i Bộ giáo dục và đào tạo Tr-ờng đại học s- phạm hà nội 2 ================================= Hoàng thị thủy Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và b-ớc đầu chuyển gen chỉ thị vào cây khoai tây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens luận văn thạc sĩ sinh học Hà nội, 2010 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Huy Hàm, Viện trưởng Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Thị Lý Thu là người thầy đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự đào tạo và giúp đỡ nhiệt tình của các giáo viên Bộ môn sinh – Trường đại học sư phạm Hà Nội 2, những người thầy đã dạy tôi trong suốt quá trình học tập để tôi hoàn thành chương trình các môn học cao học. Đồng thời tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của tập thể cán bộ khoa học của Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp. Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình tôi đã luôn luôn bên tôi, quan tâm và tạo điều kiện tốt cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự động viên, khích lệ của các đồng nghiệp và bạn bè đã dành cho tôi. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những sự giúp đỡ quý báu đó. Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 2010 Học viên Hoàng Thị Thủy iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 2010 Tác giả Hoàng Thị Thủy iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây 4 1.1.1. Hệ thống phân loại cây khoai tây 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái 4 1.2. Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào 5 1.2.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật 6 1.2.2. Các hướng tái sinh cây từ mô thực vật 7 1.2.3. Tái sinh cây khoai tây 8 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro 8 1.3. Cơ sở khoa học của công nghệ chuyển gen vào thực vật 11 1.3.1. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 11 1.3.2. Hệ thống vector chuyển gen 21 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 23 1.4.1. Các nghiên cứu sản xuất, nhân giống khoai tây 23 1.4.2. Một số thành tựu về cây trồng biến đổi gen 25 Chƣơng 2 29 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1. Vật liệu nghiên cứu 29 v 2.1.1 Vật liệu thực vật 29 2.2.2 Vật liệu di truyền 29 2.2. Nội dung nghiên cứu 30 2.2.1. Các nghiên cứu tạo callus và tái sinh chồi 30 2.2.2. Nghiên cứu tái sinh chồi 30 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 31 2.3.1. Phương pháp thiết kế thí nghiệm 31 2.3.2. Phương pháp chuẩn bị mẫu thực vật 32 2.3.3 Phương pháp chuẩn bị dịch vi khuẩn 32 2.3.4. Phương pháp chuyển gen 33 2.3.5. Môi trường nuôi cấy 34 2.3.6. Phương pháp đánh giá biểu hiện gen gus tạm thời 35 2.4. Bố trí thí nghiệm 35 2.4.1. Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh 35 2.4.2. Nghiên cứu chuyển gen vào khoai tây thông qua Agrobacterium tumefaciens 37 2.5. Các chỉ tiêu đánh giá 39 2.6. Xử lý số liệu 39 2.7. Thiết bị nghiên cứu 39 2.8. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 39 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40 3.1. Xây dựng quy trình tạo callus và tái sinh cây ở khoai tây 40 3.1.1. Ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ các dạng mô khác nhau ở cây khoai tây 40 3.1.2. Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus ở khoai tây 42 3.1.3. Ảnh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus ở khoai tây 46 3.1.4. Ảnh hưởng của xaccarozơ tới khả năng tạo callus ở khoai tây 49 3.1.5. Ảnh hưởng của Casein hydrolysate (CH) tới khả năng tạo callus 52 3.1.6. Nghiên cứu tái sinh chồi 55 vi 3.2. Nghiên cứu chuyển gen vào khoai tây thông qua Agrobacterium tumefaciens 56 3.2.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp cho chuyển gen ở giống khoai tây Atlantic. 56 3.2.2. Lựa chọn vector thích hợp cho chuyển gen vào cây khoai tây thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 59 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD 600nm ) lên tỉ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus 61 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) lên tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus 62 63 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 Phụ lục1: Thành phần môi trƣờng MS (Murashige and Skoogs, 1972) 73 Phụ lục 2: Thành phần môi trƣờng N6 (Chu và cộng sự, 1975) 74 Phụ lục 3: Môi trƣờng nuôi cấy sử dụng trong nghiên cứu 76 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT & cs và cộng sự 2,4D Dichlorophenoxy acetic acid AS Acetosyringone BAP 6- Benzyl amino purin bar Gen mã hóa tổng hợp phosphinothricin acetyl transferase ĐHST Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật GA Gibberellic Acid gus Gen mã hóa tổng hợp β-glucuronidase IAA β- Indole- Acetic Acid Kinetin 6- furfuryl amino purin LB Luria Bertani Medium MS Murahige and Skoogs, (1962) NAA Napthalene acetic acid N6 Chu & cs, 1975 viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ mô lá cây khoai tây. 40 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ đoạn thân 41 cây khoai tây 41 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ mô lá cây khoai tây. 43 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 45 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây. 48 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của xaccarozơ tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây. 51 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của casein hydrolysate tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 54 Bảng 3.12. Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen ở giống khoai tây Atlantic. 56 Bảng 3.13. 59 cây khoai tây Atlantic thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 59 Bảng 3.14. Lựa chọn vector thích hợp cho chuyển gen vào đoạn thân 60 cây khoai tây Atlantic thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 60 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở cây khoai tây chuyển gen 61 64 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1.Cấu trúc Ti-plasmid 18 Hình 1.2. Cấu trúc đoạn T-DNA 18 Hình 1.3. Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật 19 Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể 21 Hình 1.5. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp 23 Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1301 29 Hình 2.2. Cấu trúc vector p6d35S-GUS 30 Hình 3.1. Ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ mô lá 41 cây khoai tây (1.Môi trường: N6; 2. Môi trường: MS) 41 Hình 3.2. Ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ đoạn thân khoai tây (3. Môi trường: N6; 4. Môi trường: MS) 42 Hình 3.3. Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ mô lá cây khoai tây 44 CT1(1); CT9(2); CT(7) 44 Hình 3.4. Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây CT1(1); CT9(2); CT(6) 46 Hình 3.5. Ảnh hưởng của xytokinin tới khả năng tạo callus từ mô lá cây khoai tây 48 Hình 3.6. Ảnh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 49 Hình 3.7. Ảnh hưởng của xaccarozơ tới khả năng tạo callus từ mẫu lá cây khoai tây 51 Hình 3.8. Ảnh hưởng của xaccarozơ tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 52 Hình 3.9. Ảnh hưởng của casein hydrolysate tới khả năng tạo callus từ mẫu lá cây khoai tây 53 Hình 3.10. Ảnh hưởng của casein hydrolysate tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 54 x Hình3.11. Tái sinh chồi từ mẫu callus tạo thành từ đoạn thân cây khoai tây Attlantic 56 Hình 3.12. Biểu hiện tạm thời của gen gus trên mẫu lá khoai tây Atlantic sau khi lây nhiễm với các chủng vi khuẩn A. tumefaciens khác nhau. 58 Hình 3.13. Biểu hiện tạm thời của gen gus trên đoạn thân khoai tây Atlantic sau khi lây nhiễm với các chủng vi khuẩn A. tumefaciens khác nhau. 58 Hình 3.14. Lựa chọn vector chuyển gen thích hợp vào mẫu lá khoai tây Atlantic(AA39: p6d35S-GUS; AA43: pCAMBIA1301) 60 Hình 3.15. Lựa chọn vector chuyển gen thích hợp vào đoạn thân khoai tây Atlantic (AA39: pCAMBIA1301; AA43: p6d35S-GUS) 60 Hình 3.16. Ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus lên mẫu lá khoai tây 63 Hình 3.17. Ảnh hưởng của hàm lượng AS lên tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở thân khoai tây 63 Hình 3.18. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm lên tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở đoạn thân khoai tây 65 [...]