3.11 Độ lặp lại của phương pháp HPLC với mẫu bột đông khô Bilberry 44 Bảng 3.12 Độ lặp lại của phương pháp HPLC trên nền mẫu nang mềm 45 Bảng 3.13 Độ lặp lại của phương pháp HPTLC trên nền mẫu nang mềm 46 Bảng 3.14 Kết quả phân tích Anthocyanin trong thực phẩm chức năng 47 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ TRONG LUẬN VĂN Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin 4 Hình 1.2 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 16 Hình 3.1 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Bilberry với hệ pha động 1 29 Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn bilberry với hệ pha động 2 29 Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn bilberry với hệ pha động 3 30 Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin với hệ pha động 4 30 Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch đánh giá độ phân giải với hệ pha động 4 31 Hình 3.6 Hình ảnh HPTLC với hệ pha động 4 32 Hình 3.7 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn gốc cyanidin chloride 10 µg/mL 33 Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch bilberry chiết bằng methanol:HCl2N(80:20) 33 Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch bilberry sau thủy phân. 35 Hình 3.10 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 100 µg/mL 35 Hình 3.11 Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng không chứa anthocyanin 35 Hình 3.12 Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng không chứa anthocyanin được thêm chuẩn cyanidin 36 Hình 3.13 Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng không chứa anthocyanin được thêm chuẩn cyanidin trên HPTLC 36 Hình 3.14 Đường chuẩn dung dịch gốc Cyanidin chloride 39 Hình 3.15 Đường chuẩn dung dịch bilberry trên HPTLC 40 Hình 3.16 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 0,5 µg/mL 41 Hình 3.17 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 0,2 µg/mL 42 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay cuộc sống ngày càng phát triển hiện đại, các bệnh về tim mạch, ung thư hiện đang rất phổ biến và có chiều hướng gia tăng nhanh. Đời sống ngày càng phát triển, người dân cũng quan tâm đến sức khỏe của bản thân nhiều hơn. Ở nước ta trong năm năm trở lại đây thực phẩm chức năng được đưa vào và sử dụng rất rộng rãi, tràn lan vì chúng được biết đến là những chế phẩm có thể sử dụng thường xuyên, lâu dài để phòng ngừa nguy cơ gây bệnh, bổ dưỡng mà rất an toàn, ít hoặc hầu như không có tác dụng phụ đối với hầu hết các lứa tuổi. Chính vì thế việc mọi người lựa chọn thực phẩm chức năng để phòng chống và bồi bổ sức khỏe rất nhiều. Tuy nhiên không phải ai cũng hiểu tường tận về thực phẩm chức năng. Đa số các thực phẩm chức năng có giá thành khá cao, và ở Việt Nam việc kiểm soát chất lượng sản phẩm này chưa chặt chẽ nên xảy ra nhiều bất cập như không có hoặc có rất ít hoạt chất dẫn đến việc sử dụng chúng không mang lại hiểu quả. Theo các nghiên cứu thì các hợp chất Anthocyanin có các hoạt tính rất tốt như: Chống viêm, xơ vữa động mạch, ức chế đông tụ tiểu cầu, chống ung thư, thúc đẩy hình thành cytokine điều hòa phản ứng miễn dịch, có hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh. Chính vì thế mà các thực phẩm chức năng chứa Anthocyanin được sản xuất ngày càng nhiều và đối tượng sử dụng cũng rất phong phú [4], [5], [11]. Trên thế giới có một số nghiên cứu về phương pháp xác định hàm lượng các chất thuộc nhóm Anthocyanin trên các mẫu thực phẩm bằng cách sử dụng các kĩ thuật chính như: UV-VIS, HPLC-PDA, MS, ESI [16], [22], [24]. Mỗi phương pháp đều có các ưu nhược điểm riêng. Tuy nhiên các phương pháp trên chủ yếu nghiên cứu trên đối tượng mẫu là thực phẩm, đồ uống, rất ít nghiên cứu về thực phẩm chức năng. Tại Việt Nam hầu như chưa 2 có nghiên cứu nào về phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin trong thực phẩm chức năng. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình định lượng Anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPTLC và HPLC” Với các mục tiêu sau đây: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng kỹ thuật HPLC và kỹ thuật HPTLC. 2. Áp dụng quy trình kỹ thuật đã xây dựng phân tích một số mẫu thực phẩm chức năng trên thị trường [...]