TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN LÊ THỊ THÙY DUNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY RƠM RẠ THÀNH PHÂN HỮU CƠ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 1. TS. PHƢƠNG PHÚ CÔNG 2. PGS. TS ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài này, em nhận được sự giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo, gia đình và bạn bè. Khi hoàn thành khóa luận em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Phương Phú Công và PGS. TS Đinh Thị Kim Nhung người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy cô giáo và cán bộ trong tổ Thực vật - Vi sinh, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ em trong thời gian làm khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn trong nhóm vi sinh đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua. X  Sinh viên Lê Thị Thùy Dung LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “ thành là do tôi thực hiện, không sao chép lại của ai. Tất cả các số liệu đều thu thập từ thực nghiệm, qua xử lí thống kê, không có số liệu sao chép không trùng với kết quả của tác giả nào đã công bố. Trong đề tài tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận tốt nghiệp của mình. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.   2014 Sinh viên Lê Thị Thùy Dung DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CFU : Colony forming unit CMC : Cacboxyl methyl cellulose d : Đường kính lỗ thạch D : Đường kính vòng phân giải ĐC : Đối chứng G : Gram HCVS : Hữu cơ vi sinh M : Nấm mốc mẫu làm giàu MPA : Meat peptone agar MT : Môi trường NM : Nấm mốc PTN : Phòng thí nghiệm RBBR : Remazol Brilliant Blue R STT : Số thứ tự TN : Thí nghiệm U : Ủ UBND : Ủy ban nhân dân U n : Nấm mốc mẫu ủ U v : Vi khuẩn mẫu ủ U x : Xạ khuẩn mẫu ủ V : Vi khuẩn mẫu làm giàu VK : Vi khuẩn VQG : Vườn quốc gia VSV : Vi sinh vật X : Xạ khuẩn mẫu làm giàu XK : Xạ khuẩn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu của đề tài 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 3.1. Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 2 3.2. Tuyển chọn tổ hợp VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 2 3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô PTN với các chủng VSV tuyển chọn 2 4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài 2 4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài 2 4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2 5. Điểm mới của đề tài 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Hệ vi sinh vật đất 3 1.1.1. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất 3 1.1.2. Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose 4 1.2. Thực trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam 7 1.2.1. Sử dụng rơm để trồng nấm rơm 8 1.2.2. Sử dụng rơm rạ để sản xuất phân hữu cơ vi sinh 9 1.2.3. Một số ứng dụng khác trong sử dụng rơm rạ ở nước ta 9 1.3. Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên 9 1.3.1. Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên 9 1.3.2. Cellulose 10 1.3.3. Hemicellulose 11 1.3.4. Lignin 12 1.3.5. Cơ chế chuyển hóa lignocellulose 13 1.4. Các bước của quy trình chế tạo chế phẩm vi sinh phân hủy rác thải hữu cơ 16 1.5. Lịch sử phát triển phân bón vi sinh 17 1.5.1. Trên thế giới 17 1.5.2. Ở Việt Nam 17 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Đối tượng nghiên cứu 19 2.2. Hóa chất, thiết bị 19 2.2.1. Hóa chất 19 2.2.2. Thiết bị 19 2.3. Các loại môi trường nuôi cấy 19 2.3.1. Môi trường phân lập và giữ giống vi khuẩn MPA 19 2.3.2. Môi trường phân lập và giữ giống xạ khuẩn Gauze I 20 2.3.4. Môi trường phân lập và giữ giống nấm mốc Crapeckdox 20 2.3.5. Môi trường phân lập và giữ giống nấm men Hansen 20 2.3.6. Môi trường thử hoạt tính sinh tổng hợp enzyme của các chủng VSV 20 2.4. Phương pháp nghiên cứu 21 2.4.1. Phương pháp vi sinh học 21 2.4.2. Phương pháp toán học trong thống kê và xử lý số liệu. 24 2.6. Địa điểm thực hiện đề tài 25 2.7. Thời gian thực hiện đề tài 25 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1. Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 26 3.1.1. Kết quả lấy mẫu 26 3.1.2. Thí nghiệm với khối ủ mẫu lớn 29 3.1.3. Kết quả phân lập 31 3.2. Tuyển chọn tổ hợp vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 33 3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô PTN với các chủng VSV tuyển chọn 41 3.3.1. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của các chủng VSV tuyển chọn 41 3.3.2. Kết quả xác định hàm lượng giống ban đầu bổ sung vào khối ủ 43 3.3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô phòng thí nghiệm 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 1. Kết luận 47 2. Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử cellulose 11 Hình 3.1. Thí nghiệm ủ mẫu khối lớn 30 Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên nhiệt độ của U1 và U2 30 Hình 3.3. VSV phân lập trên môi trường thạch đĩa 32 Hình 3.4. Hoạt tính một số VSV tuyển chọn trên MT cơ chất bột giấy 38 Hình 3.5. Hoạt tính một số chủng VSV tuyển chọn trên MT cơ chất CMC 39 Hình 3.6. Hoạt tính một số chủng VSV tuyển chọn trên MT cơ chất xylan, RBBR 39 Hình 3.7. Khuẩn lạc các chủng VSV tuyển chọn trên môi trường thạch đĩa 40 Hình 3.8. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của 10 chủng VSV tuyển chọn 42 Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên nhiệt độ của các đống ủ 44 Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn độ giảm khối lượng của các đống ủ 46 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Môi trường thử hoạt tính 20 Bảng 3.1. Kết quả lấy mẫu 26 Bảng 3.2. Hàm lượng nitơ bổ sung 27 Bảng 3.3. Độ giảm trọng lượng cơ chất, m(g), sau 4 tuần ủ làm giàu ở nhiệt độ phòng 28 Bảng 3.4. Tỉ lệ phối trộn tiến hành thí nghiệm ủ mẫu 29 Bảng 3.5. Kết quả phân lập 32 Bảng 3.6. Theo dõi hoạt tính của các chủng có hoạt tính lignocelluase 34 Bảng 3.7. Hoạt tính enzyme ngoại bào của 10 chủng VSV tuyển chọn 37 Bảng 3.8. Hàm lượng vi khuẩn bổ sung 43 Bảng 3.9. Hàm lượng xạ khuẩn, nấm mốc bổ sung 43 Bảng 3.10. Tỉ lệ phối trộn các thành phần ủ rơm rạ 44 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Hàng năm, tại vùng nông thôn miền Bắc sau thu hoạch lúa sinh ra một lượng rơm rạ khổng lồ. Với phế phẩm giàu cellulose này, một lượng rất ít được sử dụng để trồng nấm hay làm thức ăn gia súc, phần lớn được xử lý theo phương pháp truyền thống là đốt trực tiếp trên đồng ruộng, điều này gây ra nhiều hậu quả như góp phần làm ô nhiễm không khí, phá hủy hệ sinh thái đất và đất ngày càng bạc màu. Người dân đốt rơm tại ruộng và ngay cả trên đường, không những gây lãng phí mà còn gây khói bụi, gây ô nhiễm môi trường do khói đốt rơm rạ có tỉ lệ tro bụi cao, các khí CO, CO 2 , NO 2 , SO 2 … gây ảnh hưởng tới sức khỏe của người dân xung quanh. Việc đốt rơm rạ trong những ngày nắng nóng còn gây nguy cơ cháy nổ cao và gây nguy cơ tai nạn giao thông khi khói bụi trở nên mù mịt. Trong khi đó lượng rơm rạ thải ra sau mỗi vụ thu hoạch rất lớn. Trước thực trạng đó, một giải pháp hữu hiệu để xử lý các phụ phẩm nông nghiệp nhằm tận thu nguồn nguyên liệu này là sử dụng những phế phẩm bỏ đi trong nông nghiệp như rơm rạ để ủ phân hữu cơ. Việc này giúp cho bà con nông dân không những tiết kiệm chi phí mua phân hóa học mà còn giúp cải tạo đất, đảm bảo sức khỏe cho người sử dụng và hạn chế tác động xấu đến môi trường. Phân hữu cơ có thể đem bón cho đất trước khi gieo trồng làm tăng lượng dinh dưỡng hữu cơ bổ sung cho đất, nâng cao độ phì nhiêu của đất, làm cho đất tơi, xốp, tăng lượng oxy hòa tan trong đất. Ngoài ra, phân hữu cơ sau khi ủ có thể tiêu diệt được các nguồn bệnh tàn dư trong nguyên liệu ủ nên không mang tác nhân gây bệnh cho cây trồng. Từ những yêu cầu thực tiễn của ngành nông nghiệp, tôi tiến hành đề tài:   2 2. Mục tiêu của đề tài Phân lập, tuyển chọn được tổ hợp vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 3.2. Tuyển chọn tổ hợp VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô PTN với các chủng VSV tuyển chọn 4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Đề tài nhằm phân lập tuyển chọn được các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phân giải lignocellulose. Góp một phần nhỏ bổ sung cho các nghiên cứu về chế phẩm vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân bón nói riêng và ứng dụng trong đời sống nói chung phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Tận dụng nguồn nguyên liệu rơm rạ sau mỗi vụ thu hoạch, tuyển chọn được tổ hợp vi sinh vật hữu hiệu để ủ phân hữu cơ góp phần làm giảm lượng rác thải nông nghiệp tránh ô nhiễm môi trường, nâng cao hiệu quả canh tác nông nghiệp. 5. Điểm mới của đề tài Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên khảo sát sự có mặt của một số chủng VSV có khả năng sinh enzyme lignocellulase trong đất tại 3 địa điểm: Khu vực đất nông nghiệp huyện Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà Nội), VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc). [...]