BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN THỊ NGỌC MAI NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CÁC VITAMIN B 2 , C VÀ E TRONG NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA PHÂN TÍCH NGHỆ AN - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN THỊ NGỌC MAI NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CÁC VITAMIN B 2 , C VÀ E TRONG NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH Mã số: 60.14.01.18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA PHÂN TÍCH Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. TRẦN ĐÌNH THẮNG NGHỆ AN - 2014 LỜI CẢM ƠN Luận văn được thực hiện tại phòng thí nghiệm - Trung tâm thực hành thí nghiệm - Trường Đại Học. Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Phó Giáo sư - Tiến sĩ Trần Đình Thắng, người đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo Th.S Hoàng Văn Trung – Khoa Hóa Học – Trường Đại học Vinh đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho tôi hoàn thành luận văn Tác giả xin chân thành cảm ơn Hội đồng khoa học – khoa Hóa trường Đại học Vinh, các thầy giáo, cô giáo trực tiếp giảng dạy lớp cao học 20 đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi làm nền tảng để thực hiện luận văn này. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu – Các phòng ban – Trung tâm thực hiện thí nghiệm trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu trong một môi trường học tập khoa học. Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, cổ vũ, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn! Vinh, ngày tháng 10 năm 2014 Tác giả Nguyễn Thị Ngọc Mai MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về nấm 3 1.1.1. Giới thiệu về nấm 3 1.1.2. Phân loại nấm 3 1.1.3. Tổng quan về vitamin trong nấm 4 1.1.4. Tầm quan trọng của nấm 5 1.2. Giới thiệu về vitamin – Vitamin B 2 , vitamin C và vitamin E 6 1.2.1.Giới thiệu về vitamin 6 1.2.2. Vitamin B 2 8 1.2.2.1. Lịch sử 8 1.2.2.2. Cấu trúc của vitamin B 2 8 1.2.2.3. Tính chất của vitamin B 2 9 1.2.2.4. Chức năng của vitamin B 2 11 1.2.2.5. Nhu cầu về vitamin B 2 11 1.2.2.6. Nguồn thực phẩm cung cấp vitamin B 2 12 1.2.3. Vitamin C 13 1.2.3.1. Lịch sử 13 1.2.3.2. Cấu trúc vitamin C 14 1.2.3.3. Tính chất của vitamin C 15 1.2.3.4. Chức năng của vitamin C 16 1.2.3.5. Nhu cầu về vitamin C 17 1.2.3.6. Nguồn thực phẩm cung cấp Vitamin C 18 1.2.4. Vitamin E 20 1.2.4.1. Lịch sử 20 1.2.4.2. Cấu trúc của vitamin E 20 1.2.4.3. Tính chất của vitamin E 22 1.2.4.4. Chức năng của vitamin E 23 1.2.4.5. Nhu cầu về vitamin E 24 1.2.4.6. Nguồn thực phẩm cung cấp Vitamin E 24 1.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 25 1.3.1. Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 25 1.3.1.1. Nguyên lý 25 1.3.1.2. Phân loại sắc ký 25 1.3.1.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ 26 1.3.2. Hệ thống HPLC 30 1.3.3. Chọn điều kiện sắc ký 31 1.3.3.1. Lựa chọn pha động 31 1.3.3.2. Lựa chọn pha tĩnh 31 1.3.3.3. Detector 34 1.3.4. Tiến hành đo sắc ký 35 1.3.4.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc 35 1.3.4.2. Chuẩn bị dung môi pha động 35 1.3.5. Định lượng bằng phương pháp HPLC 36 1.3.5.1. Các bước định lượng bằng phương pháp HPLC 36 1.3.5.2. Các phương pháp định lượng 36 Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 38 2.1. Trang thiết bị và dụng cụ 38 2.2. Hóa chất 38 2.3. Thực nghiệm 39 2.3.1. Hình mẫu 39 2.3.2. Vitamin B 2 40 2.3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn vitamin B 2 cho phép đo HPLC 40 2.3.2.2. Sơ đồ xử lý mẫu vitamin B 2 41 2.3.2.3. Cách tiến hành 41 2.3.2.4. Điều kiện sắc ký 42 2.3.3. Vitamin C 42 2.3.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn vitamin C cho phép đo HPLC 42 2.3.3.2. Sơ đồ xử lý mẫu vitamin C 43 2.3.3.3. Cách tiến hành 43 2.3.3.4. Điều kiện sắc ký 44 2.3.4. Vitamin E 44 2.3.4.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn vitamin E cho phép đo HPLC 44 2.3.4.2. Sơ đồ xử lý mẫu vitamin E 45 2.3.4.3. Cách tiến hành 45 2.3.4.4. Điều kiện sắc ký 46 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1. nghiên cứu định lượng vitamin B 2 47 3.1.1. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của vitamin B 2 47 3.1.2. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp phân tích 51 3.1.2.1. Giới hạn phát hiện LOD 51 3.1.2.2. Giới hạn định lượng LOQ 52 3.1.3. Xác định hàm lượng vitamin B 2 trong nấm 52 3.1.4. Đánh giá phương pháp 53 3.1.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp 53 3.1.4.2. Xác định độ thu hồi 55 3.1.5. Các sắc đồ của vitamin B 2 trong phép đo HPLC 56 3.2. Nghiên cứu định lượng vitamin C 58 3.2.1. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của vitamin C 58 3.2.2. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp phân tích 60 3.2.2.1. Giới hạn phát hiện LOD 60 3.2.2.2. Giới hạn định lượng LOQ 61 3.3.3. Xác định hàm lượng vitamin C trong nấm 61 3.2.4. Đánh giá phương pháp 62 3.2.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp 62 3.2.4.2. Xác định độ thu hồi 65 3.2.5. Các sắc đồ của vitamin C trong phép đo HPLC 66 3.3. Nghiên cứu định lượng vitamin E 68 3.3.1. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của vitamin E 68 3.3.2. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp phân tích 71 3.3.2.1. Giới hạn phát hiện LOD 71 3.3.2.2. Giới hạn định lượng LOQ 72 3.3.3. Xác định hàm lượng vitamin E trong nấm 72 3.3.4. Đánh giá phương pháp 73 3.3.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp 73 3.3.4.2. Xác định độ thu hồi 75 3.3.5. Các sắc đồ của vitamin E trong phép đo HPLC 76 KẾT LUẬN 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng anh AA Axit L - ascorbic Acid ascorbic AOAC Hiệp hội các nhà phân tích hóa học chính thống Association of Official Analytical Chemists DHAA Axit dehydro - L - ascorbic Acid dehydro ascorbic IAA Axit isoascorbic Acid isoascorbic FAD Riboflavin -5’- adenosydiphotphat Flavin adenine dinucleotide FLD Detector huỳnh quang Fluorescence detector FMN Riboflavin-5’-photphat Flavin mononucleotide HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High performance liquid chromatography LOD Giới hạn phát hiện Limit of detection LOQ Giới hạn định lượng Limit of quantitation MW Trọng lượng phân tử Molecular weight NP-HPLC Sắc ký hấp phụ pha thường Normal phase – High performance liquid chromatography RDA Khuyến nghị chế độ ăn uống Recommended dietary allowance RP-HPLC Sắc ký hấp phụ pha đảo Reversed phase – High performance liquid chromatography DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Vitamin và khoáng chất chính 4 Bảng 1.2: Hàm lượng vitamin B 2 trong thực phẩm 12 Bảng 1.3: Các dấu hiệu thiếu axit ascorbic 18 Bảng 1.4: Hàm lượng vitamin C trong một số loại rau và trái cây 19 Bảng 1.5: Tổng hàm lượng vitamin C trong một số loại rau và trái cây 20 Bảng 1.6: Danh pháp của một vài α-tocopherol 22 Bảng 3.1: Diện tích của vitamin B 2 tương ứng với từng nồng độ chuẩn 50 Bảng 3.2: Nồng độ chuẩn của vitamin B 2 qua 3 lần đo 51 Bảng 3.3: Kết quả phân tích hàm lượng vitamin B 2 trong nấm 53 Bảng 3.4. Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên các mẫu nấm 54 Bảng 3.5. Kết quả độ thu hồi đối với mẫu nấm lỗ 56 Bảng 3.6: Diện tích của vitamin C tương ứng với từng nồng độ chuẩn 60 Bảng 3.7: Nồng độ chuẩn của vitamin C qua 3 lần đo 61 Bảng 3.8: Kết quả phân tích hàm lượng vitamin C trong nấm 62 Bảng 3.9. Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên các mẫu nấm 63 Bảng 3.10. Kết quả độ thu hồi đối với mẫu nấm 01 65 Bảng 3.11: Diện tích của vitamin E tương ứng với từng nồng độ chuẩn 70 Bảng 3.12: Nồng độ chuẩn của vitamin E qua 3 lần đo 72 Bảng 3.13: Kết quả phân tích hàm lượng vitamin E trong nấm 73 Bảng 3.14. Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên các mẫu nấm 74 Bảng 3.15. Kết quả độ thu hồi đối với mẫu nấm lỗ 76 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1: Cấu trúc của riboflavin, FMN và FAD 9 Hình 1.2: Sản phẩm thoái quang của riboflavin trong môi trường có tính bazơ và axit 10 Hình 1.3: Chất đồng phân lập thể của 2-hexenon-1,4 lactone 14 Hình 1.4: Cấu trúc hóa lập thể của tocol và tocotrienol 21 Hình 1.5: Pic sắc ký và thời gian lưu 27 Hình 1.6: Hệ thống máy sắc ký HPLC agilent 1100 30 Hình 2.1: Mẫu Nấm 01 40 Hình 2.2: Mẫu Nấm lỗ 40 Hình 2.3: Mẫu nấm TH04 40 Hình 2.4: Mẫu HKG 406 40 Hình 2.5: Mẫu nấm HKG 401 40 Hình 3.1: Sắc đồ chuẩn vitamin B 2 có nồng độ 0,1ppm 47 Hình 3.2: Sắc đồ chuẩn vitamin B 2 có nồng độ 0,2ppm 47 Hình 3.3: Sắc đồ chuẩn vitamin B 2 có nồng độ 0,5ppm 48 Hình 3.4: Sắc đồ chuẩn vitamin B 2 có nồng độ 10ppm 48 Hình 3.5: Sắ5c đồ chuẩn vitamin B 2 có nồng độ 20ppm 49 Hình 3.6: Sắc đồ chuẩn vitamin B 2 có nồng độ 50ppm 49 Hình 3.7: Đường chuẩn vitamin B 2 50 Hình 3.8: Sắc đồ mẫu nấm HKG 406 56 Hình 3.9: Sắc đồ mẫu nấm HKG 401 57 Hình 3.10: Sắc đồ mẫu nấm TH04 57 Hình 3.11: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 5ppm 58 Hình 3.12: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 10ppm 58 Hình 3.13: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 20ppm 59 Hình 3.14: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 50ppm 59 Hình 3.15: Đường chuẩn vitamin C 60 Hình 3.16: Sắc đồ của nấm linh HKG 406 66 Hình 3.17: Sắc đồ của nấm 01 không thêm chuẩn 66 Hình 3.18: Sắc đồ của nấm 01 thêm chuẩn 67 Hình 3.19: Sắc đồ của nấm TH04 67 [...]... to lớn với ngành c ng nghiệp th c phẩm, dư c phẩm và rất c n thiết đối với con người Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài Nghiên c u định lượng c c vitamin B2, C và E trong nấm lớn ở vùng B c Trung Bộ bằng phương pháp s c ký lỏng hiệu năng cao HPLC Để th c hiện đề tài chúng tôi th c hiện những nhiệm vụ đặt ra sau: - Tổng quan về c c vitamin B2, C, E và phương pháp x c định c c vitamin. .. colagen, carnitin, norepinephrin, trao đổi chất trytophan, tyrosine, histamine và cholesterol, c c amin hóa c a neuropeptides và phản ứng giải đ c trong gan - Hoạt tính chống oxy hóa liên quan đến vi c chuyển hai electron giữa ascorbat dehydroascorbat, nhường một electron để vô hiệu hóa c c g c tự do c hoạt tính cao Ví dụ như: Bảo vệ vitamin E bằng c ch giảm c c g c tự do tocopheryl 29 - c chế c c phản... B2, C, E - Xây dựng đường chuẩn c a vitamin B2, C, E - Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) c a phương pháp - Định lượng c c vitamin B2, C và Ebằng phương pháp HPLC - X c định hiệu suất thu hồi 15 NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nấm 1.1.1 Giới thiệu về nấm Thật ngữ Nấm đã đư c sử dụng với nhiều c ch kh c nhau tại những thời điểm kh c nhau và ở c c nư c kh c. .. ba vitamin đư c ghi nhận trong chế độ dinh dưỡng ở người và chúng c thể đư c sắp xếp thành hai nhóm theo độ tan c a chúng C c vitamin tan trong chất béo đư c đại diện bởi vitamin A, D, E và K; và c ng bao gồm khoảng 50 carotenoid mà c m c độ hoạt động kh c nhau c a vitamin A C c vitamin tan trong nư c bao gồm vitamin C và c c thành viên nhóm vitamin B, c thể là thiamin (vitamin B 1), riboflavin (vitamin. .. th c dehydro thành L-ascorbic trong hệ thống sinh h c Enzym chuyển đổi c a L-dehydroascobic từ axit ascobic bởi glutathione dehydroganes là một chất bảo vệ quan trọng chống lại sự oxi hóa Axit ascobic c thể bị oxi hóa thông qua sự khử một ho c hai electron Khử một electron là quá trình chuyển hóa thông qua c c axit L-ascorbic g c tự do (axit semihydroascorbic ho c axit monodehydroascorbic) Một electron... trong một loạt c c phản ứng oxy hóa khử sinh h c, chẳng hạn như [32]: - Chuyển đổi glucozo thành axit gluconic và hydrogen peroxit đư c x c t c bởi glucozo oxidase - Oxy hóa c c axit α- amino thành axit keto đư c x c t c bởi D- amino axit oxidase và L – amino axit oxidase - Oxy hóa c a NADH qua hệ s c tố tế bào đư c x c t c bởi khử s c tố tế bào - Oxi hóa axit béo đư c x c t c bởi acyl-coenzym A dehydrogenase... ascorbic hoàn toàn ngăn chặn bởi t c dụng x c t c của sắt (III) và đồng (II) vào quá trình oxi hóa bằng c ch duy trì c c kim loại c a chúng ở trạng thái oxi hóa thấp C c tocotrienol chưa bão hòa nhờ chuỗi bên c a chúng, dễ bị phá hủy hơn so với tocopherol C c vitamin c thể chịu đư c nhiệt trong dung dịch axit ho c kiềm với điều kiện oxi và tia c c tím đư c loại bỏ Bởi vì α-tocopheryl axetat thiếu nhóm hidroxyl... kết trans Trong tự nhiên, c bốn tocopherols và bốn tocotrienols tương ứng; chúng đư c chỉ định là alpha – (α), beta-(β), gamma-(γ) ,và delta-(δ) theo số lượng và vị trí c a themethyl nhóm thế trong vòng chromanol (Hình 1.4) Dạng β- và γ- là c c 33 đồng phân vị trí C c phân tử chứa ba tocopherol trung tâm bất đối ở C- 2, C4 ’, C- 8’, và c tám lập thể Tocotrienols chỉ sở hữu trung tâm bất đối ở C- 2 Hệ thống... B2), niacin, vitamin B6, axit pantothenic, folate và vitamin B12 Đây là c ch phân loại đơn giản phản ánh hoạt tính sinh h c của c c vitamin, như độ hòa tan ảnh hưởng đến phương th c hấp thu đường ruột c a chúng và hấp thu bởi c c tế bào C c đ c tính về độ tan c ng liên quan đến vi c phân bố c c vitamin trong nhóm th c phẩm kh c nhau và ảnh hưởng tr c tiếp đến sử dụng phương pháp phân tích [30] c Hoạt... nghiên c u gọi vitamin E (tocopherol) theo c m từ c a tiếng Hy Lạp ferein c nghĩa là “mang” và tocos c nghĩa là “sinh con”, do đó bản bản chất c a vitamin E làm cho c thể đư c trẻ hóa [39] 1.2.4.2 C u tr c của vitamin E Vitamin E là dẫn xuất thay thế methyl c a protocol, trong đó bao gồm vòng chroman-6-ol gắn ở C- 2 từ chuỗi bên isoprenoit bão hòa Tocotrienols là những c u tr c tương tự mà bên chuỗi chứa . BỘ GIÁO D C VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI H C VINH NGUYỄN THỊ NG C MAI NGHIÊN C U ĐỊNH LƯỢNG C C VITAMIN B 2 , C VÀ E TRONG NẤM LỚN Ở VÙNG B C TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP S C KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC LUẬN. TH C SĨ HÓA PHÂN TÍCH NGHỆ AN - 2014 BỘ GIÁO D C VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI H C VINH NGUYỄN THỊ NG C MAI NGHIÊN C U ĐỊNH LƯỢNG C C VITAMIN B 2 , C VÀ E TRONG NẤM LỚN Ở VÙNG B C TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP. vùng B c Trung Bộ bằng phương pháp s c ký lỏng hiệu năng cao HPLC . Để th c hiện đề tài chúng tôi th c hiện những nhiệm vụ đặt ra sau: - Tổng quan về c c vitamin B 2 , C, E và phương pháp x c định