TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ SÀI GỊN KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM PHỊNG TN CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giáo trình thực hành CƠNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM Năm học 2010-2011 NỘI QUI PHÒNG THÍ NGHIỆM Một số vi sinh vật sử dụng thí nghiệm gây bệnh cho người động vật, nội qui ban hành để ngăn ngừa nguy nhiễm bệnh cho sinh viên cán phòng thí nghiệm Bất kỳ cá nhân không tuân thủ tốt nội qui hay gây nguy hại cho người khác không phép vào phòng thí nghiệm Khi có thắc mắc cần phải yêu cầu hướng dẫn giáo viên cán phòng thí nghiệm Các qui định chung a Sinh viên vào phòng thí nghiệm phải mặc trang phục bảo hộ (áo khoác trắng) có bảng tên (tên sinh viên, lớp) b Sinh viên phải tham dự 100% buổi thí nghiệm c Sinh viên phải đến giờ, đến trễ 15 phút, sinh viên không phép vào phòng thí nghiệm xem vắng mặt không lý d Nếu lý bất khả kháng sinh viên không tham dự buổi thí nghiệm, sinh viên phải báo trước (hoặc vào buổi thí nghiệm) cho cán trách nhiệm (theo số điện thoại phòng thí nghiệm) e Khi làm hư hỏng trang thiết bị phòng thí nghiệm, sinh viên có nghóa vụ phải hoàn trả lại f Sinh viên phải đọc kỹ trước vào thí nghiệm không mang tài liệu thí nghiệm vào phòng g Khi làm đổ/tràn dung dịch làm bể dụng cụ thủy tinh phải báo cáo cho cán phòng thí nghiệm xin ý kiến giải h Sinh viên phải nắm vững thao tác vô trùng i Giảm thiểu hình thành khí dung thao tác j Rửa tay trước sau thí nghiệm k Không ăn/uống phòng thí nghiệm l Đọc kỹ nội qui/qui định có cửa phòng thí nghiệm m Vệ sinh bàn/ghế/kệ dụng cụ trước sau thí nghiệm n Đổ bỏ rác thải qui định o Không ngậm đồ dùng (viết, kiếng…) miệng hay gắn vào tai p Đọc ký tên vào qui định/nội qui để chắn sinh viên đọc hiểu q Trả đầy đủ dụng cụ sau hoàn thành xong thí nghiệm Dụng cụ phải rửa r Vệ sinh phòng thí nghiệm theo yêu cầu người phụ trách Các yêu cầu an toàn a Cột tóc, mặc phục trang bảo hộ (áo khoác trắng, găng tay chống nhiệt…) dùng dụng cụ/thiết bị lúc, nơi b Nghiêm cấm dùng miệng hút pipette Trong tình khẩn cấp a Lưu ý vị trí trang bị cấp cứu cần (dụng cụ y tế, bình cứu hỏa, vòi nước, điện thoại số điện thoại cấp cứu) b Báo cáo tình khẩn cấp cho giáo viên hướng dẫn cán phòng thí nghiệm c Bình tónh có tình khẩn cấp Phòng thí nghiệm chất lượng Phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực phẩm BÀI SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN VẬT LIỆU − Giống nấm men sử dụng Saccharomyces cerevisiae nuôi giữ ống nghiệm thạch nghiêng − Thiết bị lắc ổn nhiệt − Kính hiển vi − Buồng đếm hồng cầu − Dung dịch Methylen blue (đã lọc qua giấy lọc) Môi trường nhân giống: tương tự môi trường lên men M2 Môi trường lên men: 500ml − Môi trường lên men M1: Dịch chiết giá 500ml Peptone 1% Saccharose 5% Ampicilline 0,5ml (phòng TN chuẩn bị) Cách làm dịch chiết giá: 100g giá đậu (đã rửa sạch), thêm 500ml nước Đun sôi 30 phút Lọc qua vải mỏng (hoặc rây) lấy phần dịch − Môi trường lên men M2 : Peptone 1% Yeast extract 0,5% NaCl 0,5% Saccharose 5% Nước cho đủ 500ml Ampicilline 0,5ml (phòng TN chuẩn bị) − Môi trường lên men M3 : Saccharose 5% Peptone 1% K2HPO4 0,3% MgSO4.7H2O 0,2% Nước cho đủ 500ml Ampicilline 0,5ml (phòng TN chuẩn bị) − Môi trường lên men M4 : Dịch chiết cà chua 500ml Glucose 5% Ampicilline 0,5ml (phòng TN chuẩn bị) Cách pha chế dịch chiết cà chua: 150g cà chua lột vỏ, cắt nhỏ đun sôi với 500 ml nước 30 phút Lọc qua vải mỏng (hoặc rây) lấy phần dịch CÁCH THỰC HIỆN Nhân giống (do cán PTN thực hiện): - Giống từ ống nghiệm thạch nghiêng chuyển vào 0,5l môi trường M2 chứa 02 bình tam giác 500 ml (đã trùng, để nguội) - Tiến hành nuôi cấy 72 điều kiện nhiệt độ phòng Sản xuất sinh khối: - Chuẩn bị môi trường lên men (M1, M2, M3 M4) - Chuyển giống vào bình tam giác 1000ml chứa 500ml môi trường lên men Tỷ lệ cấy giống từ – 20% (tùy theo yêu cầu giáo viên hướng dẫn) - Cho bình tam giác vào thiết bị lắc ổn nhiệt, lắc với tốc độ 220 rpm - Nhiệt độ: 28 – 35oC; pH 4.5 - 7.0 (tùy theo yêu cầu giáo viên hướng dẫn) THEO DÕI CÁC CHỈ TIÊU KHI TIẾN HÀNH NUÔI CẤY THU SINH KHỐI Theo dõi tiêu sau: giờ/lần a) Tổng số tế bào / ml (sử dụng buồng đếm hồng cầu) b) Độ hấp thu dịch nuôi cấy sinh khối λ = 600nm c) Tỉ lệ tế bào chết d) Tỉ lệ tế bào nấm men nảy chồi CÁCH TIẾN HÀNH Đo độ hấp thu A600nm - Pha loãng dịch nuôi cấy nấm men: lấy 1ml dịch nuôi cấy pha loãng với ml nước ống nghiệm Lắc Đo độ hấp thu dung dịch bước sóng λ = 600nm Đếm buồng đếm hồng cầu - Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy nấm men theo độ pha loãng khác (tùy thuộc vào thời điểm nuôi cấy, thông thường ta pha loãng từ đến 20 lần) - Lấy 1ml dung dịch mẫu pha loãng cho vào ống nghiệm Bổ sung giọt methylen blue Lắc phút Cho dung dịch ống nghiệm lên buồng đếm hồng cầu quan sát kính hiển vi + Đếm tổng số tế bào ô vuông lớn + Đếm tổng số tế bào chết (màu xanh) ô vuông lớn + Đếm tổng số nấm men nảy chồi ô vuông lớn Lưu ý: tính tế bào có chồi < ½ tế bào mẹ; chồi > ½ tế bào mẹ tính tế bào riêng lẻ; thời gian từ lấy mẫu đến đếm xong phải < 15 phuùt N = {a/b x 400/0.1} x 103 x n N1 = {a1/b x 400/0.1} x 103 x n N2 = {a2/b x 400/0.1} x 103 x n Tỉ lệ tế bào nấm men chết (%) = N1/ N x 100; Tỉ lệ nảy chồi (%) = N2 / N x 100 Trong đó: N: tổng số tế bào 1ml mẫu nghiên cứu N1: tổng số tế bào chết 1ml mẫu nghiên cứu N2: tổng số tế bào nảy chồi 1ml mẫu nghiên cứu a: tổng số tế bào ô vuông lớn a1: tổng số tế bào chết ô vuông lớn a2: tổng số tế bào nảy chồi ô vuông lớn b: số ô vuông nhỏ ô vuông lớn (16 x = 80 ô vuông nhỏ) 400: tổng số ô vuông nhỏ 0.1: thể tích dịch tế bào (tính mm3) chứa ô trung tâm 103: số chuyển mm3 thành ml (1000mm3 = 1ml) n: độ pha loãng mẫu dung dịch nuôi cấy nấm men CÁC THÔNG SỐ VỀ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM MEN TRONG MẪU THÍ NGHIỆM Thời gian hệ (g) Nếu số tế bào ban đầu mà N0 sau n lần phân chia ta có tổng số tế bào N, với t = (t2 – t1) biểu thị sai khác thời gian t1 thời gian t2 (trong trường hợp thí nghiệm này, t = t2 – t1 = giờ) g = t/n = lg2 (t2 – t1)/ (lgN – lgN0) Hằng số tốc độ phân chia (c) Giá trị nghịch đảo thời gian hệ số lần phân chia sau đơn vị thời gian (tức sau giờ) gọi số tốc độ phân chia (c) Hằng số tốc độ phân chia phụ thuộc vào: loài vi sinh vật, nhiệt độ nuôi cấy, môi trường nuôi cấy, … c = 1/g = n/t Hằng số tốc độ sinh trưởng (µ) Mối quan hệ số tốc độ sinh trưởng (µ), số tốc độ phân chia (c) thời gian hệ (g): µ = 0.69 c = 0.69/g TRÌNH BÀY KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Từ kết thu nhận tính toán tiến hành lập bảng kết vẽ đồ thị sau: Bảng kết thí nghiệm Thời gian (giờ) A600nm lgN lgN1 lgN2 (tb/ml) (tb/ml) (tb/ml) Tỉ lệ chết (%) Tỉ lệ nảy chồi (%) g c (giờ) giờ: thời điểm vừa cho giống vào môi trường nuôi cấy a) Tổng số tế bào theo thời gian (giờ) b) Tỉ lệ tế bào chết (%), tỉ lệ nảy chồi (%) theo thời gian (giờ) c) A600nm theo thời gian (giờ), A600nm theo tổng số tế bào d) g, c, µ theo thời gian (giờ) Ghi chú: Sinh viên tham khảo thêm tài liệu: Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty Vi sinh vật học Nhà xuất giáo dục, 1997 Trang 375 - 378 Sinh viên chuẩn bị môi trường phòng TN trước ngày BÀI SẢN XUẤT THẠCH DỪA Thạch dừa (Nata De Coco) sản phẩm phổ biến ưa chuộng Sản phẩm thạch dừa trở thành ăn quen thuộc người dân thành phố Tuy nhiên tiềm lớn cho sản phẩm thạch dừa thị trường nước ngoài, đặc biệt nước: Đài Loan, Nhật, Mỹ, Anh Vì vậy, sản xuất thạch dừa đa dạng hóa sản phẩm hướng đem lại lợi ích kinh tế Thạch dừa giải khát truyền thống Philippines đưa vào thị trường Việt Nam từ thập niên 90 Thạch dừa sản phẩm thu từ trình lên men acetic vi khuẩn nhóm Acetobacter môi trường nước dừa già Thạch dừa loại sản phẩm thực phẩm thể keo trắng (dạng gel) thạch agar làm từ nước dừa già, ăn có tính chất giải khát tạo cảm giác khoái mùi thơm, vị ngon ngọt, dai giòn đặc trưng dùng với sirô Dưới kính hiển vi thạch dừa khối sợi nhỏ rối bù mà chất hemicellulose – polysaccharide, không tan nước, tan dung dịch kiềm acid Sản phẩm thạch dừa giá trị dinh dưỡng cao có đặc tính kích thích hoạt động nhu động ruột Nhờ vậy, giúp cho việc tiết thể dễ dàng đánh chất xơ tốt cho hệ thống tiêu hóa Giống hoạt hóa Xử lý nguyên liệu (nước dừa già) Giống cấp Phối chế theo công thức Giống cấp Thanh trùng môi trường Giống cấp Làm lạnh 30oC Cho vào khay vô trùng đậy giấy để lên men (chiều cao chất lỏng 1-2cm) (28-30oC, 9-10 ngày) Lên men tónh Thu hoạch, xử lý thạch dừa thô (rửa sạch, tẩy màu, trung hòa acid, khử mùi) Cắt miếng Ngâm, xả nước Nấu sirô, bổ sung hương Vào lọ, trùng Làm nguội, kiểm tra, dán nhãn Thành phẩm 10 Môi trường Môi trường giữ giống: Nước dừa giaø 1000ml Saccharose 5% Acid aectic (99%) 12ml KH2PO4 0,07% (NH4)2SO4 5g MgSO4 7H2O 1ml (stock solution) Agar 2% Moâi trường nhân giống môi trường lên men tương tự agar Môi trường giữ giống nhân giống phải tiến hành tiệt trùng 121oC 20 phút Môi trường lên men, sau bổ sung chất khoáng (chưa bổ sung acid acetic), ta tiến hành đun sôi 15 phút Để nguội nhiệt độ phòng Sau đó, bổ sung 12ml acid acetic Qui trình thực Nhân giống cấp 1: Giống vi khuẩn Acetobacter xylinum cấy vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường nhân giống, nuôi cấy 30oC 24 Nhân giống cấp 2: Từ ống giống cấp 1, tiến hành cấy chuyền vào bình tam giác chứa 200ml môi trường nhân giống Nuôi cấy tónh (hoặc lắc) điều kiện nhiệt độ 30oC ngày Lên men thạch dừa - Giấy báo đậy sấy khử trùng 150oC - Khay nhựa rửa lau kỹ cồn 96o - Cho môi trường lên men vào khay cho độ dày môi trường 1-2 cm - Cấy bình tam giác chứa giống cấp vào khay 11 - Đậy kín khay giấy báo (3 lớp), buộc kỹ dây thun để yên – 10 ngày (đôi kéo dài đến 15 ngày) - Lên men nhiệt độ phòng (28 -30oC) Thu nhận sản phẩm Ban đầu nước dừa màu trắng có mùi thơm thu hoạch miếng thạch dừa có màu vàng nhạt – mùi nồng Khi thu hoạch thạch dừa chia làm loại: + Loại 1: hai mặt láng, u + Loại 2: bị mốc, có u hai bên mặt, không láng Dùng dao cắt thạch thành miếng nhỏ, có dạng khối vuông tương đối đồng (2 x x 2,5 cm) Vắt cho miếng thạch khô hoàn toàn Ngâm thạch hỗn hợp dung dịch Na2CO3 3-5% CaCO3 5% thời gian 30 phút, sau vắt cho miếng thạch nước hoàn toàn Mục đích trình ngâm dung dịch Na2CO3 để trung hòa làm mùi chua acid acetic dư miếng thạch CaCO3 góp phần tẩy màu miếng thạch Đun nước sôi 100oC cho thạch vào chờ cho sôi lại giữ 30 phút Đun sôi để đuổi khử hoàn toàn mùi chua acid sót lại thạch, mặt khác làm miếng thạch Để cho miếng thạch nguội, vắt cho miếng thạch nước hoàn toàn Cho vào lọ thủy tinh Bổ sung Natri benzoat (0,1% w/w) vào lọ chứa thạch dừa Bổ sung hương vải (0,01% v/w) Chuẩn bị dung dịch đường cát trắng 70% (w/v), đun sôi để đường hòa tan hoàn toàn Rót dung dịch sirô vào lọ thủy tinh nóng Tỉ lệ cái/nước 50/50 (w/w) Đóng nắp hộp sau rót dung dịch sirô trùng 100oC (đun cách thủy) 30 phút Ta sản phẩm thạch dừa đóng hộp Lưu ý: Lọ thủy tinh phải có nắp đậy kim loại Lọ thủy tinh nắp rửa xà phòng sấy khô 70oC 12 BÀI ỨNG DỤNG ENZYME α-AMYLASE VÀ β-AMYLASE TRONG SẢN XUẤT ĐƯỜNG MẠCH NHA Giới thiệu Đường mạch nha (hỗn hợp maltose, glucose, dextrin mạch ngắn,) dùng rộng rãi sản xuất bánh kẹo Mạch nha sản phẩm thuỷ phân tinh bột (sắn, bắp, gạo ) Hiện công nghệ sản xuất mạch nha enzyme amylase ứng dụng phổ biến giới Amylose Amylopectin Glucose, Maltose 13 Dextrin Nguyên vật liệu Tinh bột khoai mì Enzyme -amylase -amylase Máy quang phổ Thiết bị ổn nhiệt Bếp điện từ Xác định hoạt tính enzyme sử dụng: 3.1 Xác định hoạt tính enzyme α-amylase (phương pháp Heinkel): Hoạt tính amylase biểu thị số mg tinh bột bị thủy giải ml dung dịch enzyme (hay 1mg nguyên liệu chứa enzyme) phút điều kiện chuẩn (tùy thuộc vào loại enzyme) Cách tiến hành: Dựng đường chuẩn tinh bột: ng Tinh boät 1% (ml) DD đệm 10 Nồng độ tinh bột (mg/ml) Hút 1ml dd từ ống nghiệm, thêm ml dd I2KI pha loãng 500 lần Đo mật độ quang bước sóng 620nm, dựng đường chuẩn Xác định hoạt tính enzyme: Tinh bột 1% DD enzyme (ml) DD HCl 0,1N (ml) DD enzyme (ml) Thử thật (3 ống) 0,5 Để ổn nhiệt 80oC, phút 14 Thử không (3 ống) 5 0,5 5 Hút 1ml từ ống nghiệm trên, thêm vào ống ml dd I2KI pha loãng 500 lần Lắc đều, đo mật độ quang 620nm Chú ý: Dung dịch tinh bột 1% pha dung dịch đệm Dung dịch Iod: 1g I2 2g KI, thêm nước đủ 100ml, bảo quản lạnh Cách tính hoạt tính enzyme: HT (UI/ml) = X: số mg tinh bột suy từ đường chuẩn V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng (10,5 ml) v: thể tích enzyme sử dụng (0,5 ml) t: thời gian phản ứng (5 p) 3.2 Xác định hoạt tính enzyme β-amylase Tiến hành tương tự nhiệt độ 60oC Tiến hành Tinh bột Nước, 90oC Hồ hoá α-amylase, 80oC Dextrin hoá amylase, 60oC Đường hoá 15 Mạch nha 4.1 Hồ hoá tinh bột Cân tinh bột, cho tinh bột vào nước, khuấy đun cách thuỷ đến nhiệt độ dung dịch đạt nhiệt độ hồ hoá (tuỳ vào loại tinh bột, thông thường > 65oC) Duy trì nhiệt độ đến dung dịch hồ hoá hoàn toàn Trong trường hợp enzyme có nhiệt độ hoạt động cao, nên bổ sung trực tiếp enzyme vào dịch tinh bột tiến hành dextrin hóa 4.2 Thuỷ phân tinh bột nhóm tiến hành thuỷ phân tinh bột với điều kiện khác 50 ml dung dịch tinh bột nồng độ 8%, enzyme -amylase 50 U/g tinh bột (80oC x 30 phút) -amylase 50 U/g tinh bột (60oC x 30 phút) 50 ml dung dịch tinh bột nồng độ 8%, enzyme -amylase 100 U/g tinh bột (80oC x 30 phút) -amylase 100 U/g tinh bột (60oC x 30 phút) 50 ml dung dịch tinh bột nồng độ 15%, enzyme -amylase 50 U/g tinh bột (80oC x 30 phút) -amylase 50 U/g tinh bột (60oC x 30 phút) 50 ml dung dịch tinh bột nồng độ 15%, enzyme -amylase 100 U/g tinh bột (80oC x 30 phút) -amylase 100 U/g tinh bột (60oC x 30 phút) Dừng phản ứng cách đun mẫu bếp từ sôi 10 phút 16 4.3 Xác định hàm lượng đường khử dịch sau thuỷ phân 4.3.1 Xây dựng đường chuẩn • Pha maltose nước với nồng độ khác nhau: 0%, 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 1.0% • Cho 0.3 ml dung dịch chuẩn vừa pha vào 0.9 ml dung dịch DNS, đun sôi phút , để nguội (cho nhanh ống nghiệm vào nước lạnh), đo độ hấp thu máy quang phổ bước sóng 575 nm Dùng excel vẽ đường thẳng quan hệ nồng độ maltose độ hấp thu Viết phương trình đường chuẩn 4.3.2 Xác định nồng độ đường khử • Lấy ml dung dịch vừa thuỷ phân pha loảng đến 10 lần (a) Cho 0.3 ml dung dịch vừa pha loảng vào 0.9 ml dung dịch DNS, đun sôi phút, để nguội đo độ hấp thu máy quang phổ bước sóng 575 nm • So sánh với đường chuẩn Xác định nồng độ đường khử (b) • Nồng độ đường khử dịch sau thuỷ phân (a x b) Tính hiệu suất đường hóa Chú ý: Trước thủy phân nên cân trước trọng lượng hỗn hợp tinh bột enzyme, sau trình thủy phân nên cân lại bổ sung thêm nước để bù vào lượng nước bị bay để xác định hàm lượng đường khử cho xác 17 ... tình khẩn cấp cho giáo viên hướng dẫn cán phòng thí nghiệm c Bình tónh có tình khẩn cấp Phòng thí nghiệm chất lượng Phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực phẩm BÀI SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN... theo thời gian (giờ) Ghi chú: Sinh viên tham khảo thêm tài liệu: Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty Vi sinh vật học Nhà xuất giáo dục, 1997 Trang 375 - 378 Sinh viên chuẩn bị môi trường... THẠCH DỪA Thạch dừa (Nata De Coco) sản phẩm phổ biến ưa chuộng Sản phẩm thạch dừa trở thành ăn quen thuộc người dân thành phố Tuy nhiên tiềm lớn cho sản phẩm thạch dừa thị trường nước ngoài, đặc