BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG o0o NGUYỄN THỊ PHƯƠNG PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN VI KHUẨN Streptococcus spp. GÂY BỆNH TRÊN CÁ RÔ PHI NUÔI TẠI HẢI PHÒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Khánh Hòa - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG o0o NGUYỄN THỊ PHƯƠNG PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN VI KHUẨN Streptococcus spp. GÂY BỆNH TRÊN CÁ RÔ PHI NUÔI TẠI HẢI PHÒNG Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản Mã số: 60620301 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRẦN ĐÌNH LUÂN CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG KHOA SAU ĐẠI HỌC TS. PHẠM QUỐC HÙNG HOÀNG HÀ GIANG Khánh Hòa - 2015 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nghiên cứu nào khác. Đồng thời các số liệu tôi trích dẫn trong luận văn đều rõ ràng và chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả Nguyễn Thị Phương ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình, ngoài sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ của các đoàn thể, cơ quan, tổ chức, tập thể và các cá nhân. Lời đầu tiên, cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc nhất tới TS. Trần Đình Luân – Cục Thú y là người định hướng, hướng dẫn trực tiếp tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, đồng nghiệp tại phòng Lab Cơ quan Thú y vùng II, trường Trung cấp nghề thủy sản miền Bắc đã quan tâm, hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành các nội dung nghiên cứu của đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn, kính trọng các thầy cô giáo trường Đại học Nha Trang, trong suốt 2 năm học qua tôi đã nhận được sự dạy dỗ, dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo trong trường. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban lãnh đạo, các anh chị trong viện nghiên cứu Hải Sản đã tạo điều kiện về mặt tổ chức, cung cấp trang thiết bị cho lớp học học tập trong thời gian qua. Nhân đây, tôi xin chân thành cảm ơn đến tất cả bạn bè, đồng nghiệp, những người góp ý chân thành và giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, con xin cảm ơn bố mẹ, các anh chị em đã động viên, cổ vũ con trong lúc khó khăn nhất, tạo điều kiện cho con hoàn thành luận văn trong thời gian qua. Tác giả Nguyễn Thị Phương iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá rô phi 4 1.1.1. Khóa phân loại của cá rô phi 4 1.1.2. Nguồn gốc 4 1.1.3. Đặc điểm sinh học, sinh trưởng và tập tính dinh dưỡng. 5 1.2. Tình hình nuôi cá rô phi trên thế giới và ở Việt Nam 6 1.2.1. Trên thế giới 6 1.2.2. Ở Việt Nam 7 1.3. Tình hình nghiên cứu dịch bệnh cá rô phi trên thế giới, ở Việt Nam và Hải Phòng 8 1.3.1. Trên thế giới 8 1.3.2. Ở Việt Nam 10 1.3.3. Tại Hải Phòng 12 1.4. Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản 14 1.5. Sự kháng thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản 17 Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 20 2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 20 2.3 Vật liệu nghiên cứu 21 2.3.1 Dụng cụ, các thiết bị phục vụ nghiên cứu. 21 2.3.2 Môi trường, hóa chất phục vụ nghiên cứu 21 2.3.3 Vật liệu nghiên cứu 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Điều tra tình hình bệnh và sử dụng kháng sinh trong nuôi cá rô phi tại Hải Phòng 22 iv 2.4.2 Phương pháp thu mẫu cá bệnh 22 2.4.3 Phương pháp mổ cá để lấy nội tạng 23 2.4.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn Streptoccoccus spp. từ mẫu cá bệnh phẩm 24 2.4.5 Phương pháp định danh vi khuẩn Streptococcus spp. 25 2.4.6 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn Streptoccocus spp trên cá 30 2.5 Phương pháp phân tích và xử lí dữ liệu 32 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết quả điều tra tình hình dịch bệnh và tình hình sử dụng kháng sinh trên cá rô phi nuôi tại Hải Phòng 33 3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Streptococcus spp 33 3.2.1 Kết quả thu mẫu 34 3.2.2 Kết quả phân lập vi khuẩn 34 3.3 Kết quả xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn S.agalactiae 36 3.3.1 Kết quả xác định một số đặc tính sinh hóa. 36 3.3.2 Kết quả định danh vi khuẩn. 37 3.3.3 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn S.agalactiae 40 3.4 Kết quả cảm nhiễm lại vi khuẩn S.agalactiae trên cá rô phi 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 43 1. Kết luận 43 2. Đề xuất ý kiến 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Số phiếu điều tra tình hình dịch bệnh và sử dụng thuốc kháng sinh trên cá rô phi nuôi tại Hải Phòng 22 Bảng 2.2 Thuốc thử và cách đọc kết quả các phản ứng sinh hó API 20Strep 28 Bảng 2.3 Đánh giá đường kính vòng vô khuẩn chuẩn 30 Bảng 2.4 Dải cho phép của độ đục McFland 32 Bảng 3.1 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh tại Hải Phòng 33 Bảng 3.2 Thành phần loài vi khuẩn phân lập được từ cá mẫu cá bệnh 35 Bảng 3.3 Kết quả giám định và định danh vi khuẩn S. agalactiae bằng kit test API 20 Strep 39 Bảng 3.4 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của S. agalactiae với kháng sinh 40 Bảng 3.5 Kết quả gây bệnh thực nghiệm của S. agalactiae 41 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cá rô phi vằn Oreochromis niloticus 4 Hình 2.1 Sơ đồ khối phương pháp nghiên cứu 20 Hình 2.2 Cá rô phi có dấu hiệu bệnh Streptoccocus spp. 23 Hình 2.3 Cách mổ khám bệnh cá 23 Hình 2.4 Cách mổ sọ não cá 24 Hình 2.5 Sơ đồ cảm nhiễm lại vi khuẩn gây bệnh cho cá rô phi 30 Hình 2.6 Thí nghiệm cảm nhiễm lại cá ở các nồng độ vi khuẩn khác nhau 30 Hình 3.1 Dấu hiệu bệnh lý của cá lúc thu mẫu 34 Hình 3.2 Khuẩn lạc trên các môi trường thạch 37 Hình 3.3 S. agalactiae bắt màu Gram dương, hình cầu dạng chuỗi 37 Hình 3.4 Kết quả thử kit API 20 Strep định danh S. agalactiae 38 Hình 3.5 Kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh 41 1 MỞ ĐẦU Những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản (NTTS) đã không ngừng phát triển và ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong ngành Thủy sản nói riêng và kinh tế đất nước nói chung. Với kim ngạch xuất khẩu năm 2010 đạt 4,94 tỷ USD thì đây là một trong ba ngành có đóng góp lớn nhất cho tổng kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam. Tổng cục Thủy sản ( Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) cho biết, giai đoạn 2011 – 2015 ngành Thủy sản hướng đến sự phát triển bền vững, là một ngành xuất khẩu hàng hóa lớn, có khả năng cạnh tranh cao và hội nhập vững chắc với thế giới. Mục tiêu quan trọng hàng đầu là đẩy mạnh xuất khẩu đạt kim ngạch 6,5 tỷ USD vào năm 2015 và chiếm khoảng 37% trong khối nông lâm ngư nghiệp. Vì vậy việc quản lý dịch bệnh trên các đối tượng chủ lực là yếu tố quan trọng để đạt được mục tiêu trên. Nghề nuôi cá rô phi ngày càng phát triên mạnh mẽ, cá rô phi là loài cá được nuôi phổ biến thứ 2 trên thế giới sau loái cá chép. Cá rô phi là loài cá dễ nuôi, ít dịch bệnh, thức ăn không đòi hỏi chất lượng cao, giá thành sản xuất thấp nên các quốc gia đang phát triển đặc biết chú trọng nghề nuôi cá rô phi. Thêm vào đó thịt cá rô phi ngon, không có xương răm nên nhiều người tiêu dùng ưa chuộng. Do đó nghề nuôi cá rô phi được coi là một sinh kế tốt nhất cho người dân nghèo thoát khỏi nạn đói nghèo [17]. Ở Việt Nam có nhiều diện tích đất đai, vùng cửa sông, các sông, hồ chứa có điều kiện thích hợp để phát triển loài cá này, nhất là nuôi theo hình thức tập trung, thâm canh năng suất cao phục vụ cho xuất khẩu. Công nghệ sản xuất giống cá rô phi đơn tính đực (loại cho năng suất cao nhất) ở nước ta cũng đã làm được và thành công với tỷ lệ đực khá cao như: công nghệ sử dụng hormone, lai xa khác loài mà vẫn đảm bảo tiêu chuẩn an toàn thực phẩm của Mỹ. Hải Phòng là tỉnh nuôi cá rô phi nhiều khu vực phía bắc. Mô hình nuôi cá rô phi đơn tính mà Trung tâm Khuyến nông- Khuyến ngư Hải Phòng triển khai tại 2 huyện Tiên Lãng và Vĩnh Bảo đã giúp nông dân thu lãi 108 triệu đồng/ha trong năm 2012 vừa qua. Tại hầu hết các ao trình diễn, tỷ lệ cá sống đạt 90% và năng suất đạt được là 18,5 tấn/ha. Được biết, trung tâm cũng đang tổ chức xây dựng mô hình trình diễn “Nuôi thâm canh cá rô phi đơn tính đực theo hướng GAP” tại 2 huyện trên với 6 hộ tham gia, tổng diện tích ao nuôi rộng 2ha [4-13]. Tuy nhiên, nuôi cá rô phi phát triển mang lại hiệu quả kinh tế cho người nuôi thì bên cạnh đó dịch bệnh cũng bùng nổ trên diện rộng. Qua nghiên cứu, người ta đã chỉ 2 ra rằng bệnh ở cá rô phi chủ yếu là do vi khuẩn, nấm, virus và kí sinh trùng [14]. Đặc biệt là vi khuẩn Streptococcus spp. (liên cầu khuẩn) gây ra là nguyên nhân gây nên thiệt hại lớn cho cá rô phi nói riêng và cá nước ngọt nói chung, làm ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của ngành NTTS. Theo thống kê thì liên cầu khuẩn gây bệnh trên cá rô phi là hai loài Streptococcus iniae và Streptoccus agalactiae. Khi người nuôi gặp khó khăn trong vấn đề dịch bệnh thì thông thường biện pháp đầu tiên là sử dụng các chất diệt khuẩn hoặc kháng sinh. Việc sử dụng các chất này đem lại hiệu quả cho người nuôi [24]. Tuy nhiên việc lạm dụng các chất diệt khuẩn và kháng sinh trong NTTS công nghiệp đã xuất hiện nhiều dòng vi khuẩn kháng kháng sinh [13]. Những thiệt hại này không những ảnh hưởng đến ngành NTTS nói chung, trong đó có các đối tượng nuôi nước ngọt đặc biệt là cá rô phi. Nghiêm trọng hơn các dòng vi khuẩn kháng thuốc này có thể truyền các gen kháng thuốc cho vi khuẩn gây bệnh ở người, đe dọa đến sức khỏe của con người [33]. Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh đang là mối lo không chỉ người nuôi mà còn đối với các nhà quản lí sức khỏe cộng đồng bởi nó không những giảm hiệu quả của việc chữa trị mà còn tiềm ẩn nhiều nguy cơ đối với sức khỏe con người, nhất là các kháng sinh đã được cấm. Chính vì thế mục tiêu của đề tài “Phân lập và xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn vi khuẩn Streptococcus spp. gây bệnh trên cá rô phi nuôi tại Hải Phòng” nhằm đánh giá được tính kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ cá nuôi nước ngọt, từ đó xác định được loại thuốc kháng sinh đặc hiệu để trị bệnh do vi khuẩn gây bệnh trong những trường hợp cần thiết tại Việt Nam. Mục tiêu của đề tài: Bổ sung thông tin khoa học về bệnh vi khuẩn trên cá rô phi ở Việt Nam. Cung cấp thông tin trong phòng chống dịch bệnh thủy sản trên địa bàn nuôi tỉnh Hải Phòng. Nội dung của đề tài: - Xác định được nơi xảy ra bệnh trên cá rô phi nuôi tại địa bàn tỉnh Hải Phòng. - Phân lập, định danh được vi khuẩn Streptococcus spp. gây bệnh trên cá rô phi nuôi tại Hải Phòng. - Xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Streptococcus spp. gây bệnh trên cá rô phi nuôi tại Hải Phòng. Ý nghĩa của đề tài: [...]... khoa học: Kết quả phân lập, định danh và xác định sự kháng thuốc của vi khuẩn Streptococcus spp gây bệnh trên cá rô phi nuôi tại Hải Phòng là cơ sở khoa học cho các đề tài nghiên cứu về Bệnh thủy sản tiếp theo  Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả phân lập, định danh và xác định sự kháng thuốc của vi khuẩn Streptococcus spp gây bệnh trên cá rô phi nuôi tại Hải Phòng góp phần vào công tác dịch bệnh thủy sản, giảm... 10 Đà Nẵng – Ngô Quyền – Hải Phòng) 2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu Điều tra tình hình dịch bệnh và sử dụng kháng sinh trên cá rô phi tại Hải Phòng Thu mẫu cá bệnh tại hiện trường và nhận mẫu tại phòng Lab Thử kháng sinh đồ xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh Phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh trên cá rô phi Tái cảm nhiễm lại vi khuẩn gây bệnh trên cá Kết luận và đề xuất ý kiến Hình 2.1... bất kỳ loại vaccine phòng bệnh Streptococcus spp. gây bệnh trên cá rô phi được nghiên và ứng dụng vào sản xuất tại Vi t Nam Vì vậy, vi c phân lập và xác định đặc tính sinh học của Streptococcus spp. là cần thiết để giúp cho vi c nghiên cứu và sản xuất vaccine phòng bệnh Streptococcus spp trên cá rô phi nuôi tại Vi t Nam là rất cần thiết 1.4 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản... hộ gia đình nuôi cá rô phi và vi c sử dụng thuốc kháng sinh trong khi nuôi Bảng 2.1 Số phi u điều tra tình hình dịch bệnh và sử dụng thuốc kháng sinh trên cá rô phi nuôi tại Hải Phòng Thủy nguyên Số phi u điều tra Vĩnh Bảo Tiên Lãng 2.4.2 Phương pháp thu mẫu cá bệnh 30 30 30 - Một số mẫu cá rô phi bệnh tại 3 huyện: Thủy Nguyên, Vĩnh Bảo, Tiên Lẵng được Chi cục thú y tỉnh Hải Phòng gửi tới phòng Lab –... dịch bệnh có qui mô lớn Thông thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh Do vi c sử dụng không đúng cách và quá nhiều các loại thuốc kháng sinh nên đã gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc (antibiotic resistence) và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh trong thịt thuỷ sản Một nguyên nhân khác gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc là vi c sử dụng các loại kháng sinh. .. lượng rô phi nuôi ở châu Á với sản lượng của loài rô phi đó trên thế giới (đơn vị: tấn) thì của cá rô phi đen là 50.884/51.870; của có rô phi vằn là 384.976/426.773 Châu Á là nơi nuôi nhiều cá rô phi nhất trên thế giới, trong đó vùng Đông Á và Đông Nam Á thực sự đã là quê hương thứ hai của cá rô phi [10] Ba loài cá rô phi nuôi quan trọng nhất trên thế giới hiện nay là rô phi vằn O.niloticus, rô phi xanh... to tại 3 huyện Thủy Nguyên, Tiên Lãng, Vĩnh Bảo của Hải Phòng - Cá thí nghiệm dùng để phân lập vi khuẩn sau khi cảm nhiễm vi khuẩn Streptococcus spp phân lập được 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Điều tra tình hình bệnh và sử dụng kháng sinh trong nuôi cá rô phi tại Hải Phòng (Biểu mẫu điều tra: Phụ lục số 03) Tại Hải Phòng, một số vùng nuôi cá rô phi như huyện Thủy Nguyên, Tiên Lãng, Vĩnh Bảo Tại. .. tiên phân lập được ở cá Rô phi nuôi tại Nhật Bản gồm 10 hai loài S.shiloi và S.difficile Sau đó các loài vi khuẩn gây bệnh trên cá rô phi được phân lập lại trên cá rô phi là Streptococcus shiloi được là S.iniae còn S.difficile được phân lập là S.agalactiae [30] Dịch bệnh cá rô phi nuôi ở Thái Lan đã được quan sát thấy trong lồng trên sông Mê Kong tại thành phố Mukudahan, phía đông bắc Thái Lan vào tháng... 5.000 – 7.000 tấn cá rô phi được tiêu thụ nội địa, rô phi là loài có sức kháng bệnh và sức sống cao hơn so với các loài khác Tuy nhiên, mật độ nuôi thâm canh ngày càng cao làm phát sinh dịch bệnh Bên cạnh các bệnh ở cá rô phi do: nấm, vi khuẩn, virus, kí sinh trùng thì Streptococcus spp. gây bệnh cho cá rô phi nói chung và cá nuôi nước ngọt nói riêng đang gây thiệt hại kinh tế cho ngành nuôi trồng thủy... quá nhiều các loại thuốc kháng sinh nên đã gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc (antibiotic resistence) và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh trong thịt thuỷ sản Một nguyên nhân khác gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc là vi c sử dụng các loại kháng sinh với hàm lượng nhỏ trong thức ăn của thuỷ sản như một chất kích thích sinh trưởng [7] Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh là khả năng mà một sinh vật . tiêu của đề tài Phân lập và xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn vi khuẩn Streptococcus spp. gây bệnh trên cá rô phi nuôi tại Hải Phòng nhằm đánh giá được tính kháng thuốc của. - Xác định được nơi xảy ra bệnh trên cá rô phi nuôi tại địa bàn tỉnh Hải Phòng. - Phân lập, định danh được vi khuẩn Streptococcus spp. gây bệnh trên cá rô phi nuôi tại Hải Phòng. - Xác định. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN VI KHUẨN Streptococcus spp. GÂY BỆNH TRÊN CÁ RÔ PHI NUÔI TẠI HẢI PHÒNG Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản