LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan - Đề tài này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi. - Các số liệu trình bày trong luận văn được thu thập và trình bày một cách trung thực. - Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Tác giả NGUYỄN VĂN SÁU ii LỜI CẢM ƠN! Để hoàn thành luận văn này tôi xin chân thành cảm ơn! Ban lãnh đạo trường Đại học Vinh, Khoa Nông Lâm Ngư, cùng tất cả các thầy, cô giáo đã tận tình truyền đạt kiến thức cho chúng tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo, Tiến sỹ Lê Văn Điệp đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm khoa hóa học trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình phân tích mẫu. Chân thành cảm ơn Ban giám đốc và cán bộ, nhân viên, công nhân Trung tâm phát triển nấm ăn và nấm dược liệu Hà Tĩnh đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình bố trí thí nghiệm và thu thập số liệu. Biết ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Nghệ An, tháng 9 năm 2014 Tác giả NGUYỄN VĂN SÁU iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN! ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vii MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu 2 3.1. Đối tượng nghiên cứu 2 3.2. Phạm vi nghiên cứu 4 3.3. Nội dung nghiên cứu 4 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4 Chương 1 5 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Cơ sở khoa học 5 1.1.1. Giới thiệu sơ lược về nấm 5 1.1.2. Sự phát triển của sợi nấm 6 1.1.3. Các giai đoạn phát triển của sợi nấm 8 1.1.4. Giá trị của nấm 9 1.1.5. Giới thiệu về nấm Garnodema lucidum Karst 10 1.1.6. Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Garnodema lucidum 11 1.1.7. Điều kiện sống của nấm Garnodema lucidum 13 1.1.8. Thành phần hóa học chủ yếu của nấm Linh chi 14 1.1.9. Nguyên liệu trồng nấm Linh chi 20 1.1.10. Khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi 21 1.1.11. Giới thiệu sơ lược về hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi 25 1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 29 1.3. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 31 Chương 2 33 iv VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. Vật liệu nghiên cứu 33 1.1.1. Môi trường sử dụng 33 2.1.2. Thiết bị 34 2.1.3. Hóa chất 34 2.2. Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1. Phương pháp thực nghiệm 34 2.2.2. Phương pháp xử lý số liệu 37 2.3. Thời gian và địa điểm thí nghiệm 37 Chương 3 38 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Tốc độ phát triển của hệ sợi nấm Linh chi trên môi trường nhân giống cấp 1 38 3.1.1. Đánh giá sự phát triển của hệ sợi nấm Linh chi HKG401 và HKG404 trên môi trường nhân giống cấp 1 (môi tường thạch) 38 3.1.2. Đánh giá sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm HKG401 và HKG404. 41 3.1.3. Đánh giá ảnh hưởng của pH đến quá trình phát triển của hệ sợi nấm. 43 3.2. Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm HKG401 và HKG404 trên môi trường nhân giống cấp 2 45 3.3. Sự sinh trưởng của nấm Linh chi trên các môi trường giá thể mùn cưa cao su 47 3.3.1. Thời gian sinh trưởng hệ sợi nấm từ khi cấy đến giai đoạn lan kín bịch 49 3.4. Mức độ nhiễm nấm dại trong quá trình nuôi trồng các loại nấm trên các môi trường khác nhau. 55 3.5. Đặc điểm về hình thái của quả thể nấm HKG401 và HKG404 trên các môi trường nuôi trồng 58 3.6. Năng suất nấm HKG401 và HKG404 được nuôi trồng trên giá thể mùn cưa cao su 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 Kết luận 65 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT PGA: Potato + Glucosese + Agar MNP: (Most Probable Number Method) Đơn vị hình thành khuẩn lạc TSVSVHK: Tổng số vi sinh vật hiếu khí KPHĐ: Không phát hiện được HKG: Hồ Kẻ Gỗ CT: Công thức MT: Môi trường vi DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU Bảng 1.1. Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh chi 14 Bảng 1.2. Hàm lượng các chất có trong mùn cưa 20 Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng trong cám 21 Bảng 1.4. Lục bảo Linh chi và tác dụng trị liệu. 22 Bảng 1.5. Một số bài thuốc chữa bệnh của nấm Linh chi 25 Bảng 1.6. Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) 27 Bảng 3.1. Chiều dài hệ sợi nấm lan trên môi trường nhân giống cấp 1 38 Bảng 3.2. Sự phát triển của hệ sợi nấm ở các nhiệt độ khác nhau 41 Bảng 3.3. Sự phát triển của hệ sợi nấm ở các pH khác nhau 43 Bảng 3.4. Chiều dài hệ sợi lan trên môi trường nhân giống cấp 2 45 Bảng 3.5. Thời gian sinh trưởng của hệ sợi từ khi cấy giống đến khi lan kín bịch 49 Bảng 3.6. Thời gian phát triển của quả thể nấm linh chi 51 Bảng 3.7. Mức độ nhiễm nấm dại của các loại nấm trên các môi trường khác nhau 56 Bảng 3.8. Kích thước quả thể nấm 58 Bảng 3.9. Năng suất của các loại nấm trên các môi trường nuôi trồng khác nhau. 61 Bảng 3.10. Hàm lượng một số axid amin có trên quả thể nấm 62 Bảng 3.11. Số lượng một số vi sinh vật có trên quả thể nấm linh chi HKG401 và HKG404. 63 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1. Hình thái quả thể nấm HKG401 3 Hình 2. Hình thái quả thể nấm HKG404 3 Hình 1.1. Hình thái nấm Garnodema lucidum 13 Hình 1.2. Chu trình phát triển của nấm Garnodema lucidum Karst 13 Hình 1.3: Công thức của một số triterpene trong nấm linh chi 18 Hình 3.1. Chiều dài hệ sợi nấm lan trên môi trường nhân giống cấp 1 theo thời gian 39 Hình 3.2. Ống nghiệm đựng môi trường cấp 1 trước khi đưa vào hấp thanh trùng. 29 Hình 3.3. Hệ sợi nấm phát triển trong ống nghiệm 40 Hình 3.4. Biểu diễn sự phát triển của hệ sợi nấm ở các nhiệt độ khác nhau 42 Hình 3.5. Biểu diễn sự phát triển của hệ sợi nấm ở các pH khác nhau 44 Hình 3.6. Biểu diễn chiều dài hệ sợi lan trên môi trường nhân giống cấp 2 46 Hình 3.7. Nấm HKG401 và HKG404 trên các môi trường cấp 2 47 Hình 3.8. Quy trình nuôi trồng nấm Linh chi 48 Hình 3.9. Biểu diễn hệ sợi nấm từ khi cấy giống đến khi kín bịch. 49 Hình 3.10. Nấm HKG401 và HKG404 ở giai đoạn ươm sợi 50 Hình 3.11. Các giai đoạn phát triển của quả thể nấm ở các môi trường khác nhau. 51 Hình 3.12. Quả thể nấm ở giai đoạn trưởng thành 54 Hình 3.13. Biểu diễn thời gian sinh trưởng và phát triển của nấm HKG401 và HKG404 qua các giai đoạn 54 Hình 3.14. Biểu diễn mức độ nhiễm nấm dại ở các công thúc thí nghiệm khác nhau 56 Hình 3.15. Các bịch nấm bị nhiễm nấm dại 57 Hình 3.16. Biểu diễn kích thước quả thể nấm ở các môi trường thí nghiệm khác nhau 59 Hình 3.17. Biểu diễn năng suất quả thể nấm 62 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum Karst.) là một trong những dược thảo quý, quan trọng nhất trong y học cổ truyền [55]. Số lượng các loài nấm Linh chi được sữ dụng trong công nghệ dược liệu ngày càng tăng, đặc biệt ở các quốc gia Á Đông [7]. Nấm Linh chi được dùng điều trị các chứng mệt mỏi, suy nhược, tiểu đường, các chứng bệnh về gan, và làm tăng sức đề kháng của cơ thể. Hiện nay, Linh chi còn được dùng để điều hòa huyết áp, lọc máu, và giúp cơ thể chống lại các chứng bệnh lao lực quá độ. Ngoài ra linh chi còn được dùng để chữa bệnh mất ngủ, loét dạ dày, tê thấp, suyễn, viêm họng [24]. Với giá trị vượt trội về mặt dược liệu nên nhu cầu sữ dụng nấm Linh chi ngày càng tăng trong khi đó nguồn nấm Linh chi tự nhiên ngày một khan hiếm. Từ nhiều năm qua các nhà khoa học trong nước và trên thế giới đã nghiên cứu, chọn lọc và nuôi trồng thành công nhiều loài nấm linh chi góp phần đáp ứng nhu cầu thị trường, tăng thu nhập cho người nông dân và góp phần bảo vệ môi trường thông qua việc sữ dụng các nguồn nguyên liệu sẵn có trong tự nhiên và sữ dụng các phế thải trong sản xuất nông nghiệp. Ở Hà Tĩnh nghề trồng nấm nói chung và trồng nấm Linh chi nói riêng được bắt đầu từ năm 2002, khi đó mới chỉ là những thử nghiệm ban đầu với rất nhiều khó khăn. Trải qua hơn mười năm tồn tại và phát triển, đến thời điểm hiện nay nấm Linh chi đã được nuôi trồng ở tất cả 12 Huyện, Thị xã, Thành phố trên toàn tỉnh. Công nghệ sản xuất nấm Linh chi ở Hà Tĩnh ngày càng được hoàn thiện, năng suất và chất lượng nấm từng bước được nâng lên góp phần nâng cao thu nhập cho nhiều hộ dân. Nguồn giống nấm Linh chi người dân Hà Tĩnh hiện nay sản xuất là nguồn giống do Trung tâm Công nghệ Sinh học thực vật thuộc Viện di 2 truyền Nông nghiệp chọn tạo nhân giống từ nấm Linh chi tự nhiên được thu thập ở rừng thuộc các tỉnh phía Bắc. Do cách xa về vị trí địa lý và khác nhau về điều kiện khí hậu nên mặc dù các giống nấm do Viện di truyền nông nghiệp cung cấp đã được huấn luyện để phù hợp hơn với điều kiện khí hậu vùng Bắc Trung Bộ nhưng các giống nấm vẫn chưa thật sự thích nghi với điều kiện khí hậu Hà Tĩnh nên quá trình sinh trưởng, phát triển của nấm có phần hạn chế. Trong khi đó Hà Tĩnh có hơn 200.000ha rừng, với sự phong phú và đa dạng về động, thực vật và có các loài nấm Linh chi quý đã được người dân thu thập và sữ dụng. Nguồn nấm linh chi mọc ở rừng Hà Tĩnh là loài nấm phù hợp với điều kiện sinh thái ở Hà Tĩnh, nếu được nuôi trồng tại Hà Tĩnh sẽ là điều kiện tốt nhất để các loài nấm sinh trưởng và phát triển, tuy nhiên để đưa được nấm tự nhiên về nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo cần có các nghiên cứu khoa học thực hiện một cách bài bản. Do đó việc nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng nấm Linh chi ngay ở vùng xuất xứ của nấm là hết sức cần thiết. Chính vì vậy chúng tôi thực hiện Đề tài “Nghiên cứu nhân nuôi hai chủng nấm Linh chi thu thập từ Khu bảo tồn thiên nhiên Kẻ Gỗ” 2. Mục đích nghiên cứu - Lựa chọn môi trường nhân giống cấp 1, môi trường nhân giống cấp 2 thích hợp cho hệ sợi nấm phát triển. - Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và khả năng cho năng suất của nấm Linh chi thu thập tại khu bảo tồn thiên nhiên Kẻ Gỗ trên môi trường mùn cưa cao su ở điều kiện Hà Tĩnh. 3. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu 3 Hai chủng nấm linh chi tạm thời ký hiệu HKG401 và HKG404 thu hái vào tháng 4 năm 2013 tại Khu bảo tồn thiên nhiên Kẻ Gỗ tỉnh Hà Tĩnh đã được phân lập tại phòng thí nghiệm Khoa hóa học trường Đại học Vinh. 3.1.1. Hình thái quả thể nấm HKG401 a) Mặt dưới quả thể nấm b) Mặt trên quả thể nấm Hình 1. Hình thái quả thể nấm HKG401 Quả thể nấm HKG401 được tìm thấy trên một khúc gỗ lim dài 1,2m đã bị chặt hạ từ trước. Tại thời điểm tìm thấy, quả thể nấm mặt trên màu nâu sẫm, có hình lượn sóng, mặt dưới phẳng và có màu cát sẩm. Chân nấm ngắn, bám rất chặt vào thân gỗ, tán nấm xòe dạng hình quạt. 3.1.2. Hình thái quả thể nấm HKG404 a) Mặt trên quả thể nấm b) Mặt dưới quả thể nấm Hình 2. Hình thái quả thể nấm HKG404 [...]... sợi nấm của hai đối tượng nấm Linh chi thu thập từ khu bảo tồn thiên nhiên Kẻ Gỗ - Xác định môi trường cơ chất nuôi trồng thích hợp với nấm Linh chi HKG401 và HKG404 được thu thập ở khu bảo tồn thiên nhiên Kẻ Gỗ 4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Cung cấp các dẫn liệu khoa học về môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy và các đặc điểm sinh trưởng của nấm Linh chi thu thập ở Khu bảo tồn Thiên. .. khác nhau: - Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi) - Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi) - Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi) - Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi) - Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi) 11 - Tử chi (Linh chi tím) Trong số các loài Linh chi tìm thấy cho đến nay thì xích chi (Ganoderma lucidum) được nghiên cứu y dược chi tiết nhất Loài chuẩn Ganoderma lucidum có... Quả thể nấm HKG404 đươc tìm thấy trong rừng tre ở Khu bảo tồn thiên nhiên Kẻ Gỗ, nấm có chân dài màu sắc khá đẹp mắt, mặt trên màu vàng cam nhẵn bóng, mặt dưới phẳng màu hơi trắng, nấm có dạng hình bầu dục và cuống nấm nằm về một đầu 3.2 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu môi trường nuôi cấy quả thể nấm Linh chi theo hướng ứng dụng, bước đầu đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của nấm Linh chi trong... Hai đối tượng nấm linh chi được thu thập ở khu bảo tồn thiên nhiên Kẻ Gỗ Đã được phân lập tại phòng thí nghiệm vi sinh vật khoa Hoá học, Trường Đại học Vinh - Quá trình nhân giống, nuôi trồng và khảo sát quá trình ra quả thể của hai đối tượng nấm được thực hiện tại Trung tâm phát triển nấm ăn và nấm dược liệu Hà Tĩnh 3.3 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu lựa chọn môi trường nhân giống cấp một, cấp hai. .. nguyên tố vi lượng đậm đặc hơn linh chi rừ khoảng 7 - 20 lần [24] Khi linh chi phóng thích bào tử sẽ thấy từng lớp bào tử bay lên như khói bám vào bề mặt trên linh chi tạo thành một lớp bụi màu nâu đỏ rất mịn như đất đỏ bazan Tuy vậy số lượng bào tử nấm linh chi rất nhỏ Khi thu hoạch 1 tấn nấm linh chi sẽ thu được 1kg bào tử Tác dụng của bào tử giống như tác dụng của nấm linh chi Thường một số sản phẩm... liệu trồng nấm Linh chi Linh chi là loài nấm phá gỗ mạnh, có khả năng sử dụng trực tiếp nguồn cellulose Do đó, nguyên liệu nào có cellulose thì nấm Linh chi có thể sống và phát triển Tại Đài Loan, Linh chi được trồng trên gỗ họ Long não để điều trị ung thư, khối u Nhiều nơi khác đã dùng mùn cưa tươi, mùn cưa khô của các loại gỗ mềm, không có tinh dầu và độc tố Ngoài ra có thể trồng Linh chi trên rơm,... tán xạ từ mọi phía Nhiệt độ không nên thay đổi quá lớn, nếu thay đổi nấm Linh chi khó phát triển thành tán mà ở dạng sừng hươu, đuôi gà (Trịnh Tam Kiệt, 1983) 1.1.8 Thành phần hóa học chủ yếu của nấm Linh chi Theo Wachtel-Galor et al (2011) trong nấm linh chi tươi, nước là thành phần chủ yếu chi m 90% khối lượng Trong 10% còn lại thì protein chi m 10- 40%, chất béo chi m từ 2- 8%, carbonhydrate chi m... Công thức của một số triterpene trong nấm linh chi Nấm linh chi rất giàu hàm lượng các triterpene, những chất này cũng góp phần tạo nên vị đắng của nấm linh chi Chúng mang nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe, như khả năng chống oxy hóa và giảm hàm lượng chất béo trong cơ thể Tuy nhiên, hàm lượng triterpene trong nấm linh chi lại không ổn định Chúng phụ thu c rất nhiều vào giống, loài, nơi trồng,... trình nấm phát triển cũng ảnh hưởng khá lớn đến thành phần hoạt chất của nấm Địa điểm sinh trưởng của nấm linh chi cũng được xem là yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng của các hoạt chất sinh học có trong nấm linh chi Trong một nghiên cứu về hoạt tính sinh học của 11 mẫu sản phẩm nấm linh chi được trồng ở Nhật Bản, người ta nhận thấy sự chênh lệch về hàm lượng triterpenoid giữa các mẫu dao động trong khoảng từ. .. coi là hiệu quả nhất (Wang C.H, 1985) Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu Selenium - một yếu tố khoáng có hoạt tính antioxydant rất mạnh - vào nấm Linh chi Chính vì vậy con người có thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ, trẻ hoá từ nấm Linh chi nói chung và Linh chi Việt Nam nói riêng [6] Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do sinh ra . và nuôi trồng nấm Linh chi ngay ở vùng xuất xứ của nấm là hết sức cần thiết. Chính vì vậy chúng tôi thực hiện Đề tài Nghiên cứu nhân nuôi hai chủng nấm Linh chi thu thập từ Khu bảo tồn thiên. trường nhân giống cấp một, cấp hai phù hợp với sự phát triển của hệ sợi nấm của hai đối tượng nấm Linh chi thu thập từ khu bảo tồn thiên nhiên Kẻ Gỗ. - Xác định môi trường cơ chất nuôi trồng. điều kiện nuôi cấy và các đặc điểm sinh trưởng của nấm Linh chi thu thập ở Khu bảo tồn Thiên Nhiên Kẻ Gỗ. - Làm cơ sở cho việc nhân giống, cung cấp cho quá trình sản xuất nấm Linh chi ở Hà