BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MINH TRANG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN CHUỘT BỊ THIẾU MÁU NÃO CỤC BỘ VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE CỦA RAU ĐẮNG BIỂN (BACOPA MONNIERI(LINN.) WETTST) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MINH TRANG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN CHUỘT BỊ THIẾU MÁU NÃO CỤC BỘ VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE CỦA RAU ĐẮNG BIỂN (BACOPA MONNIERI(LINN.) WETTST) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÓA SINH DƯỢC 60120408 Người hướng dẫn khoa học : TS. Nguyễn Thị Lập TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô cùng đồng nghiệp. Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Thị Lập và TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng, hai người thầy luôn tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị đồng nghiệp và bạn bè công tác tại Khoa dược lý – sinh hóa - Viện dược liệu và Bộ môn Hóa sinh - Trường Đại học Dược Hà Nội đã phối hợp và tạo điều kiện giúp tôi thực hiện luận văn. Lời cảm ơn cuối cùng xin gửi tới gia đình và bạn bè đã luôn quan tâm động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành nhiệm vụ của mình. Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Nguyễn Minh Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 3 1. Bệnh Alzheimer 3 1.1. Dịch tễ 3 1.2. Yếu tố nguy cơ 3 1.3. Triệu chứng 4 1.4. Cơ chế bệnh sinh 5 1.5. Acetylcholinesterase và thuốc kháng enzym acetylcholinesterase 10 1.6. Một số nhóm thuốc khác điều trị bệnh Alzheimer 11 1.7. Đích tác dụng của các thuốc điều trị Alzheimer trong tương lai 11 2. Rau đắng biển 13 2.1. Vị trí phân loại 13 2.2. Đặc điểm thực vật 14 2.3. Phân bố 14 2.4. Thành phần hóa học 15 2.5. Tác dụng dược lý 17 3. Một số mô hình đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ 22 3.1. Mô hình đánh giá khả năng ức chế acetylcholinesterase 22 3.2. Mô hình đánh giá khả năng học tập không gian trên chuột 22 4. Liên quan giữa thiếu máu não cục bộ và bệnh Alzheimer 23 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu 25 2.1.1. Nguyên liệu 25 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu26: 2.1.3. Hóa chất27 2.2. Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1. Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo bằng thử nghiệm mê lộ nước Morris 28 2.2.2. Nghiên cứu khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE) ex vivo 31 2.2.3. Nghiên cứu khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE) in vitro 32 2.3. Xử lý số liệu 32 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1. Tác dụng cải thiện trí nhớ của rau đắng biển trên chuột bị suy giảm trí nhớ đánh giá qua thử nghiệm mê lộ nƣớc Morris 33 3.1.1. Bài tập nhìn thấy bến đỗ và bài tập không nhìn thấy bến đỗ 33 3.1.2. Bài tập không có bến đỗ 36 3.2. Nghiên cứu tác dụng ức chế hoạt tính enzym acetylcholinesterase in vitro và ex vivo của rau đắng biển 38 3.2.1. Nghiên cứu tác dụng ức chế hoạt tính enzym AChE in vitro của các mẫu M1, M2 38 3.2.2. Nghiên cứu tác dụng ức chế hoạt tính enzym AChE ex vivo của các mẫu M1, M2 41 Chƣơng 4: Bàn luận 43 4.1. Về tác dụng cải thiện trí nhớ của rau đắng biển 43 4.2. Về tác dụng ức chế hoạt tính enzyme AChE in vitro và ex vivo của rau đắng biển 50 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACh Acetylcholine AChE Enzym Acetylcholinesterase AD Bệnh Alzheimer (Alzheimer disease) APP Protein tiền chất amyloid (Amyloid precursor protein) BuChE Butyrylcholinesterase CAT Catalase FTD Sa sút trí tuệ trán – thái dương (Frontotemporal Dementia) GPX Glutathione peroxidase g dl/kg gam dược liệu/kg thể trọng chuột HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) NFT Đám rối thần kinh (Neurofibrillary tangle) NMDA N-methyl D-aspartate MAPT Một gen mã hóa protein Tau (Microtubule-Associated Protein Tau) SOD Superoxide dismutase SSRIs Các chất ức chế tái hấp thu serotonin chọn lọc (Selective serotonin reuptake inhibitors) SSTT Sa sút trí tuệ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang 2.1. Nguyên vật liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm 27 3.1. Tác dụng của mẫu M1 và M2 đối với thời gian tiềm ẩn 34 3.2. Tác dụng ức chế enzym AChE phụ thuộc vào nồng độ mẫu M1 và M2 38 3.3. Giá trị IC 50 của các mẫu nghiên cứu 40 3.4. Tác dụng của tacrin, M1 và M2 đối với hoạt độ AChE ex vivo 41 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Trang 1.1. Mối liên quan giữa protein Tau, β amyloid và ApoE4 với bệnh Alzheimer 8 1.2. Hình ảnh rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn.) Wettst) 14 2.1. Sơ đồ chiết xuất mẫu M1 25 2.2 . Sơ đồ chiết xuất mẫu M2 26 2.3. Mô hình mê lộ nước Morris 29 3.1. Đồ thị biểu diễn thời gian tiềm tàng của các lô chuột thử nghiệm ở ngày thứ 6 của bài tập không nhìn thấy bến đỗ 36 3.2. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ thời gian chuột ở cung phần tư đích phụ thuộc vào lô thí nghiệm ở bài tập không có bến đỗ 37 3.3. Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế hoạt tính enzym phụ thuộc vào nồng độ mẫu M1 39 3.4. Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế hoạt tính enzym phụ thuộc vào nồng độ mẫu M2 40 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự phát triển của cuộc sống hiện đại, số lượng người cao tuổi, thậm chí cả người trẻ tuổi mắc bệnh suy giảm trí nhớ ngày càng gia tăng. Nghiên cứu cho thấy có khoảng 35 triệu người bị mắc bệnh Alzheimer. Thống kê cho thấy ở châu Á có khoảng gần 13 triệu người mắc bệnh Alzheimer, dự đoán đến năm 2050 con số này tăng lên tới 62,8 triệu người. Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng bệnh điển hình là Alzheimer. Alzheimer là thể bệnh nặng nhất trong nhóm các bệnh sa sút trí tuệ, hiện nay là mối quan tâm hàng đầu của những nhà lão khoa trên toàn thế giới cũng như ở nước ta, khi tuổi thọ trung bình ngày càng cao, số người mắc bệnh ngày càng nhiều [5]. Bệnh nhân bị Alzheimer sẽ bị giảm khả năng xét đoán, định hướng không gian và thời gian, ngôn ngữ, tư duy nhận thức, hành động ảnh hưởng nặng nề đến chức năng và chất lượng cuộc sống, gây nhiều khó khăn cho người bệnh, cho gia đình và cả cộng đồng xã hội. Các thuốc điều trị Alzheimer chủ yếu gồm các thuốc ức chế cholinesterase, thuốc kháng thụ thể N-methyl – D- Aspartat, thuốc tăng cường hoạt tính serotonin. Ba nhóm này đa số là thuốc tân dược nhưng giá thành thuốc tương đối cao và có những tác dụng không mong muốn. Do đó nhu cầu nghiên cứu phát triển các thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu để hỗ trợ và điều trị Alzheimer là rất cần thiết. Theo Y học cổ truyền Ấn Độ, rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Wettst. được sử dụng để điều trị rối loạn tâm thần kinh như lo lắng, sa sút trí tuệ, trí nhớ kém. Trên thế giới cũng đã có những nghiên cứu chứng minh hiệu quả của rau đắng biển trên hệ thần kinh của chuột và người. Rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Wettst) nhiều năm nay đã là món ăn phổ biến với người dân 2 Việt Nam. Tuy nguồn nguyên liệu dồi dào như vậy nhưng rau đắng biển vẫn chưa được chú trọng nghiên cứu làm thuốc điều trị Alzheimer, trong khi nhu cầu sử dụng là khá phổ biến và bệnh nhân phải mua thuốc nhập từ nước ngoài với giá thành khá cao. Điều này gây tổn thất về giá trị kinh tế cũng như ý nghĩa xã hội của loài cây này. Vì vậy chúng tối tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị thiếu máu não cục bộ và khả năng ức chế acetylcholinesterase của rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Wettst)”, nằm trong khuôn khổ đề tài cấp bộ y tế “Nghiên cứu tác dụng cải thiện khả năng học, nhớ và bảo vệ thần kinh của cây rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Wettst) theo hướng làm thuốc chữa bệnh Alzheimer”. Đề tài “Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị thiếu máu não cục bộ và khả năng ức chế acetylcholinesterase của rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Wettst)” được tiến hành với hai mục tiêu: 1. Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của rau đắng biển trên chuột nhắt trắng bị suy giảm trí nhớ do thiếu máu não cục bộ tạm thời bằng thử nghiệm mê lộ nước Morris 2. Đánh giá khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase của rau đắng biển in vitro và ex vivo [...]