... nghiệm Vi sinh vật, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 2.7 Thời gian thực hiện đề tài Đề tài được tiến hành từ tháng 12 năm 2012 đến tháng 04 năm 2014 tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 25 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ Để có thể tiến hành phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ tôi... canh tác… Ở những nơi có đầy đủ chất dinh dưỡng, độ thoáng khí tốt, nhiệt độ, độ ẩm và pH thích hợp thì vi sinh vật phát triển nhiều về số lượng và thành phần sự phát triển của vi sinh vật lại chính là nhân tố làm cho đất thêm phì nhiêu [3] 1.1.2 Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose 1.1.2.1 Vi sinh vật phân hủy cellulose Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose vô... triển phân bón vi sinh 1.5.1 Trên thế giới Phân bón vi sinh vật (tên thường gọi: phân hữu cơ vi sinh) là sản phẩm được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ khác nhau, nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng, cải tạo đất, chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống được tuyển chọ với mật độ đạt tiêu chuẩn quy định, góp phần nâng cao năng xuất, chất lượng nông sản Phân hữu cơ vi sinh vật không gây... Hệ vi sinh vật đất 1.1.1 Sự phân bố của vi sinh vật trong đất Vi sinh vật phân bố ở khắp mọi nơi trên trái đất, nhưng phân bố nhiều nhất là ở trong môi trường đất Sự phân bố của vi sinh vật trong đất còn gọi là hệ sinh vật đất Bởi vì trong môi trường đất nói chung và trong đất trồng nói riêng cung cấp một nguồn thức ăn phong phú cho vi sinh vật Các chất vô cơ có trong đất là nguồn thức ăn cho nhóm vi. .. đã có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộng vi c sản xuất các loại phân bón vi sinh cố đinh nitơ mà thành phần còn được phối hợp thêm một số vi sinh vật có ích khác như một số xạ khuẩn cố đinh nitơ sống tự do Frankia spp , Azotobacter spp , các vi khuẩn cố định nitơ sống tự do Clostridium, Pasterium, Beijerinkia indica, các xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose, hoặc một số chủng. .. + Có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào lớn + Có khả năng sinh trưởng, phát triển và sinh sản trên môi trường rác thải hữu cơ tự nhiên + Có khả năng sống và giữ gìn hoạt tính trong chất mang dùng để chế tạo chế phẩm Bước 3: Thử nghiệm khả năng kết hợp giữa các chủng VSV Bước 4: Chế tạo chế phẩm VSV phân hủy rác thải hữu cơ Bước 5: Thử nghiệm sử dụng chế phẩm [4] 16 1.5 Lịch sử phát triển phân bón vi. .. Vi c đốt rơm rạ là điều nên tránh và đã có khuyến nghị bà con sử dụng rơm rạ cho vi c trồng nấm rơm, dự trữ làm thức ăn gia súc, ủ gốc trồng màu… Trong trường hợp khó vận chuyển và cất giữ có thể vận động tập thể mua máy đóng bánh rơm của một số xí nghiệp đã khuyến cáo rất có hiệu quả trong vi c ép rơm rạ thành bánh giúp cho vi c vận chuyển và bảo quản rơm rạ được dễ dàng Từ đó có thể sử dụng rơm rạ. .. cấy vi sinh vật kiểm tra theo một đường thẳng Ủ trong điều kiện nhiệt độ bình thường Bước 2: Cấy vi khuẩn có khả năng bị ức chế bởi kháng sinh nghiên cứu Đem ủ ở nhiệt độ tương tự như trên Bước 3: Sau 3 - 4 ngày, nhận xét và ghi kết quả Nếu vi sinh vật có khả năng ức chế thì sẽ xuất hiện vùng vô khuẩn – vùng không có sự phát triển của vi sinh vật b) Phương pháp thỏi thạch Bước 1: Nuôi cấy vi sinh vật. .. hoặc một số chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các nguồn dự trữ photpho, kali ở dạng khó hòa tan với một số lượng lớn có trong đất mùn, than bùn, trong các quặng apatit, photpho,… chuyển chúng thành dạng dễ hòa tan, cây trồng có thể hấp thụ được 1.5.2 Ở Vi t Nam Phân vi sinh vật cố đinh đạm cây họ đậu và phân vi sinh vật phân giải lân đã được nghiên cứu từ năm 1960 Đến năm 1987, phân Nitragin nền... lớn phân hoá học, thuốc bảo vệ thực vật làm cho cấu trúc đất bị thay đổi Nếu cứ tiếp tục như vậy, đồng ruộng sẽ mất dần độ phì nhiêu, môi trường ô nhiễm, sức khoẻ con người bị ảnh hưởng Do vậy, vi c sử dụng rơm, rạ làm phân bón hữu cơ có ý nghĩa rất lớn về mặt kinh tế, xã hội 1.2.3 Một số ứng dụng khác trong sử dụng rơm rạ ở nước ta Ngoài dùng rơm rạ trồng nấm rơm, sản xuất phân bón hữu cơ, rơm rạ cũng . Phân lập, tuyển chọn được tổ hợp vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 3.2. Tuyển. năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 2 3.2. Tuyển chọn tổ hợp VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 2 3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô PTN với các chủng VSV tuyển chọn 2 4. Ý nghĩa. SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN LÊ THỊ THÙY DUNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY RƠM RẠ THÀNH PHÂN HỮU CƠ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP