BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH TRƢƠNG MINH VŨ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CỒN TRONG MÁU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ VÀ SO SÁNH VỚI PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SINH HÓA LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Nghệ An, 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH TRƢƠNG MINH VŨ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CỒN TRONG MÁU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ VÀ SO SÁNH VỚI PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SINH HÓA Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trần Đình Thắng Nghệ An, 2014 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu xác định nồng độ cồn trong máu bằng phương pháp sắc ký khí và so sánh với phương pháp phân tích sinh hóa”. Tôi đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Ban lãnh đạo Cơ quan tôi đang công tác; Thầy cô là giảng viên của Khoa Hóa học trường Đại học Vinh, người đã trực tiếp giảng dạy và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức chuyên sâu về hóa học; Tôi xin bày tỏ lòng chân thành và cảm ơn về sự giúp đỡ đó. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Đình Thắng, giảng viên đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp nơi tôi đang công tác và gia đình đã động viên, khích lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện hoàn thành luận văn này. MỤC LỤC Lời cảm ơn Trang Mục lục Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị, phổ đồ, phiếu xét nghiệm MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Giới thiệu về cồn (ethanol) 3 1.1.1. Lịch sử phát hiện 3 1.1.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học 4 1.1.2.1. Cấu tạo: 4 1.1.2.2. Tính chất vật lý: 4 1.1.2.3. Tính chất hóa học: 4 1.2. Giới thiệu về máu 6 1.2.1. Sơ lược về máu 6 1.2.2. Cơ chế chuyển hóa cồn trong máu 6 1.3. Một số phƣơng pháp xác định hàm lƣợng ethanol trong máu 7 1.3.1. Phương pháp xét nghiệm sinh hóa: 7 1.3.1.1. Nguyên lý: 7 1.3.1.2. Thu mẫu: 7 1.3.1.3. Tiến hành xét nghiệm: 7 1.3.1.4. Xuất kết quả: 7 1.3.2. Phương pháp sắc ký khí 8 1.3.2.1. Hóa chất, thuốc thử và thiết bị: 8 1.3.2.2. Xử lý mẫu: 8 1.3.2.3. Tiến hành phân tích sắc ký khí: 8 1.3.2.4. Kết quả: 9 1.3.3. Phương pháp sắc ký khí với hệ thống Headspace: 9 1.3.3.1. Hóa chất, thuốc thử và thiết bị: 9 1.3.3.2. Xử lý mẫu: 9 1.3.3.3. Tiến hành phân tích sắc ký khí: 10 1.3.3.4. Kết quả: 10 1.4. Giới thiệu về Sắc ký khí 11 1.4.1. Đại cương về sắc ký: 11 1.4.2. Các đại lượng cơ bản trong phương pháp sắc ký: 12 1.4.2.1. Hệ số phân bố: 12 1.4.2.2. Thời gian lưu (t R ): 12 1.4.2.3. Hệ số dung lượng: 13 1.4.2.4. Số đĩa lý thuyết của cột: 14 1.4.2.5. Độ chọn lọc: 14 1.4.2.6. Độ phân giải: 15 1.4.3. Các bộ phận chính của máy sắc ký khí: 15 1.4.3.1. Khí mang: 16 1.4.3.2. Buồng tiêm: 16 1.4.3.3. Cột tách Sắc ký khí: 17 1.4.3.4. Pha tĩnh trong sắc ký khí: 19 1.4.3.5. Đầu dò (detector): 20 1.5. Phƣơng pháp định tính và định lƣợng 21 1.5.1. Phương pháp định tính: 21 1.5.2. Phương pháp định lượng: 21 1.5.2.1. Phương pháp ngoại chuẩn: 21 1.5.2.2. Phương pháp nội chuẩn: 21 1.6. Phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn và Phƣơng pháp một điểm chuẩn 22 1.6.1. Phương pháp xây dựng đường chuẩn: 22 1.6.1.1. Khoảng tuyến tính và cách xác định: 22 1.6.1.2. Các phương pháp xây dựng đường chuẩn: 23 1.6.1.3. Các lưu ý: 25 1.6.2. Phương pháp một điểm chuẩn: 27 1.7. Phƣơng pháp khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) 27 1.7.1. Giới hạn phát hiện (LOD) 27 1.7.1.1. Định nghĩa: 27 1.7.1.2. Cách xác định: 27 1.7.2. Giới hạn định lượng: 28 1.7.2.1. Định nghĩa: 28 1.7.2.2. Cách xác định: 29 1.8. Phƣơng pháp khảo sát độ lập lại 29 1.9. Phƣơng pháp khảo sát hiệu suất thu hồi 30 CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 32 2.1. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 32 2.1.1. Dụng cụ: 32 2.1.2. Thiết bị: 32 2.2. Hóa chất 32 2.3. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu, khảo sát bằng máy sắc ký khí 33 2.3.1. Chuẩn bị hóa chất và mẫu máu: 33 2.3.1.1. Dung dịch natri tungstat: 120g/l: 33 2.3.1.2. Dung dịch axit sulfuric 5%: 33 2.3.1.3. Dung dịch propanol 0,25g/l: 33 2.3.1.4. Các dung dịch ethanol: 33 2.3.1.5. Dung dịch máu có nồng độ 100mg ethanol/100ml máu 33 2.3.2. Chuẩn bị mẫu: 34 2.3.2.1. Chuẩn bị mẫu thử: 34 2.3.2.2. Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn: 34 2.3.2.3. Chuẩn bị mẫu chuẩn: 34 2.3.2.4. Chuẩn bị mẫu trắng: 35 2.3.3. Thiết bị, điều kiện phân tích và trình tự tiêm mẫu 35 2.3.3.1. Thiết bị phân tích: 35 2.3.3.2. Điều kiện phân tích: 35 2.3.3.3. Trình tự tiêm mẫu: 36 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1. Khảo sát các phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn 37 3.1.1. Xây dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết (PP 1): 37 3.1.2. Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu trắng (PP 2): 38 3.1.3. Xây dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết, không xử lý chuẩn mẫu (PP 3): 39 3.1.4. So sánh kết quả các phương pháp xây dựng đường chuẩn 40 3.2. Khảo sát phƣơng pháp một điểm chuẩn 41 3.3. Khảo sát hiệu suất thu hồi 42 3.4. Khảo sát độ lặp lại 43 3.4.1. Độ lặp lại (độ ổn định) của thiết bị: 43 3.4.2. Độ lặp lại của phương pháp: 43 3.5. Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng 44 3.5.1. Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD): 44 3.5.2. Tính giới hạn định lượng (LOQ): 46 3.6. So sánh kết quả thực nghiệm bằng Phƣơng pháp sắc ký khí và Phƣơng pháp xét nghiệm (phân tích) sinh hóa 46 3.7. Khảo sát một số phƣơng pháp bảo quản mẫu ảnh hƣởng đến nồng độ cồn trong máu theo thời gian bằng Phƣơng pháp sắc ký khí 48 KẾT LUẬN 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 54-87 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT - ĐC : Đường chuẩn - C : Nồng độ - C PP : Nồng độ theo phương pháp - FID : Đầu dò ion hóa ngọn lửa - GC : Sắc ký khí - H : Hiệu suất thu hồi - LOD : Giới hạn phát hiện - LOQ : Giới hạn định lượng - MS : Đầu dò khối phổ - PP : Phương pháp - RSD : Độ lệch chuẩn tương đối - SD : Độ lệch chuẩn - S/N : Tỷ lệ chiều cao tín hiệu chất phân tích chia cho nhiễu đường nền - S c /S nc : Tỷ lệ diện tích chất chuẩn chia cho nội chuẩn - S m /S nc : Tỷ lệ diện tích chất phân tích chia cho nội chuẩn -  ,  : Ký hiệu tăng hay giảm. DANH MỤC CÁC BẢNG - Bảng 3.1: Mối tương quan giữa nồng độ (C) và tỉ lệ diện tích (S c /S nc ) các điểm chuẩn theo PP 1 - Bảng 3.2: Mối tương quan giữa nồng độ (C) và tỉ lệ diện tích (S c /S nc ) các điểm chuẩn theo PP 2 - Bảng 3.3: Mối tương quan giữa nồng độ (C) và tỉ lệ diện tích (S c /S nc ) các điểm chuẩn theo PP 3 - Bảng 3.4: Tỉ lệ diện tích peak và nồng độ của các mẫu M 1 và M 2 tính theo 3 phương pháp xây dựng đường chuẩn - Bảng 3.5: Kết quả nồng độ trung bình mẫu M 2-TB và độ sai lệch giữa phương pháp đường chuẩn (PP 1) và phương pháp một điểm chuẩn - Bảng 3.6: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi (H%) - Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ lặp lại của thiết bị - Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp - Bảng 3.9: Xác định chiều cao của nhiễu đường nền (N) ở nồng độ 4mg/100ml - Bảng 3.10: Xác định độ lặp lại của chiều cao mẫu chuẩn (S) ở nồng độ 4mg/100ml - Bảng 3.11: Kết quả phương pháp GC và phương pháp xét nghiệm sinh hóa - Bảng 3.12: Kết quả các phương pháp bảo quản mẫu ảnh hưởng đến nồng độ. DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ, PHỔ ĐỒ, PHIẾU XÉT NGHIỆM - Hình 1.1: Thời gian lưu (t R ) của cấu tử phân tích trên sắc ký đồ - Hình 1.2: Mô tả cách tính số đĩa lý thuyết - Hình 1.3: Sơ đồ thiết bị sắc ký khí - Hình 1.4: Mô tả khoảng tuyến tính và khoảng làm việc - Hình 1.5: Mô tả cách xác định LOD bằng cách tính S/N - Hình 1.6: Mô tả mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính - Hình 3.1: Đường chuẩn theo PP 1 - Hình 3.2: Đường chuẩn theo PP 2 - Hình 3.3: Đường chuẩn theo PP 3 - Hình 3.4: Đồ thị nồng độ cồn trong máu mẫu M 9 giảm dần theo thời gian và phương pháp bảo quản - Phổ đồ 1-93: Các phổ đồ sắc ký khí ở phần phu lục - Phiếu xét nghiệm 1-6: Các phiếu xét nghiệm sinh hóa ở hai bệnh viện. [...]... nồng độ cồn trong máu bằng Phương pháp sắc ký khí và so sánh với Phương pháp phân tích sinh hóa áp dụng cho mẫu máu thu trên người sống và đã chết Trong quá trình thực hiện đề tài này, chúng tôi tập trung nghiên cứu và khảo sát một số nội dung sau: 2 - Nghiên cứu một số phương pháp định lượng nồng độ cồn trong máu - Nghiên cứu, khảo sát phương pháp định lượng nồng độ cồn trong máu bằng sắc ký khí (GC-FID),... là: + Khảo sát một số phương pháp xây dựng đường chuẩn và so sánh với phương pháp một điểm chuẩn + Khảo sát giới hạn phát hiệnvà giới hạn định lượng + Khảo sát độ ổn định của thiết bị và độ lặp lại của phương pháp + Khảo sát hiệu suất thu hồi - So sánh kết quả xác định nồng độ cồn trong máu bằng phương pháp sắc ký khí với phương pháp phân tích sinh hóa - Khảo sát một số phương pháp bảo quản mẫu (không... Qua nghiên cứu một số tài liệu, tạp chí, quy trình về định lượng nồng độ cồn trong máu bằng phương pháp sắc ký khí (GC) và sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) [2], [10], [11], [12], [13], [14], [15] Vì các lý do trên, để có điều kiện nghiên cứu, khảo sát và so sánh các phương pháp định lượng nồng độ cồn trong máu và được sự đồng ý của giáo viên hướng dẫn, chúng tôi chọn đề tài Nghiên cứu xác định nồng độ. .. Phƣơng pháp định tính và định lƣợng [3], [4], [6] 1.5.1 Phƣơng pháp định tính: Trong sắc ký thường có hai phương pháp định tính: - Phương pháp 1: Dựa vào thời gian lưu tR của chất cần phân tích và chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích sắc ký - Phương pháp 2: Thêm chuẩn vào mẫu, so sánh cường độ của chất cần phân tích trong mẫu ban đầu và mẫu thêm chuẩn (cường độ tăng) trong cùng điều kiện phân tích sắc. .. chất của pha động mà chúng ta chia thành hai loại sắc ký: - Sắc ký lỏng: Có pha động là chất lỏng, pha động có thể là một loại dung môi hay hỗn hợp nhiều loại dung môi Các phương pháp sắc ký lỏng thông dụng gồm: Sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố và sắc ký ion - Sắc ký khí: Có pha động là khí trơ, không có lực tương tác hóa học hay vật lý với chất cần phân tích Trong phương pháp sắc ký khí, dựa vào đầu 12... suy ra nồng độ mẫu Trong phương pháp này, chúng ta dùng chất chuẩn tinh khiết của chất cần xác định pha thành nhiều nồng độ khác nhau, dựng đường chuẩn theo diện tích peak trên sắc ký đồ và nồng độ chất phân tích Dựa vào đường chuẩn và diện tích peak của chất cần phân tích trên sắc ký đồ có thể suy ra nồng độ chất cần phân tích Phương trình đường chuẩn cho phương pháp ngoại chuẩn: A = kC + b Với: A:... sắc ký 1.5.2 Phƣơng pháp định lƣợng: Diện tích (S) hay chiều cao (S) của peak sắc ký trên sắc ký đồ tỉ lệ thuận với nồng độ của chất, do đó từ diện tích hay chiều cao của peak ta có thể tính được chính xác nồng độ của mỗi hợp chất trong hỗn hợp cần phân tích Có hai phương pháp dùng để định lượng: 1.5.2.1 Phương pháp ngoại chuẩn: So sánh trực tiếp diện tích peak sắc ký của mẫu theo diện tích mũi sắc ký. .. tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ 23 giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích (bao gồm cả các giới hạn này), tại đó được chứng minh là có thể xác định được bởi phương pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính như... Với: A: diện tích peak sắc ký chất phân tích; C: nồng độ chất phân tích 22 1.5.2.2 .Phương pháp nội chuẩn: So sánh gián tiếp peak sắc ký của chất phân tích theo diện tích peak sắc ký của chất chuẩn thông qua diện tích của chất nội chuẩn, từ đó suy ra nồng độ của chất phân tích trong mẫu * Chất nội chuẩn được sử dụng cần có các tính chất: - Có tính chất hoá - lý gần giống với chất cần phân tích - Không... lượng ethanol trong máu được tính bằng phần trăm (%) 11 1.4 Giới thiệu về sắc ký khí [3], [4] 1.4.1 Đại cƣơng về sắc ký: * Sắc ký là một trong những phương pháp phân tích được ứng dụng rộng rãi nhất hiện nay, vì nó là phương pháp có độ nhạy cao và khả năng định lượng tốt, phù hợp để xác định nhiều đối tượng khác nhau như các chất khó hoặc dễ bay hơi, chất phân cực hoặc kém phân cực, Phương pháp này do . trình thực hiện đề tài Nghiên cứu xác định nồng độ cồn trong máu bằng phương pháp sắc ký khí và so sánh với phương pháp phân tích sinh hóa . Tôi đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận. sát và so sánh các phương pháp định lượng nồng độ cồn trong máu và được sự đồng ý của giáo viên hướng dẫn, chúng tôi chọn đề tài Nghiên cứu xác định nồng độ cồn trong máu bằng Phương pháp sắc. Nghiên cứu một số phương pháp định lượng nồng độ cồn trong máu. - Nghiên cứu, khảo sát phương pháp định lượng nồng độ cồn trong máu bằng sắc ký khí (GC-FID), cụ thể là: + Khảo sát một số phương