BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ðỖ VĂN TUÂN PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ VI KHUẨN VÀ NẤM BỆNH CỦA VI TẢO SCENEDESMUS QUADRICAUDA LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ðỖ VĂN TUÂN PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ VI KHUẨN VÀ NẤM BỆNH CỦA VI TẢO SCENEDESMUS QUADRICAUDA CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN ðỨC BÁCH HÀ NỘI - 2014 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN - Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. - Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 01 tháng 5 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN ðỗ Văn Tuân Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các tập thể, cá nhân, gia đình cùng bạn bè đồng nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Đức Bách đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như hoàn chỉnh luận văn. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô thuộc Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ Sinh học ứng dụng, đã giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này. Để hoàn thành khoá học này, tôi còn nhận được sự động viên hỗ trợ rất lớn của gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện về vật chất và tinh thần để tôi học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn./. TÁC GIẢ Đỗ Văn Tuân Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt và kí hiệu v Danh mục các bảng vi Danh mục hình vii PHẦN I MỞ ðẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích và yêu cầu 2 1.2.1 Mục đích 2 1.2.2 Yêu cầu 2 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu chung về vi tảo 3 2.1.1 Hình thái cơ thể, cấu trúc và sinh sản 3 2.1.2 Vai trò của vi tảo 4 2.2 Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo 7 2.2.1 Khả năng kháng vi khuẩn của vi tảo 7 2.2.2 Khả năng kháng vi nấm của vi tảo 10 2.3 Tổng quan về vi tảo Scenedesmus quadricauda 12 2.3.1 Vị trí phân loại 12 2.3.2 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và sinh sản của vi tảo Scenedesmus quadricauda 12 2.3.3 Sự phân bố của vi tảo Scenedesmus quadricauda 13 2.4 Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo Scenedesmus quadricaida 14 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iv PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16 3.1 Vật liệu, thời gian và địa điểm nghiên cứu 16 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 16 3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16 3.2 Nội dung nghiên cứu 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Phân lập và định danh vi tảo Scenedesmus quadricauda 17 3.3.2 Chiết dịch tảo bằng các dung môi khác nhau 22 3.3.3 Phân tách các thành phần dịch chiết bằng sắc ký lớp mỏng 24 3.3.4 Thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của dịch chiết 25 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết quả phân lập tảo Scenedesmus 28 4.2 Đặc điểm sinh học tảo Scenedesmus sp. 29 4.3 Nhân vùng gene ITS-1 và xác định trình tự 30 4.4 Định danh bằng so sánh trình tự 32 4.5 Chiết rút các thành phần hợp chất và tách phân đoạn 33 4.6 Khả năng kháng vi khuẩn và nấm của dịch chiết 34 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Đề nghị 39 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU S. quadricauda Scenedesmus quadricauda X. oryzae pv oryzae Xanthomonas oryzae pv oryzae R. solanacearum Ralstonia solanacearum H. maydis Helminthosporium maydis S. aureus Staphylococcus aureus S. epidermidis Staphylococcus epidermidis E. coli Escherichia coli S. platensis Spirulina platensis C. vulgaris Chlorella vulgaris E. viridis Euglena viridis C. reinhardtii Chlamydomonas reinhardtii O. sancta Oscillatoria sancta S. grantiana Spirogyra grantiana D. olivaceous Desmococcus olivaceous C. humicola Chlorococcum humicola T. erythraeum Trichodesmium erythraeum C. disperses Chroococcus disperses C. ellipsoidea Chlorella ellipsoidea C. grovesii Chara grovesii C. callicoma Cladophora callicoma H. reticulatum Hydrodictyon reticulatum S. leibleinii Schizomeris leibleinii P. corium Phormidium corium S. bijugatus Scenedesmus bijugatus S. obliquus Scenedesmus obliquus Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp vi DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 2.1: Khả năng kháng vi khuẩn của dịch chiết một số loài vi tảo 9 Bảng 2.2: Khả năng kháng vi nấm của vi tảo 11 Bảng 2.3. Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo Scenedesmus 14 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Vị trí đoạn ITS1 21 3.2 Cấu tạo của máy chiết Soxhlet 22 3.3 Chiết rút phân đoạn bằng n- hexan và ethyl ether 23 4.1 Phân lập tảo Scenedesmus 28 4.2 Hình thái của chủng tảo Scenedesmus sp. 29 4.3 Đồ thị sinh trưởng của tảo Scenedesmus sp. 30 4.4 Kết quả nhân đoạn ITS1 của tảo Scenedesmus sp. 30 4.5 Kết quả đọc trình tự vùng ITS1 32 4.6 Kết quả BLAST đoạn ITS1 tảo Scenedesmus sp. với cơ sở dữ liệu NCBI 33 4.7 Thành phần các nhóm chất trong dịch chiết 34 4.8 Biểu đồ khả năng kháng vi khuẩn R. solanacearum của dịch chiết tảo S. quadricauda trong các dung môi 35 4.9 Khả năng kháng vi khuẩn R. solanacearum của dịch chiết tảo S. quadricauda 35 4.10 Biểu đồ khả năng kháng vi khuẩn X. oryzae pv oryzae của dịch chiết tảo S. quadricauda 36 4.11 Khả năng kháng vi khuẩn X. oryzae pv oryzae của dịch chiết tảo S. quadricauda 36 4.12 Biểu đồ khả năng kháng nấm H. maydis của dịch chiết tảo S. quadricauda 37 4.13 Khả năng kháng nấm H. maydis của dịch chiết tảo S. quadricauda 37 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 1 PHẦN I MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Trong số các loài tảo được biết hiện nay, vi tảo (microalgae) chiếm tỉ lệ lớn, đa dạng về thành phần loài và phân bố rộng trong đó có khoảng hơn 1400 loài tảo nước ngọt và 530 loài tảo nước mặn [Dương Đức Tiến, Võ Hành, 1997; Phạm Bình Quyền et al., 2002]. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy một số loài vi tảo nước ngọt chứa các hoạt chất sinh học có tác dụng kháng virus, vi khuẩn và nấm, trong đó bao gồm một số loài thuộc chi Scenedesmus [Beena et al., 2011, Vinay Kumar et al., 2013], Spirulina [Justella et al., 2011; Sayda et al., 2012, Hemtanon et al., 2005], Chlorella [Fabian et al., 2013]. Với sự phong phú và đa dạng về thành phần loài, việc khai thác các hợp chất tự nhiên từ vi tảo có thể mở ra hướng nghiên cứu sử dụng các hợp chất này chống lại vi khuẩn và nấm gây bệnh, đặc biệt trong nông nghiệp. Trong sản xuất nông nghiệp, nhất là đối với các cây trồng có ý nghĩa kinh tế như lạc, cà chua, khoai tây vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh rất nghiêm trọng. Đây là bệnh phổ biến và gây tổn thất nghiêm trọng làm giảm đáng kể đến năng suất và chất lượng của nông sản phẩm [Nguyễn Tất Thắng et al., 2011]. Ngoại trừ việc sử dụng một số chế phẩm kháng sinh và các biện pháp canh tác, cho đến nay vẫn chưa có biện pháp phòng trừ bệnh héo xanh hiệu quả. Một số tác nhân gây bệnh hại cây trồng nghiêm trọng khác hiện nay phải kể đến đó là vi khuẩn X. oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa. Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn X. oryzae pv oryzae đã trở thành một trong những bệnh tàn phá nghiêm trọng những giống lúa hiện nay, cây lúa bị nhiễm bệnh trong giai đoạn đẻ nhánh mạnh sẽ bị giảm năng suất từ 20 đến 40%, nếu nhiễm ở giai đoạn đầu gây suy giảm năng suất lên đến 50% [Jeung Ju, 2006]. Nấm H. maydis gây bệnh đốm lá nhỏ ở ngô làm tổn thương lá, gây ảnh hưởng đến khả năng quang hợp và làm giảm năng suất [Abdel, 2012; Farhan et al., 2012]. Cho đến nay biện pháp phòng và trị bệnh hiệu quả nhất là sử dụng thuốc hóa học. Tuy nhiên việc sử dụng thuốc hóa học hiện [...]... minh trong vi t o còn ch a nhi u ho t ch t sinh h c có tác d ng như ch t kháng sinh có kh năng kháng vi khu n và vi n m, ñã m ra m t hư ng nghiên c u m i trong vi c phòng tr các b nh do vi khu n và vi n m gây ra 2.2 Kh năng kháng vi khu n và n m b nh c a vi t o T nh ng năm 40 c a th k trư c vi c s d ng các ch t kháng sinh chi t xu t t n m m c, vi khu n ñã t ra hi u qu trong vi c tr các vi khu n và n m... Ngoài ra t o S quadricauda có kh năng sinh trư ng trong môi trư ng dinh dư ng ñơn gi n, k c trong các th y v c ô nhi m và d dàng nuôi tr ng quy mô l n Xu t phát t th c t ñó, chúng tôi th c hi n ñ tài Phân l p và kh o sát kh năng kháng m t s vi khu n và n m b nh c a vi t o Scenedesmus quadricauda 1.2 M c ñích và yêu c u 1.2.1 M c đích Nghiên c u này nh m phân l p và kh o sát kh năng kháng vi khu n X oryzae... 1: Phân l p và ñ nh danh vi t o S quadricauda N i dung 2: Kh o sát kh năng kháng vi khu n X oryzae pv oryzae, R solanacearum và n m H maydis c a các lo i d ch chi t vi t o S quadricauda N i dung 3: Phân tách và xác ñ nh các nhóm ho t ch t kháng khu n b ng s c ký l p m ng 3.3 Phương pháp nghiên c u H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn th c s Khoa h c Nông nghi p 16 3.3.1 Phân l p và ñ nh danh vi. .. oryzae, R solanacearum và n m H maydis c a các lo i d ch chi t vi t o S quadricauda 1.2.2 Yêu c u - Phân l p và ñ nh danh ñư c vi t o S quadricauda - ðánh giá ñư c kh năng kháng vi khu n X oryzae pv oryzae, R solanacearum, và n m H maydis c a các lo i d ch chi t vi t o S quadricauda - Phân tách ñư c nhóm ch t kháng khu n có trong d ch chi t b ng s c ký l p m ng H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn... kháng sinh c ñi n không còn h u d ng b i s gia tăng kh năng kháng l i kháng sinh c a tác nhân gây b nh Phương hư ng gi i quy t ñó chính là tìm ra các lo i kháng sinh m i, t nh ng ngu n cung c p m i thay vì s d ng các ngu n cũ, và vi t o là ñ i tư ng ñang ñư c nhi u nhà nghiên c u quan tâm và ng d ng trong vi c s n xu t các ch t kháng sinh m i 2.2.1 Kh năng kháng vi khu n c a vi t o Phát hi n v kh năng. .. ng tràn lan các kháng sinh ph r ng và s suy gi m mi n d ch do nhi m virus HIV S gia tăng các b nh liên quan ñ n vi n m ngày m t nhi u và khó ñi u tr hơn, ñòi h i m t n l c tìm ki m nh ng ch t có kh năng c ch n m b nh an toàn và hi u qu hơn Kh năng ñ i kháng vi n m c a vi t o m i ñư c nghiên c u r ng rãi trong nh ng năm g n ñây, m t s k t qu ñáng chú ý ñư c trình H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n... gi i phóng Hình th c sinh s n h u tính r t hi m khi xu t hi n [Francis, 1996] 2.3.3 S phân b c a vi t o Scenedesmus quadricauda Vi t o S quadricauda phân b dư i d ng trôi n i và ñáy c a các th y v c nư c ng t và nư c l kh p nơi trên th gi i Nh ng nghiên c u v s phân b c a t o thu c chi Scenedesmus nói chung và loài S quadricauda nói riêng ñư c th c hi n t nh ng năm 80 c a th k XX Tây Ban Nha có nhi... loài thu c chi Scenedesmus ñã ñư c nghiên c u v kh năng kháng vi khu n và n m b nh M t s lo i d ch chi t t o S quadricauda ñư c ti n hành th nghi m ho t tính kháng m t s loài vi khu n và n m b nh trong ñi u ki n phòng thí nghi m, k t qu cho th y các lo i d ch chi t acetone, diethyl ether và methanol ñ u cho ho t tính kháng các lo i vi khu n E coli, B subtilis, S aureus, P aeruginosa và các lo i n m... i vi khu n và n m khác nhau H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn th c s Khoa h c Nông nghi p 15 PH N III V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 V t li u, th i gian và ñ a ñi m nghiên c u 3.1.1 V t li u nghiên c u Vi t o S quadricauda ñư c phân l p xã C Bi, huy n Gia Lâm, thành ph Hà N i M t s ch ng vi khu n, n m b nh: - Vi khu n X oryzae pv oryzae gây b nh b c lá b nh ñ m lá lúa và N m H maydis gây ngô - Vi. .. linolenic có kh năng kháng l i vi khu n S aureus S aureus là lo i vi khu n gây nhi m trùng có kh năng kháng l i m t s kháng sinh thông thư ng [Ohta et al., 1994] Cũng v i nghiên c u trên vi khu n S aureus, m t công b khác ñã phát hi n thêm các acid béo có trong t o Phaeodactylum tricornutum có kh năng kháng v i loài vi khu n này n ng ñ r t nh Các acid béo ñó là H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n . cấu trúc và sinh sản 3 2.1.2 Vai trò của vi tảo 4 2.2 Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo 7 2.2.1 Khả năng kháng vi khuẩn của vi tảo 7 2.2.2 Khả năng kháng vi nấm của vi tảo 10 2.3. Khả năng kháng vi khuẩn của dịch chiết một số loài vi tảo 9 Bảng 2.2: Khả năng kháng vi nấm của vi tảo 11 Bảng 2.3. Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo Scenedesmus 14 Học vi n. tài Phân lập và khảo sát khả năng kháng một số vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo Scenedesmus quadricauda . 1.2. Mục ñích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Nghiên cứu này nhằm phân lập và khảo sát khả