TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN HOÀNG THỊ THANH MÙI PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU VI KHUẨN LACTIC SINH AXIT LACTIC CAO TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. TRẦN THỊ THÚY HÀ NỘI, 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN HOÀNG THỊ THANH MÙI PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU VI KHUẨN LACTIC SINH AXIT LACTIC CAO TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. TRẦN THỊ THÚY HÀ NỘI, 2014 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến TS. Trần Thị Thúy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo cũng nhƣ truyền dạy những kinh nghiệm quý báu, ngƣời đã quan tâm và giúp đỡ em nhiệt thành trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài. Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung - Tổ trƣởng bộ môn Vi sinh, Khoa Sinh-KTNN-Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội 2, đã dạy cho em những bài học đầu tiên về Vi sinh, qua đó truyền cảm hứng cũng nhƣ niềm đam mê đƣợc thử sức với lĩnh vực này. Em cảm ơn cô đã tạo điều kiện cho em có đƣợc môi trƣờng làm việc tốt và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và các cán bộ phòng thí nghiệm CNSH - Vi sinh, khoa Sinh học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại tổ bộ môn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, động viên, cũng nhƣ những góp ý quý báu của các anh/chị và các bạn cùng làm việc trên phòng thí nghiệm. Cuối cùng tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những ngƣời đã tiếp thêm niềm tin, yêu thƣơng- mẹ và em trai - đã tƣ vấn, giúp đỡ con rất nhiều, cảm ơn những ngƣời bạn thân đã động viên tôi trong suốt quá trình. Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Hoàng Thị Thanh Mùi LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với các tác giả khác. Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Hoàng Thị Thanh Mùi CÁC TỪ VIẾT TẮT CFU : Colony Forming Unit Cs : Cộng sự ĐC : Đối chứng EM : Effective microorganism G + : Gram dƣơng G - : Gram âm GRAS : Generally Regarded As Safe GYP : Glucose-Yeast extract-Peptone OD : Optical Density (mật độ quang) MRS : de Man - Rogosa - Sharpe Nxb : Nhà xuất bản STT : Số thứ tự VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH DANH MỤC HÌNH Hình 1.1.Các kiểu lên men lactic 6 Hình 1.2. Cấu trúc axit lactic 6 Hình 1.3. Hai loại đồng phân của axit lactic 7 Hình 2.4. Chuẩn độ bằng buret (a) và màu dung dịch sau chuẩn độ bằng dung dịch NaOH với sự có mặt của thuốc thử phnolphthalein (b) 15 Hình 2.5. Đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào/ml dịch nuôi và OD 600 của chủng T6 17 Hình 2.6. Đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào/ml dịch nuôi và OD 600 của chủng TH2 18 Hình 3.7. Phân lập vi khuẩn lactic trên đĩa Petri môi trƣờng MRS 20 Hình 3.8. Kiểm tra hoạt tính catalase của chủng vi khuẩn lactic TH2 (a) và thí nghiệm đối chứng trên vi khuẩn E. coli 28 Hình 3.9. Chủng TH2 và T6 đƣợc nuôi trong ống Durham sau 48 giờ 28 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự sinh trƣởng, phát triển và sinh axit tổng số của chủng TH2 32 Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trƣởng, phát triển và sinh axit tổng số của chủng T6 33 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng MRS 12 Bảng 2.2. Thành phần môi trƣờng GYP 12 Bảng 3.3. Một số đặc điểm sinh học của 33 chủng vi khuẩn lactic 21 Bảng 3.4. Sự sinh trƣởng, phát triển và sinh tổng hợp axit lactic của 10 chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn 25 Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn 26 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của pH ban đầu đến sinh trƣởng, phát triển và sinh axit tổng số của chủng TH2 30 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của pH ban đầu đến sinh trƣởng, phát triển và sinh axit tổng số của chủng T6 31 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng tự nhiên và môi trƣờng bán tổng hợp đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 34 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng cải tiến đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 36 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của tỷ lệ nƣớc chiết bắp cải và môi trƣờng MRS đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 37 MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………. 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 2 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2 5. Phƣơng pháp nghiên cứu 2 6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 7. Những đóng góp mới của đề tài 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Vi khuẩn lactic 4 1.1.1. Lƣợc sử nghiên cứu vi khuẩn lactic 4 1.1.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 4 1.1.3. Các kiểu lên men lactic ở vi khuẩn lactic 5 1.2. Axit lactic 6 1.3. Ứng dụng của vi khuẩn lactic 7 1.3.1. Sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất axit lactic 7 1.3.2. Sử dụng vi khuẩn lactic trong nông nghiệp và môi trƣờng 8 1.3.3. Sử dụng vi khuẩn lactic trong công nghiệp chế biến bảo quản rau quả, thịt và thức ăn gia súc 9 1.3.4. Sử dụng vi khuẩn lactic trong y học 10 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1. Vật liệu và thiết bị 11 2.1.1. Vi sinh vật 11 2.1.2. Máy móc, thiết bị 11 2.1.3. Hóa chất 11 2.1.4. Môi trƣờng 12 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 13 2.2.1. Phƣơng pháp làm mẫu phân lập 13 2.2.2. Phân lập vi khuẩn lactic 13 2.2.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao 14 2.2.4. Xác định axit tổng số 14 2.2.5. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn 15 2.2.5.1. Quan sát tế bào trên tiêu bản nhuộm đơn 15 2.2.5.2. Quan sát tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram 16 2.2.6. Bảo quản chủng giống 16 2.2.6.1. Bảo quản trên thạch nghiêng 16 2.2.6.2. Bảo quản trong dung dịch 30% glycerin 16 2.2.6.3. Phƣơng pháp ria thuần chủng chủng giống 16 2.2.7. Phƣơng pháp xây dựng đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy với giá trị OD 600 16 2.2.8. Các phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa và khả năng sinh axit lactic của chủng đƣợc tuyển chọn 18 2.2.8.1. Phƣơng pháp xác định hoạt tính catalase 18 2.2.8.2. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh khí từ glucose 18 2.2.8.3. Xác định ảnh hƣởng của các yếu tố lý hóa và môi trƣờng nuôi cấy tới sự sinh trƣởng, phát triển và sinh axit lactic 19 2.2.9. Phƣơng pháp thống kê và xử lí kết quả CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20 3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống và sơ tuyển các chủng sinh axit lactic cao 20 3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic cao 24 3.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn lactic TH2 và T6 25 3.4. Ảnh hƣởng của một số yếu tố lý hóa đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 29 3.4.1. Ảnh hƣởng của pH ban đầu đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 29 3.4.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 32 3.5. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng thay thế lên khả năng sinh trƣởng, phát triển và sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 34 3.5.1. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng tự nhiên và môi trƣờng tổng hợp lên sự sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6………… 34 3.5.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nƣớc chiết giá đỗ và bắp cải cải tiến đến sinh trƣởng phát triển và sinh axit tổng số của chủng TH2 và T6 35 3.5.3. Ảnh hƣởng của tỉ lệ nƣớc chiết bắp cải trộn với MRS đến sinh trƣởng, phát triển và hiệu suất sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 [...]... tuyển chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao từ thực phẩm lên men truyền thống 2 Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu 1 - 2 chủng VK lactic sinh axit lactic cao từ thực phẩm lên men truyền thống để phục vụ công nghiệp chế biến thực phẩm 3 Nhiệm vụ nghiên cứu 3.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống và sơ tuyển các chủng sinh axit lactic cao 3.2 Tuyển. .. các sản phẩm lên men truyền thống 1.1.3 Các kiểu lên men lactic ở vi khuẩn lactic Có hai kiểu lên men lactic là lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình Lên men lactic đồng hình tạo ra axit lactic là sản phẩm trao đổi chất chính (chiếm > 90%) Trong khi đó, lên men lactic dị hình ngoài tạo ra axit lactic (50-60% lƣợng sản phẩm trao đổi chất) còn tạo ra ethanol, axit acetic, glycerol và một... khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống và sơ tuyển các chủng sinh axit lactic cao Chuẩn bị các nguyên liệu tự nhiên và tiến hành lên men lactic theo phƣơng pháp muối chua truyền thống Phân lập các chủng VK lactic thuần chủng từ các thực phẩm lên men truyền thống (tự muối chua hoặc mua trên thị trƣờng) trên môi trƣờng định tính VK lactic có bổ sung CaCO3 0,5% (Hình 3.7) Hình 3.7 Phân lập vi khuẩn. .. nghiên cứu tiếp theo Đã phân lập được 86 chủng VK lactic từ các mẫu thực phẩm lên men lactic truyền thống, đã sơ tuyển được 33 chủng sinh axit lactic cao và sinh trưởng tốt 23 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic cao Khả năng sinh trƣởng, phát triển của VK lactic luôn gắn liền với quá trình sinh tổng hợp axit lactic Để đánh giá mức độ tỷ lệ giữa sinh trƣởng, phát triển với sinh. .. nghiên cứu VK lactic đƣợc phân lập và tuyển chọn từ thực phẩm lên men truyền thống 5 Phƣơng pháp nghiên cứu 5.1 Phƣơng pháp vi sinh học Phân lập VK lactic; làm tiêu bản, quan sát hình thái VK dƣới kính hiển vi, nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa và khả năng sinh axit lactic của chủng VK tuyển chọn; xác định số lƣợng tế bào VK trong dịch nuôi; bảo quản chủng giống 2 VSV 5.2 Phƣơng pháp hóa sinh Chuẩn... VSV sinh axit lactic an toàn, cho axit lactic cao, dễ sản xuất, giá thành rẻ, tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu tự nhiên Vi c tuyển chọn những chủng VK lactic từ các sản phẩm lên men truyền thống có khả năng sinh axit lactic cao là một hƣớng nghiên cứu có triển vọng, phù hợp với công nghệ chế biến thực phẩm an toàn hiện nay Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã chọn thực hiện đề tài: Phân lập, tuyển. .. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic cao 3.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn lactic TH2 và T6 3.4 Ảnh hƣởng của một số yếu tố lý hóa đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 3.5 Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng thay thế lên khả năng sinh trƣởng, phát triển và sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên. .. (g/l) Từ 10 chủng có khả năng sinh axit lactic cao, chủng TH2 và T6 sinh tổng hợp axit lactic cao (15,30g/l đến 15,89g/l), sinh trưởng tốt được tuyển chọn cho các nghiên cứu sâu 3.3 Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của chủng vi khuẩn lactic TH2 và T6 3.3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn lactic TH2 và T6 Chúng tôi đánh giá đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình... lƣợng axit lactic trong dịch lên men 5.3 Phƣơng pháp thống kê xác suất Phân tích và thống kê các số liệu thu đƣợc theo excel 2007 6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 6.1 Ý nghĩa thực khoa học Dựa trên các nghiên cứu về VK lactic và các phƣơng pháp tăng hiệu suất lên men lactic trƣớc đây 6.2 Ý nghĩa thực tiễn Tuyển chọn đƣợc 1 - 2 chủng VK lactic sinh axit lactic cao để phục vụ công nghiệp chế biến thực phẩm. .. mặt ở ruột, âm đạo Các sản phẩm lên men lactic cũng làm tăng cƣờng miễn dịch đƣờng ruột, giảm cholesterol, chống các tác nhân gây ung thƣ Vi t Nam từ xa xƣa đã có rất nhiều sản phẩm lên men truyền thống độc đáo và có giá trị thực tiễn cao Do khả năng sinh nhiều loại chất ức chế VSV (axit lactic, 1 diacetyl, bacteriocin…), lên men lactic đã trở thành một giải pháp bảo quản thực phẩm hữu hiệu trong dân . chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao từ thực phẩm lên men truyền thống . 2. Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu 1 - 2 chủng VK lactic sinh axit lactic cao. QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20 3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống và sơ tuyển các chủng sinh axit lactic cao 20 3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh axit. từ thực phẩm lên men truyền thống để phục vụ công nghiệp chế biến thực phẩm. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống và sơ tuyển các chủng sinh