TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ĐINH THỊ PHƢƠNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ ĐẶC TÍNH PROBIOTIC TỪ MẬT VÀ SÁP ONG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học HÀ NỘI, 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ĐINH THỊ PHƢƠNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ ĐẶC TÍNH PROBIOTIC TỪ MẬT VÀ SÁP ONG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. TRẦN THỊ THÚY HÀ NỘI, 2014 LỜI CẢM ƠN Em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo TS. Trần Thị Thúy, ngƣời đã tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp này. Em gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, cô giáo đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo công tác tại bộ môn Công nghệ Sinh học- Vi sinh, khoa Sinh học, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội, đã hết lòng tạo điều kiện, giúp đỡ em thực hiện các nghiên cứu của mình. Xin cảm ơn tới các anh, chị, các bạn sinh viên đang làm việc và học tập Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, đã giúp đỡ em nhiệt tình trong suốt quá trình làm đề tài này. Cuối cùng em xin đƣợc cảm ơn những ngƣời thân, bạn bè, đã quan tâm giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Đinh Thị Phƣơng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với công trình của tác giả khác. Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Đinh Thị Phƣơng NHỮNG TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT CFU (Colony Forming Unit) Đơn vị hình thành khuẩn lạc VSV Vi sinh vật VK Vi khuẩn GRAS Generally Regarded As Safe DNS DiNitroSalycilic acid Da Dalton kDa Kilodalton OD Optical Density Cs Cộng sự G + Gram dƣơng G - Gram âm VTM Vitamin w/v Khối lƣợng/thể tích STT Số thứ tự ĐC Đối chứng PTN Phòng thí nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics 10 Bảng 3.2. Các mẫu phân lập vi khuẩn lactic 25 Bảng 3.3. Một số đặc điểm sinh học của 61 chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc từ mật và sáp ong……………………………………………… 26 Bảng 3.4. Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc với các chủng vi khuẩn kiểm định 31 Bảng 3.5. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng LT31 33 Bảng 3.6. Động thái sinh trƣởng của chủng LT31 36 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của môi trƣờng tự nhiên đến sự sinh trƣởng và phát triển của chủng LT31 41 Bảng 3.8. Khả năng sinh trƣởng của chủng LT31 trong các môi trƣờng MRS có bổ sung dịch chiết bắp cải 42 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Đồ thị chuẩn mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào vi khuẩn/ml dịch nuôi và giá trị OD 620 của chủng LT31 ….18 Hình 2.2. Đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng glucose trong dung dịch và giá trị OD 540 20 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc từ sáp và mật ong 30 Hình 3.4. Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc từ sáp và mật ong 30 Hình 3.5. Khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn kiểm định của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập từ mật và sáp ong 32 Hình 3.6. Hình thái tế bào và hình thái khuẩn lạc của chủng LT31 33 Hình 3.7. Hoạt tính catalase 34 Hình 3.8. Khả năng sinh khí của chủng LT31 34 Hình 3.9. Khả năng quần tụ của chủng LT31 35 Hình 3.10. Động thái sinh trƣởng của chủng LT31 37 Hình 3.11. Khả năng sống sót trong axit của chủng LT31 38 Hình 3.12. Khả năng sống sót trong mật lợn của chủng LT31 39 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự sinh trƣởng của chủng LT31 40 Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng của chủng LT31 41 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ……………………………………………………………………………1 1. Lí do chọn đề tài………………………………………………………………… 1 2. Mục đích nghiên cứu…………………………………………………………… 1 3. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………………… 1 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu……………………………………………… 2 5. Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………………… …… 2 6. Những đóng góp mới của đề tài……………………………………………… 2 7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn…….…………………………………….……… 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Vi khuẩn lactic 3 1.1.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic 3 1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic 4 1.1.3. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn lactic 4 1.1.4. Trao đổi chất của vi khuẩn lactic 5 1.1.5. Sự phân bố của vi khuẩn lactic 6 1.2. Probiotics 7 1.2.1. Định nghĩa probiotics 7 1.2.2. Các loại VSV đƣợc dùng làm chế phẩm probiotics 7 1.2.3. Tác dụng của probiotics 9 1.2.4. Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics 10 1.2.5. Nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm probiotics 10 1.3. Sáp ong và mật ong 12 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 14 2.1.1. Vi sinh vật 14 2.1.2. Máy móc thiết bị 14 2.1.3. Hoá chất 14 2.1.4. Môi trƣờng 15 2.1.4.1. Môi trƣờng phân lập, nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu các đặc tính của vi khuẩn lactic – Môi trƣờng MRS 15 2.1.4.2. Môi trƣờng nuôi cấy và giữ giống VSV kiểm định – MPA 15 2.1.4.3. Môi trƣờng thay thế nuôi cấy vi khuẩn lactic……………………………15 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong 15 2.2.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn 16 2.2.2.1. Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp đặt khối thạch 16 2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch 17 2.2.3. Xác định số lƣợng tế bào vi khuẩn 17 2.2.4. Xây dựng đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy với giá trị OD 620 18 2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm của chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn 19 2.2.5.1. Phát hiện hoạt tính catalase 19 2.2.5.2. Phát hiện khả năng sinh khí từ glucose 19 2.2.5.3. Xác định lƣợng đƣờng còn lại trong dịch nuôi cấy 19 2.2.5.4. Xác định khả năng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic theo phƣơng pháp của Reniero và cộng sự (1992) 21 2.2.5.5. Kiểm tra khả năng đồng quần tụ với các chủng vi sinh vật kiểm định theo phƣơng pháp của Kmet và cộng sự (1995) 21 2.2.5.6. Xác định khả năng chịu axit của chủng nghiên cứu 22 2.2.5.7. Xác định khả năng sinh trƣởng với mật lợn 22 2.2.6. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh trƣởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu 23 2.2.6.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 23 2.2.6.2. Ảnh hƣởng của độ pH 23 2.2.6.3. Ảnh hƣởng của các môi trƣờng tự nhiên 23 2.2.7. Bảo quản chủng giống vi khuẩn trong dung dịch 30% glycerol 24 2.2.8. Phƣơng pháp thống kê và xử lí kết quả 24 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ mật ong, sáp ong 25 3.2. Tuyển chọn vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn 30 3.3. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng LT31 33 3.4. Một số đặc tính probiotics của chủng vi khuẩn lactic LT31 35 3.4.1. Khả năng quần tụ của chủng LT31 35 3.4.2. Khả năng đồng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic LT31 với các chủng vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột 35 3.4.3. Động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn lactic LT31 36 3.4.4. Khả năng sống sót trong pH axit của chủng vi khuẩn lactic LT31 37 3.4.5. Khả năng sống sót trong mật lợn của chủng vi khuẩn lactic LT31 38 3.5. Ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến sinh trƣởng của chủng vi khuẩn lactic LT31 39 3.5.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 40 3.5.2. Ảnh hƣởng của pH 40 3.5.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng tự nhiên 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 [...]... tài: Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic từ mật và sáp ong 2 Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics từ mật và sáp ong 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ mật ong và sáp ong 3.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn 3.3 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng tuyển. .. tuyển chọn 3.4 Nghiên cứu một số đặc tính probiotics của chủng tuyển chọn 3.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng tới sinh trƣởng của chủng vi khuẩn lactic 1 4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Các chủng vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong thu đƣợc ở một số khu vực phía bắc Vi t Nam 5 Phƣơng pháp nghiên cứu 5.1 Phƣơng pháp vi sinh học: phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong; ... nghiên cứu đầu tiên khảo sát sự có mặt của một số chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics phân lập từ mật và sáp ong 7 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 7.1 Ý nghĩa khoa học Đề tài đóng góp những hiểu biết về khu hệ vi khuẩn lactic trong mật và sáp ong, tiềm năng ứng dụng chúng trong các chế phẩm probiotics 7.2 Ý nghĩa thực tiễn Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics từ mật và. .. nuôi cấy vi khuẩn lactic Nghiền nhỏ 250g nguyên liệu hữu cơ (bắp cải, rau má, cải ngọt, hành) trong 1l nƣớc, lọc lấy dịch trong, thu đƣợc 1l dịch chiết tự nhiên 25% 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong Phân lập trực tiếp trên môi trƣờng MRS có CaCO3  Nguyên tắc Dựa vào đặc tính sinh axit của các chủng vi khuẩn lactic, làm tan CaCO3 trong môi trƣờng phân lập MRS... chúng tôi giới hạn phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong Kết quả phân lập đƣợc thể hiện trong bảng 3.2, hình 3.3 và hình 3.4: Bảng 3.2 Các mẫu phân lập vi khuẩn lactic Địa điểm STT Mẫu Số chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc 1 Ngọc Thanh- Vĩnh Phúc Tổ ong mật 3 (LT1 – LT3) 2 Điện Biên- Điện Biên Tổ ong nuôi lấy mật 5 (LT4 – LT8) bảo tồn ở rừng Điện Biên 3 Điện Biên- Điện Biên Tổ ong ruồi tự nhiên... cá,…) Mật và sáp ong từ lâu đã đƣợc nhân dân ta sử dụng nhƣ một bài thuốc dân gian để phòng trị nhiều bệnh, từ các bệnh đƣờng hô hấp đến các bệnh đƣờng tiêu hóa, nhiễm trùng da Một số nhóm nghiên cứu trên thế giới cũng đã báo cáo những phát hiện về khu hệ VSV có ích trong tổ ong, sáp và mật ong Từ thực tiễn nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn lactic làm chế phẩm probiotics đã nêu trên, chúng tôi lựa chọn. .. còn sót lại trong dịch nuôi cấy, xây dựng đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy với giá trị OD ở bƣớc sóng 620nm… 24 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong Vi khuẩn lactic có mặt ở nhiều nơi trong tự nhiên: trong thực phẩm lên men cũng nhƣ không lên men, trong nƣớc, trong đất, cả trong cơ thể động thực vật và con ngƣời... chăn nuôi 1.3 Sáp ong và mật ong Mật ong, sáp ong đƣợc con ngƣời dùng từ cách đây hàng ngàn năm Ở Vi t Nam, ngƣời ta cũng đã biết dùng mật và sáp ong để tăng cƣờng sức khỏe và phối hợp với nhiều vị thuốc khác để chữa trị những căn bệnh từ thông thƣờng đến nguy hiểm Theo nhƣ phân tích thì mật ong là sản phẩm tự nhiên rất bổ dƣỡng với khoảng 75-80% đƣờng (đƣờng trong mật ong là fructose và glucose, loại... sự có mặt của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic có mặt nhiều nhất trong các loại thức ăn ủ chua 6 nhƣ: sữa chua, rau quả muối chua, thịt, cá muối chua … Ngoài ra, cũng có một số loài vi khuẩn lactic sống ký sinh trên thực vật, hút các chất trong biểu mô cây [22] 1.2 Probiotics 1.2.1 Định nghĩa probiotics Probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp bao gồm hai từ “pro” có nghĩa là dành cho và “biosis” có nghĩa... cấy dựa vào giá trị OD620 đo đƣợc 2.2.5 Nghiên cứu đặc điểm của chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn 2.2.5.1 Phát hiện hoạt tính catalase Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3% vào sinh khối tế bào của chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu Nếu thấy hiện tƣợng sủi bọt thì chứng tỏ trong sinh khối có catalase, nếu không sủi bọt thì chứng tỏ trong sinh khối không có catalase 2.2.5.2 Phát hiện khả năng sinh khí từ glucose . tuyển chọn và nghiên cứu chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic từ mật và sáp ong 2. Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics từ mật và sáp ong. 3 dung nghiên cứu 3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ mật ong và sáp ong. 3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn. 3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng. hệ vi khuẩn lactic trong mật và sáp ong, tiềm năng ứng dụng chúng trong các chế phẩm probiotics. 7.2. Ý nghĩa thực tiễn Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics từ mật và