ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Nhƣ Trang NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG Ở HỆ SINH THÁI NÔNG NGHIỆP TÂY NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Nhƣ Trang NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG Ở HỆ SINH THÁI NÔNG NGHIỆP TÂY NGUYÊN Chuyên ngành: Động vật học Mã số: 60420103 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Ngọc Châu PGS.TS Nguyễn Văn Vịnh Hà Nội - 2014 i LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Ngọc Châu, PGS.TS Nguyễn Văn Vịnh, những người thầy đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo và cán bộ nghiên cứu Phòng Tuyến trùng học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể thực hiện được đề tài nghiên cứu luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Lê Thị Mai Linh, Phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, làm việc tại phòng Tuyến Trùng học - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp về mặt kỹ thuật phân tử và các ý kiến tư vấn hết sức hiệu quả trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm cùng tập thể các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, nói chung và Bộ môn động vật không xương sống nói riêng đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ để tôi hoàn thành được chương trình khóa học. Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè những người luôn bên cạnh giúp đỡ, là chỗ dựa tinh thần để tôi có thể hoàn thành được luận văn này. Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Tác giả Nguyễn Như Trang ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Khái quát chung về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (EPN) 4 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu: 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái 11 1.1.3. Đặc điểm sinh học 14 1.2 Khả năng ứng dụng của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng trong phòng trừ sinh học sâu hại 16 1.2.1 Trên thế giới 16 1.2.2 Tại Việt Nam 19 CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu 22 2.2. Đối tượng nghiên cứu 22 2.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 23 2.4. Phương pháp nghiên cứu 23 2.4.1. Phương pháp xác định đặc điểm hình thái tuyến trùng 23 2.4.2. Phương pháp phân loại tuyến trùng dựa trên trình tự 18S – rDNA 25 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của EPN 29 2.4.4. Phương pháp xác định độc lực của EPN. 30 2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu 30 CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 3.1. Đặc điểm hình thái 32 3.2. Đặc điểm sinh học phân tử (đoạn 18S-rDNA và đoạn D2-D3, thuộc 28S- rDNA) 38 3.2.1. Kết quả PCR 38 3.2.2. Kết quả giải trình tự gen 39 iii 3.2.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của tuyến trùng. 42 3.3. Một số đặc điểm sinh học của tuyến trùng 44 3.3.1. Thời gian sinh trưởng và phát triển của tuyến trùng trong G. melonnella 44 3.3.2. Khả năng sinh sản của tuyến trùng trong ấu trùng G. mellonella 45 3.3.3. Hiệu lực gây chết của tuyến trùng S-DL13 đối với ấu trùng BSL 48 KÊ ́ T LUÂ ̣ N VA ̀ KIÊ ́ N NGH: 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 58 iv BẢNG CHỮ VIẾT TẮT EPN : Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematodes). VKCS : Vi khuẩn cộng sinh IJs : Ấu trùng cảm nhiễm (Infective juveniles) BSL PTSH : : Bướm sáp lớn (Galleria mellonella) Phòng trừ sinh học v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Mối quan hệ họ hàng của các loài Steinernema phân lập ở Việt Nam (Phan Ke Long, 2004) 10 Hình 1.2: Hình chụp từ kính hiển vi điện tử của tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis (Theo Nguyễn Ngọc Châu, 2008). 12 Hình 1.3: Vòng đời của các loài Heterorhabditis and Steinernema trên bọ hung ( Gaugler, Brown, Shapiroilan & Atwa , 2002) 15 Hình 3.1: Ảnh chụp hiển vi của con đực Steinernema siamkayai thế hệ 1. 33 Hình 3.2: Ảnh chụp hiển vi của con cái Steinernema siamkayai. T 34 Hình 3.3: Ảnh chụp hiển vi của ấu trùng cảm nhiễm Steinernema siamkayai. 35 Hình 3.4a: Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 18S 38 Hình 3.4b: Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen D2D3 38 Hình 3.5: Cây phát sinh chủng loại gen 18S của mẫu nghiên cứu với các loài khác trên genbank theo phương pháp ME 43 Hình 3.6: Cây phát sinh chủng loại gen D2-D3 của mẫu nghiên cứu với các loài khác trên genbank theo phương pháp ME 44 Hình 3.7: Ấu trùng cảm nhiễm phát tán ra khỏi vật chủ. 45 Hình 3.8: Đồ thị tương quan giữa sản lượng IJs và số lượng IJs gây nhiễm ban đầu của chủng S-DL13 trên ấu trùng BSL 47 Hình 3.9: Đồ thị tương quan giữa tỷ lệ ấu trùng BSL chết và số lượng gây nhiễm ban đầu của chủng S-DL13 49 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Danh sách các chế phẩm sinh học BIOSTAR 20 Bảng 1.2. Áp dụng phòng trừ sâu hại ở một số địa phương 20 Bảng 2.1. Các mồi đặc hiệu cho PCR 26 Bảng 2.2: Thành phần hỗn hợp cho PCR 26 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 26 Bảng 2.4: Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định trình tự DNA 28 Bảng 2.5: Chu trình nhiệt của phản ứng xác định trình tự DNA 29 Bảng 3.1: Các chỉ số đo của loài S. siamkayai ở Việt Nam 36 Bảng 3.2: Bảng ma trận khoảng cách di truyền của mẫu nghiên cứu với các trình tự đoạn gen 18S trên Genbank 40 Bảng 3.3: Bảng ma trận khoảng cách di truyền của mẫu nghiên cứu với các trình tự gen D2-D3 trên Genbank 41 Bảng 3.4: Khả năng sinh sản của chủng S-DL13 trên ấu trùng BSL 46 Bảng 3.5: Hiệu lực gây chết ấu trùng BSL của chủng S-DL13 48 1 MỞ ĐẦU Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có sự đa dạng phong phú về các loài thực vật, động vật và có nền nông nghiệp phát triển. Tuy nhiên, điều kiện khí hậu trên cũng là điều kiện tốt để sâu bệnh hại phát sinh, phát triển quanh năm. Có thể nói, đây là một trong những trở ngại lớn nhất trong sản xuất nông nghiệp của nước ta. Hàng năm, các côn trùng gây hại làm giảm đến 40-50% sản lượng của sản xuất nông nghiệp (Phạm Văn Lực et al, 1999). Để bảo vệ năng suất cây trồng, người nông dân đã sử dụng rất nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học khác nhau, mặc dù đem lại hiệu quả nhanh, dễ sử dụng, giá thành thấp, nhưng lại gây ra những hậu quả tiêu cực đối với môi trường sống, gây hại đến sức khỏe người và động vật nuôi, đồng thời tạo nên tính kháng thuốc của nhiều loài dịch hại. Đặc biệt, thuốc hóa học còn tiêu diệt nhiều loài sinh vật có ích làm giảm tính đa dạng trong tự nhiên gây mất cân bằng sinh thái. Hướng đến phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững, không gây ô nhiễm môi trường, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người, vật nuôi và các sinh vật có ích, đảm bảo được tính đa dạng sinh học và tính cân bằng sinh thái trong tự nhiên, việc nghiên cứu lựa chọn biện pháp phòng trừ tổng hợp trong đó có biện pháp sinh học đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm đặc biệt, được nghiên cứu, phát triển rộng rãi nhằm hạn chế sử dụng và tiến tới thay thế một phần thuốc hóa học trừ sâu được dùng trong nông nghiệp hiện nay. Hiện nay, phương pháp phòng trừ sinh học, đã được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong thực tế, một số kết quả đạt được như sử dụng thiên địch tự nhiên như ong mắt đỏ ký sinh, bọ rùa, bọ xít bắt mồi, nhện bắt mồi ăn thịt,… để không chế dịch hại. Ngoài ra vi khuẩn, nấm và virut đa nhân cũng đã được nghiên cứu, ứng dụng cho phòng trừ sâu hại cây trồng. Đặc biệt gần đây, các loài tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng cũng được nhanh chóng nghiên cứu, áp dụng trong phòng trừ sâu hại. Tuyến trùng ký sinh gây bệnh cho côn trùng (EPN) thực chất là những tổ hợp cộng sinh giữa các loài tuyến trùng ký sinh thuộc giống Steinernema (Họ Steinermatidae) và Heterorhabditis (Họ Heterorhabditidae) và các loài vi khuẩn gây bệnh giống Xenorhabdus và 2 Photorhabdus. Trong đó, tuyến trùng đóng vai trò vừa là ký sinh lại là những vector mang truyền vi khuẩn gây bệnh. Chính vì vậy mà nhóm tuyến trùng này trở thành tác nhân sinh học có nhiều ưu thế trong phòng trừ sinh học sâu hại như: phổ diệt sâu hại rộng, khả năng diệt sâu nhanh, có khả năng tự sản sinh tăng số lượng sau khi đã giết chết sâu hại và có thể sản xuất sinh khối lớn bằng công nghệ sinh học thích hợp in vivo và in vitro. EPN đã được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi và thương mại hóa như những chế phẩm sinh học ở nhiều nước như Mỹ, Úc, Canada, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan [2]. Mặc dù nghiên cứu EPN ở Việt Nam chỉ mới được triển khai vài thập niên gần đây, nhưng các kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn tài nguyên EPN phong phú và đa dạng, đồng thời đã đạt được một số kết quả quan trọng trong việc điều tra phân loại và nghiên cứu, tuyển chọn các chủng tuyến trùng có tiềm năng sinh học đưa vào sản xuất sinh khối và ứng dụng vào thực tiễn trong phòng trừ sinh học sâu hại [3, 5]. Tuy nhiên, hầu hết các chủng EPN ở Việt Nam chỉ tồn tại ở các hệ sinh thái rừng tự nhiên, rất ít các chủng EPN được phân lập từ hệ sinh thái nông nghiệp. Vì vậy, việc điều tra phân lập nhóm tuyến trùng này trong các hệ sinh thái nông nghiệp, đặc biệt hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên là rất cần thiết. Để có thêm dẫn liệu về tuyến trùng trong các hệ sinh thái nông nghiệp, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “ Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử của một số tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng ở hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên ” với các mục đích sau: Xác định đặc điểm hình thái và phân tử của EPN ở hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên. Đặc trưng sinh học và tiềm năng sử dụng EPN trong phòng trừ sinh học. Do hạn chế về thời gian và phạm vi nghiên cứu rất rộng, nên chúng tôi tập trung nghiên cứu và xác định các tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng – EPN trong hệ sinh thái cây công nghiệp trong hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên, cụ thể tập trung với 2 loại cây công nghiệp chủ lực là cà phê và hồ tiêu. [...]... chung về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (EPN) 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu: Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematode - EPN) là những loài giun tròn có ích ký sinh ở những loài côn trùng, làm suy yếu hoặc giết chết những côn trùng vật chủ này, nhưng lại rất an toàn đối với người, động vật và thực vật Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng thuộc 2 giống Steinernema và Heterorhabditis,... văn đã cung cấp dẫn liệu về đặc điểm hình thái và phân tử của chủng tuyển trùng S-DL13 thuộc loài tuyến trùng Steinernema siamkayai được phân lập từ hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên Một số dẫn liệu sinh học về sinh trưởng, phát triển và độc lực học cũng như khả năng sinh sản của tuyến trùng trên côn trùng bướm sáp lớn (Galleria mellonella) bước đầu cũng được cung cấp và thảo luận 3 Chƣơng 1 - TỔNG... khép kín Đuôi dạng chóp hoặc dạng chỉ Phasmids nằm ở khoảng giữa của đuôi, hơi nhô lên hoặc khó quan sát Hình 1.2: Hình chụp từ kính hiển vi điện tử của tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis A và C: Đầu của tuyến trùng gây nhiễm, và tuyến trùng cái thế hệ một của Steinernema B và D: Đầu của tuyến trùng gây nhiễm và tuyến trùng cái thế hệ hai của Heterorhabditis (Theo Nguyễn Ngọc Châu, 2008) Giống... năng ứng dụng của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng trong phòng trừ sinh học sâu hại 1.2.1 Trên thế giới Vai trò ký sinh gây bệnh ở côn trùng của một số loài tuyến trùng được tìm ra từ những năm 1930s và tiềm năng phòng trừ sâu hại của chúng cũng được biết đến khá sớm Năm 1932, Glaser là người đầu tiên công bố tiềm năng phòng trừ sâu hại của tuyến trùng họ Steinernematidae ở Mỹ Trong một thử nghiệm... 80% Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi vì các loài tuyến trùng thuộc hai giống Steinernema và Heterorhabditis cộng sinh bắt buộc với vi khuẩn (Xenorhabdus và Photorhabdus) tạo nên một tổ hợp sinh học tuyến trùng- vi khuẩn vừa có khả năng ký sinh vừa có khả năng gây bệnh cho côn trùng Tổ hợp sinh học này có nhiều có được nhiều ưu thế: Có khả năng kháng sinh và gây. .. trong vật chủ của tuyến trùng: Sau khi xâm nhập vào xoang máu vật chủ, tuyến trùng sẽ giải phóng vi khuẩn cộng sinh (VKCS) Lúc này, VKCS nhân lên nhanh chóng trong cơ thể vật chủ, giải phóng độc tố và gây chết vật chủ Tuyến trùng ăn vi khuẩn, phát triển và sản sinh ra các thế hệ tuyến trùng Khả năng sinh sản của tuyến trùng là một trong những đặc điểm quan trọng để tuyến trùng sống sót và tồn tại ngoài... Ở Việt Nam, tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng dù mới được bắt đầu triển khai nghiên cứu từ năm 1997 nhưng cũng đạt được nhiều kết quả tốt Các nghiên cứu bước đầu tập trung chủ yếu vào khảo sát, thu mẫu và phân lập các chủng EPN từ tự nhiên, ở nhiều vùng sinh thái khác nhau để phân loại và nghiên cứu tuyển chọn các chủng có đủ tiêu chuẩn sử dụng trong đấu tranh sinh học Cùng với việc điều tra phân. .. vật ở các hệ sinh thái nhiệt đới Việt Nam” (Mã số: 106.12.40.09) do Quỹ Phát triển khoa học và Công nghệ quốc gia (NAFOSTED) tài trợ kinh phí Thời gian nghiên cứu mẫu tại phòng thí nghiệm từ 09/04/2012 đến 03/04/2014 tại Phòng Tuyến trùng học - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2.2 Đối tƣợng nghiên cứu Tuyến trùng: chủng EPN được sử dụng trong nghiên cứu. .. ở giữa vòng paraffin Gắp tuyến trùng cho vào giọt glicerin Đặt vài mảnh sợi thuỷ tinh để đỡ tuyến trùng, đậy lamen Đặt lamkính lên thanh nhiệt và đốt đèn cồn ở bên dưới, sau vài phút parafin sẽ chảy đều và gắn lame vào lamkính Để định loại tuyến trùng tiến hành quan sát tuyến trùng, đo kích thước và vẽ tuyến trùng dưới kính hiển vi Các chỉ số hình thái lượng sử dụng trong mô tả đặc điểm hình thái của. .. gây chết của các chủng tuyến trùng Steinernema sp TK10 và Heterorhabditis sp TK3 trên một số sâu hại ở cây trồng Việt Nam cho thấy phổ gây chết sâu hại của 2 chủng tuyến trùng này khá rộng, trong đó chủng Steinernema sp TK10 có phổ ký sinh gây bệnh lớn hơn Hiệu lực gây chết qua chỉ số LC50 của 2 chủng tuyến trùng trên 7 loại sâu hại đều ở mức tương đối thấp (13 - 95 IJs) cho thấy đây là 2 chủng có . về tuyến trùng trong các hệ sinh thái nông nghiệp, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “ Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử của một số tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng ở hệ sinh. Trang NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG Ở HỆ SINH THÁI NÔNG NGHIỆP TÂY NGUYÊN Chuyên ngành: Động vật học Mã số: 60420103. Nguyễn Nhƣ Trang NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG Ở HỆ SINH THÁI NÔNG NGHIỆP TÂY NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