... Mục đích nghiên cứu - Xây dựng được quy trình tạo callus và tái sinh cây từ các dạng mẫu mô khác nhau của cây khoai tây - Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ở cây khoai tây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 3 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình tạo callus và tái sinh cây như: nền khoáng, chất ĐHST, xaccarozơ, casein hydrolysate Nghiên cứu ảnh hưởng của một... thuyết khoa học - Xây dựng được quy trình tạo callus và tái sinh cây từ các dạng mẫu mô khác nhau của cây khoai tây - Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ở cây khoai tây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây 1.1.1 Hệ thống phân loại cây khoai tây Khoai tây - Solanum tuberosum L., thuộc họ Cà - Solanaceae Giới (regnum): Plant... thấp và diện tích trồng giảm dần là do thiếu nguồn củ giống tốt Củ giống trồng phổ biến là loại củ giống chất lượng thấp (tỷ lệ nhiễm bệnh virus cao, già sinh lý và độ thuần chủng thấp) [53] Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài:“ Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và bước đầu chuyển gen chỉ thị vào cây khoai tây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens“ 2 Mục đích nghiên cứu. .. sàng lọc và khả năng tái sinh hoàn chỉnh cây chuyển gen từ các tế bào và mô mang gen chuyển nạp Đối với phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium thì tần số biến nạp phụ thuộc vào các yếu tố liên quan đến vi khuẩn, các yếu tố liên quan đến thực vật và một số các yếu tố khác Các yếu tố liên quan đến vi khuẩn bao gồm: chủng vi khuẩn, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, hoạt tính của gen vir, khả... phát triển thành khối callus và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Ứng dụng có ý nghĩa nhất ở phương pháp này là tạo cây lai tế bào chất thông qua dung hợp protoplast và úng dụng để biến nạp gen [11] Ngoài ra, hệ thống tái sinh cây thông qua tạo đa chồi từ mảnh lá hoặc đoạn thân không có chồi bên, cũng có thể được sử dụng để chuyển gen 1.2.3 Tái sinh cây khoai tây Tái sinh cây in vitro với hiệu suất cao được... của chất điều hoà sinh trưởng và các yếu tố bắt buộc ở môi trường chọn lọc Hiện nay, đã có một số công trình nghiên cứu tái sinh thành công cây khoai tây in vitro từ các nguyên liệu như thân, lá thông qua con đường nuôi cấy thuỷ canh in vitro phục vụ sản xuất củ bi khoai tây (Solanum tuberosum L.) và vi ghép in vitro cây cà chua (Lycopersicum esculentum) và cây khoai tây( Solanum tuberosum) [10] 1.2.4... hay lông rễ, cài xen vào vùng T-DNA những gen thích hợp, gen này sẽ được chuyển và gắn vào hệ gen tế bào thực vật dễ dàng Những phát hiện này có ý nghĩa rất quan trọng cho sự ra đời của phương pháp chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn A tumefaciens Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium đã được áp dụng thành công trên nhiều đối tượng cây trồng đặc biệt là cây hai lá mầm như: khoai tây, cà chua, thuốc... trình biến nạp gen vào cây khoai tây thông qua A tumefacines như: Chủng vi khuẩn Agrobacterium thích hợp cho biến nạp gen, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, AS 4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài *Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về khả năng tái sinh, khả năng tiếp nhận gen từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở một số giống khoai tây 3 * Ý nghĩa... quy trình tạo cây chuyển gen Nhiều nhà nghiên cứu thực nghiệm đã thu được tế bào sống sót trên môi trường chọn lọc nhưng lại không tái sinh được cây hoàn chỉnh Do vậy hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy mô và tái sinh được cây hoàn chỉnh là công vi c quan trọng đầu tiên khi tiến hành biến nạp gen Một trong yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy và tái sinh cây như: Nguồn mẫu vật nuôi cấy, môi trường và điều kiện nuôi... T-DNA mang gen quan tâm được chuyển đồng thời với các gen mã hoá protein 16 virD 1và virD2 vào tế bào thực vật bằng kỹ thuật bắn gen, nhờ đó kích thích sự gắn kết của T-DNA trong hệ gen thực vật [44] 1.3.1.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp  Chuyển gen nhờ virus Virus được sử dụng làm vector chuyển gen cho cây trồng do rất dễ thâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật Mặt khác trong cấu tạo của virus cũng . hành đề tài:“ Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và bước đầu chuyển gen chỉ thị vào cây khoai tây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens“. 2. Mục đích nghiên cứu - Xây dựng được quy. callus và tái sinh cây từ các dạng mẫu mô khác nhau của cây khoai tây. - Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ở cây khoai tây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 3. Nội dung nghiên cứu Nghiên. đầu nghiên cứu chuyển gen ở cây khoai tây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây 1.1.1. Hệ thống