... phần có tác dụng cả thiện khả năng ghi nhớ bị suy giảm bởi scopolamine của chuột thử nghiệm Một nghiên cứu khác cũng của PGS Nguyễn Thị Thu Hương khảo sát tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamine trong thực nghiệm mê lộ nước Morris Kết quả cho thấy saponin toàn phần của rau đắng biển có tác dụng cải thiện khả năng ghi nhớ bị suy giảm bởi scopolamine của chuột thử... về khả năng học tập qua thị giác và cải thiện trí nhớ ở chuột khi điều 17 trị bằng cao chiết rau đắng biển Những kết quả này càng khẳng định một cách rõ rệt về hiệu quả của cao chiết rau đắng biển dùng đường uống giúp cải thiện khả năng học và nhớ ở chuột [48] Tác dụng của rau đắng biển trên khả năng học tập đã được kiểm tra trên chuột uống cao chiết cồn của rau đắng biển (liều 40 mg/kg trong 3-5 ngày... kinh vỏ não nuôi cấy nguyên phát, đã bị tổn thương bởi βamyloid Nghiên cứu trên lâm sàng Ngoài các nghiên cứu trên chuột cũng đã có những nghiên cứu về tác dụng của rau đắng biển trên hệ thần kinh của người Nghiên cứu của Steven Roodenrys và cộng sự được thực hiện với mục đích đánh giá hiệu quả của rau đắng biển trên bộ nhớ của người 76 người có độ tuổi từ 40 đến 65 tham gia vào một nghiên cứu ngẫu... giá phản ứng của chuột: kết quả cho thấy nhóm dùng thuốc giữ được khả năng đã học từ trước, đồng thời cải thiện được trí nhớ [46] Ở Việt Nam cũng đã có nghiên cứu của PGS Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự khảo sát tác dụng cải thiện trí nhớ của rau đắng biển trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamine trong thử nghiệm “step-down” Thử nghiệm được sử dụng để đánh giá khả năng ghi nhớ của chuột qua... Alzheimer và thiếu máu não cục bộ Thiếu máu não cục bộ có thể đóng vai trò quan trọng, cả trực tiếp và gián tiếp, trong sinh bệnh học của bệnh Alzheimer Qi JP và cộng sự tiến hành nghiên cứu các biểu hiện và sự phân bố của β amyloid 1-40, β amyloid 1-42 và ApoE trong vùng hải mã của bệnh nhân sau khi bị thiếu máu não để xác định vai trò của thiếu máu não cục bộ trong bệnh Alzheimer Nghiên cứu cho kết... nghiệm [3] Cơ chế cải thiện việc suy giảm trí nhớ và bảo vệ tế bào thần kinh của rau đắng biển trên mô hình bệnh Alzheimer đã được một số tác giả trên thế giới tìm 18 hiểu Có một nghiên cứu đã chỉ ra cao chiết rau đắng biển có tác dụng làm giảm mức độ β-amyloid trong não chuột chuyển gen mang bệnh Alzheimer (chuột PSAPP) [54] Trên mô hình in vitro, cao chiết rau đắng biển cũng có tác dụng bảo vệ tế... do khả năng chống oxy hóa ở vùng hải mã [40] Một nghiên cứu khác cũng đánh giá tác dụng của cao chiết rau đắng biển trên quá trình ghi nhớ và học tập ở người của C Stough và cộng sự cho kết quả cao chiết rau đắng biển (300mg) đem lại hiệu quả sau 12 tuần giúp cải thiện quá trình xử lý thông tin, học tập bằng lời nói và quá trình ghi nhớ ở người Những phát hiện này gợi ý rằng rau đắng biển giúp cải thiện. .. giá chức năng của bộ nhớ và mức độ lo lắng Nghiên cứu được chia làm 3 giai đoạn: giai đoạn trước thử nghiệm, 3 tháng thử nghiệm và 6 tuần sau khi hoàn thành thử nghiệm Kết quả cho thấy rau đắng biển có ảnh hưởng đáng kể trong việc lưu trữ các thông tin mới Điều này gợi ý rằng rau đắng biển làm giảm tỷ lệ quên các thông tin mới ở người Các tác giả dự đoán tác dụng cải thiện trí nhớ của rau đắng biển. .. 2.4.3 Tác dụng hướng thần Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy tác dụng bảo vệ thần kinh của rau đắng biển là do khả năng chống oxy hóa ngăn chặn quá trình stress oxy hóa tế bào thần kinh và ức chế acetyl cholinesterase Vì vậy sử dụng cao chiết rau đắng biển có thể là một hướng điều trị cho các bệnh nhân bị rối loạn thần kinh Một nghiên cứu khác cũng cho thấy vai trò bảo vệ thần kinh của cao chiết rau đắng. .. đắng biển có khả năng ức chế AChE khác nhau ở các vùng não khác nhau Vỏ não (51,6%)> tiểu não( 51%)> đồi thị (41,6%)> bán cầu (38,1%) Nghiên cứu động học enzym in vivo cho thấy có sự gia tăng giá trị Km của AChE trong từng vùng não do dịch chiết rau đắng biển Giá trị Km tăng cao nhất được quan sát thấy trong vỏ não Như vậy, rau đắng biển có tác dụng ức chế cạnh tranh với AChE trong tất cả các vùng não . TRANG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN CHUỘT BỊ THIẾU MÁU NÃO CỤC BỘ VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE CỦA RAU ĐẮNG BIỂN (BACOPA MONNIERI( LINN.) WETTST) LUẬN. hội của loài cây này. Vì vậy chúng tối tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị thiếu máu não cục bộ và khả năng ức chế acetylcholinesterase của rau đắng. (Linn) Wettst) theo hướng làm thuốc chữa bệnh Alzheimer”. Đề tài Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị thiếu máu não cục bộ và khả năng ức chế acetylcholinesterase của rau đắng biển