... Cũng như thực phẩm thuốc, thực phẩm chức năng nằm ở nơi giao thoa giữa thực phẩm và thuốc và người ta cũng gọi thực phẩm chức năng là thực phẩm thuốc Bộ Y tế Việt Nam theo thông tư số 08/TT – BYT ngày 23/08/2004 về việc “ Hướng dẫn việc quản lý các sản phẩm thực phẩm chức năng định nghĩa thực phẩm chức năng: “là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh... lấy phần dịch, định mức 10 mL bằng cùng dung môi và lọc qua màng lọc 0,45 µm - Tiêm vào hệ sắc ký HPLC, HPTLC (pha loãng nếu cần) 26 Quy trình chiết Anthocyanin cho đối tượng phân tích là thực phẩm chức năng dạng dung dịch dự kiến gồm các bước sau: tương tự các bước đối với thực phẩm chức năng dạng viên nén, nang mềm và nang cứng nhưng thêm bước cuối làm sạch và làm giầu mẫu bằng phương pháp chiết pha... tan trong dung dịch rửa Bước 4: Rửa giải chọn lọc chất phân tích: Dùng một dung môi để rửa giả lấy ra chất phân tích 20 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng của Anthocyanin trong thực phẩm chức năng Đối tượng mẫu phân tích là anthocyanin và đối tượng nghiên cứu là các thực phẩm chức năng. .. khoẻ và làm giảm nguy cơ mắc bệnh hơn là so với giá trị dinh dưỡng mà nó mang lại" Theo IFIC, thực phẩm chức năng là những thực phẩm hay thành phần của chế độ ăn có thể đem lại lợi ích cho sức khoẻ nhiều hơn giá trị dinh dưỡng cơ bản Thực phẩm chức năng có thể là sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hoặc là thực phẩm trong quá trình chế biến được bổ sung thêm các chất khác Cũng như thực phẩm thuốc, thực phẩm. .. độ lệch, độ lệch chuẩn, phương sai, độ lệch chuẩn tương đối, hệ số biến thiên, độ thu hồi khi xử lý các kết quả thực nghiệm và đánh giá thẩm định phương pháp 27 CHƢƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích Anthocyanin bằng HPLC Để xây dựng quy trình phân tích Anthocyanin bằng HPLC, chúng tôi sử dụng các điều kiện sắc ký thông dụng dưới đây cố định trong toàn bộ nghiên cứu:... tháo đường Khả năng chữa bệnh của anthocyanin vẫn đang được nghiên cứu để tìm hiểu cơ chế và ứng dụng trong y học Các ứng dụng trên đã mở ra một triển vọng về việc sản xuất thực phẩm, dược phẩm chức năng chữa bệnh có hiệu quả [21], [26] Trong lĩnh vực thực phẩm, với khả năng chống oxy hóa cao, anthocyanin được sử dụng để bảo quản thực phẩm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa cho thực phẩm Kết quả... 1.1 Khái niệm về thực phẩm chức năng: Thực phẩm chức năng (Functional foods) được người Nhật sử dụng đầu tiên trong những năm 1980 để chỉ những thực phẩm chế biến có chứa những thành phần tuy không có giá trị dinh dưỡng nhưng giúp nâng cao sức khoẻ cho người sử dụng Theo Viện Khoa học và Đời sống quốc tế (International Life Science Institute - ILSI) thì "thực phẩm chức năng là thực phẩm có lợi cho một... cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh” Tuỳ theo công thức, hàm lượng vi chất và hướng dẫn sử dụng, thực phẩm chức năng còn có các tên gọi sau: thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng, thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ, sản phẩm dinh dưỡng y học 1.2 Tổng quan về Anthocyanin 1.2.1 Cấu trúc của Anthocyanin: 3 Anthocyanin thuộc nhóm các hợp chất flavonoid,... Bình định mức 10mL, 20 mL, 50 mL, cốc có mỏ, pipet các loại, autopipet 1000 μL, 200 μL, 5000 µL - Ống ly tâm 50 mL, 25mL, lọ thủy tinh có nắp kín - Phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0,45 µm, 0,2 µm Nội dung nghiên cứu 2.3 - Khảo sát xây dựng điều kiện chạy máy HPLC, HPTLC để phân tích Anthocyanin - Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách chiết Anthocyanin trong thực phẩm chức năng - Đánh giá (thẩm định) ... phân tích và các dung dịch chuẩn được chấm trên cùng 1 bản mỏng sắc ký, khai triển cùng trong một điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích [19] Do bởi các ưu điểm trên nên chúng tôi lựa chọn kỹ thuật HPTLC để nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng 1.4 Tổng quan về HPLC 1.4.1 . bằng phương pháp HPTLC và HPLC Với các mục tiêu sau đây: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng kỹ thuật HPLC và kỹ thuật HPTLC. . hàm lượng Anthocyanin trong thực phẩm chức năng. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu đề tài: Xây dựng quy trình định lượng Anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ THÚY HƯƠNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ANTHOCYANIN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ HPTLC

Ngày đăng: 26/07/2015, 07:16

Từ khóa liên quan

Mục lục

  • (1) BIA

  • (2) LỜI CẢM ƠN

  • (3) Mục lục

  • (4) DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

  • (5) LU-N V-N CAO H-C (Bomy)

  • (6) TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan