Sở Khoa học và Công nghệ TPHCM Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài (Chương trình vườn ươm sáng tạo khoa học và công nghệ trẻ) Tên đề tài: Khảo sát thực vật học, thành phần hoá học và thử độc tính trên một số dòng tế bào ung thư của tơ xanh (Cassytha filiformis L.) ở vùng Đồng Tháp. Chủ nhiệm đề tài: Bùi Thế Vinh Cơ quan (Tổ chức) chủ trì đề tài: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ Năm 2013 Tên đề tài: Khảo sát thực vật học, thành phần hoá học và thử độc tính trên một số dòng tế bào ung thư của tơ xanh (Cassytha filiformis L.) ở vùng Đồng Tháp. Chủ nhiệm đề tài: Bùi Thế Vinh Cơ quan (Tổ chức) chủ trì đề tài: Trung tâm Phát triển Khoa học v à Công nghệ Trẻ Thời gian thực hiện: từ tháng 12 năm 2011 đến tháng 12 năm 2012 Kinh phí được duyệt: 80 triệu đồng Kinh phí đã cấp: 61,72 triệu đồng theo hợp đồng số 282/HĐ – SKHCN ngày 21/12/2011 ký giữa Sở Khoa học và Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh, Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ, Chủ nhiệm đề tài nghiên cứu khoa học. Mục tiêu: - Khảo sát đặc điểm thực vật học của tơ xanh. - Phân tích thành phần hoá thực vật, định tính và định lượng alkaloid có trong tơ xanh - Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất alkaloid từ tơ xanh. - Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết, phân đoạn alkaloid toàn phần và các alkaloid tách được. Nội dung: Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện Khảo sát đặc điểm thực vật học của tơ xanh tại khu di tích Gò Tháp, huyện Tháp Mười, Đồng Tháp và đặc điểm thực vật học của tơ hồng để tránh nhầm lẫn. Khảo sát đặc điểm thực vật học của tơ xanh tại khu di tích Gò Tháp, huyện Tháp Mười, Đồng Tháp. So sánh với đặc điểm thực vật học của tơ hồng. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của tơ xanh Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của tơ xanh Định tính, định lượng alkaloid có trong tơ xanh Định tính, định lượng alkaloid có trong tơ xanh Chiết tách và xác định cấu trúc của alkaloid thu được từ tơ xanh Chiết tách và đo phổ NMR và xác định được cấu trúc của 1 alkaloid thu được từ tơ xanh. Hoạt tính độc tế bào của cao chiết và alkaloid chiết tách từ tơ xanh Hoạt tính độc tế bào của cao chiết và alkaloid chiết tách từ tơ xanh Phần mở đầu 1. Tên đề tài: Khảo sát thực vật học, thành phần hoá học và thử độc tính trên một số dòng tế bào ung thư của tơ xanh (Cassytha filiformis L.) ở vùng Đồng Tháp. 2. Chủ nhiệm đề tài: Bùi Thế Vinh 3. Cơ quan (Tổ chức) chủ trì đề tài: Trung tâm Phát triển Khoa học v à Công nghệ Trẻ 4. Thời gian thực hiện: từ tháng 12 năm 2011 đến tháng 12 năm 2012 Kinh phí được duyệt: 80 triệu đồng Kinh phí đã cấp: 61,72 triệu đồng theo hợp đồng số 282/HĐ – SKHCN ngày 21/12/2011 ký giữa Sở Khoa học và Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh, Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ, Chủ nhiệm đề tài nghiên cứu khoa học. 5. Mục tiêu: - Khảo sát đặc điểm thực vật học của tơ xanh. - Phân tích thành phần hoá thực vật, định tính và định lượng alkaloid có trong tơ xanh - Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất alkaloid từ tơ xanh. - Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết, phân đoạn alkaloid toàn phần và các alkaloid tách được. 6. Sản phẩm của đề tài: - Báo cáo phân tích đặc điểm thực vật học, hoá học của tơ xanh - 1 hợp chất Alkaloid chiết tách được - 2 bài báo khoa học trên tạp chí chuyên ngành trong nước. Những chữ viết tắt ACN Acetonitrile CH 2 Cl 2 Dicloromethane CHCl 3 Chloroform dd Dung dịch DĐVN Dược điển Việt Nam EtOH Ethanol EtOAc Ethyl acetat HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao M Trung bình (Mean) MeOH Methanol MPLC Medium Pressure Liquid Chromatography MS Khối phổ (Mass Spectra) NCI Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute) NMR Nuclear Magnetic Resonance NXB Nhà xuất bản OD Mật độ quang (Optical Density) PE Petroleum Ether UV Tử ngoại (Ultraviolet) SKLM Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) R f Ratio of Flow RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) THF Tetrahydrofuran TP.HCM Thành Phố Hồ Chí Minh t R Thời gian lưu (Retention time) tr., pp. Trang TT Thuốc thử MỤC LỤC TRANG Đặt vấn đề 1 1. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 3 1.1. Đặc điểm sinh học và thành phần hoá học của cây tơ xanh 3 1.2. Những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài 4 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 6 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị 6 2.1.1. Nguyên liệu 6 2.1.2. Hóa chất và trang thiết bị 6 2.2. Phương pháp nghiên cứu về thực vật học 7 2.2.1. Thu mẫu và xử lý mẫu 7 2.2.2. Khảo sát đặc điểm hình thái 7 2.2.3. Khảo sát đặc điểm vi học 7 2.3. Phương pháp nghiên cứu về hóa học 8 2.3.1. Độ tinh khiết 8 2.3.2. Phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật 9 2.3.3. Chiết xuất Alkaloid 12 2.3.4. Tinh chế và phân lập Alkaloid 14 2.3.5. Xác định các đặc tính lý hóa của Alkaloid tách được 15 2.4. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học 16 2.4.1. Thử nghiệm SRB 16 2.4.2. Thử nghiệm WST-1 18 2.4.3. Phân tích western-blot 19 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31 3.1. Kết quả nghiên cứu thực vật học 31 3.1.1. Khảo sát về phân bố và sinh thái 31 3.1.2. Khảo sát về đặc điểm hình thái 31 3.1.3. Khảo sát đặc điểm vi học 32 3.2. Phương pháp nghiên cứu về hóa học 41 3.2.1. Độ tinh khiết 41 3.2.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 41 3.3 .Chiết xuất Alkaloid 46 3.3.1. Chiết xuất Alkaloid bằng dung dịch acid loãng trong nước 46 3.3.2. Chiết xuất Alkaloid bằng dung dịch acid loãng trong cồn 47 3.3.3. Định tính Alkaloid thô của 2 phương pháp chiết bằng kĩ thuật SKLM 48 3.3.4. Phân lập Alkaloid 48 3.3.5. Các đặc tính lý hóa của Alkaloid đã phân lập 50 3.4. Kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học 56 3.4.1. Thử nghiệm SRB 56 3.4.2. Thử nghiệm WST-1 57 3.4.3. Thử nghiệm Western blot 60 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 4.1. Kết luận 62 4.1.1 Nghiên cứu về thực vật học 62 4.1.2. Nghiên cứu về hóa học 62 4.1.3. Hoạt tính sinh học 62 4.2. Đề nghị 62 Tài liệu tham khảo 64 DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 1. Cấu trúc khung aporphin 4 Hình 2. Cây tơ xanh kí sinh trên cây phi lao và trên cây lức. 35 Hình 3. Dạng hoa,quả,hạt của cây tơ xanh. 35 Hình 4. Dạng hoa, quả của cây tơ xanh. 36 Hình 5. Phân tích hoa tơ xanh. 36 Hình 6. Hạt tơ xanh cắt dọc và cắt ngang. 36 Hình 7. Vi phẫu thân tơ xanh (X10). 37 Hình 8. Chi tiết các mô tơ xanh 38 Hình 9. Soi bột dược liệu tơ xanh (X40) 38 Hình 10. Vi phẫu trục phát hoa tơ xanh 39 Hình 11. So sánh vi phẫu thân tơ xanh (a) và thân tơ hồng (b) 40 Hình 12. Kết quả định tính Alkaloid bằng phản ứng hóa học. 44 Hình 13. SKLM định tính Alkaloid.Phát hiện: Hơ trên hơi Iod. 44 Hình 14. SKLM định tính Alkaloid 45 Hình 15. SKLM định tính Alkaloid(phun Dragendorff) 45 Hình 16. SKLM định tính Alkaloid trong dịch chiết của 2 phương pháp chiết . 48 Hình 17. Thăm dò hệ dung môi rửa cột trên sắc kí lớp mỏng. 48 Hình 18. SKLM kiểm tra các phân đoạn. 49 Hình 19. Tương quan HMBC và COSY của A1 533 Hình 20. Công thức của Cassythine 54 Hình 21. Đồ thị so sánh giá trị IC 50 (phương pháp WST-1) của các mẫu thử trên dòng HeLa và A549 60 Hình 22. Kết quả Western blot xác định sự cảm ứng apoptosis 611 Sơ đồ 1. Chuẩn bị các dịch chiết 10 Sơ đồ 2. Qui trình chiết Alkaloid bằng acid loãng trong nước. 46 Sơ đồ 3. Qui trình chiết Alkaloid bằng acid loãng trong cồn 47 DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Cấu trúc các alkaloid có khung aporphin. 4 Bảng 2. Tóm tắt quy trình phân tích sơ bộ hóa thực vật 11 Bảng 3. Các thông số về cột sắc kí. 14 Bảng 4. So sánh sự khác nhau về hình thái của tơ xanh trên cây chủ khác nhau32 Bảng 5. So sánh vi phẫu thân tơ xanh và tơ hồng 40 Bảng 6. Độ ẩm dược liệu. 41 Bảng 7. Độ tro toàn phần của dược liệu. 41 Bảng 8. Độ tro không tan trong HCl 41 Bảng 9. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật. 42 Bảng 10. Kết quả xác định từng hợp chất. 43 Bảng 11. Kết quả kiểm tra các phân đoạn của cột 49 Bảng 12. Kết quả các chất thu được qua sắc kí cột và sklm chế hóa. 50 Bảng 13. Kết quả khảo sát đặc tính lý hóa các chất thu được 50 Bảng 14. Kết quả phổ IR của A1 và A2 50 Bảng 15. Phổ NMR 1 chiều và 2 chiều của A1 so với Cassythine 51 Bảng 16. Tỉ lệ phần trăm gây độc tế bào của Atp và MeOH 56 Bảng 17. IC50 của mẫu Atp và MeOH (Phương pháp SRB) 57 Bảng 18. Tỉ lệ phần trăm gây độc tế bào của Atp, MeOH, A1 và A2 58 Bảng 19. IC50 của mẫu Atp, A1 và A2 trên dòng A549 ( WST-1) 58 Bảng 20. IC50 của mẫu MeOH, Atp, A1 và A2 trên dòng HeLa (WST-1) 59 1 Đặt vấn đề Trong nỗ lực phát triển, khai thác nguồn tài nguyên dược liệu phong phú đáp ứng cho nhu cầu trong nước ta hiện nay, “chiến lược phát triển ngành dược giai đoạn đến 2010” có nêu rõ: “Phải từng bước đáp ứng nguồn nguyên liệu làm thuốc bảo đảm sản xuất trong nước 60% nhu cầu thuốc phòng bệnh và chữa bệnh xã hội”. Hiện nay, các nước trên thế giới đã đẩy mạnh việc nghiên cứu các chế phẩm mới từ cây thuốc, doanh thu các thuốc từ cây cỏ chiếm tỷ phần khá cao trong thị trường thuốc ở nhiều nước. Tỷ lệ dùng thuốc y học cổ truyền để thay thế hoặc hỗ trợ thuốc Tây ngày càng nhiều, bằng chứng là tỷ lệ hiệu thuốc y học cổ truyền/hiệu thuốc Tây: ở Trung Quốc: 11/10, Nhật Bản: 7/10, ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng thuốc cho trên 80 triệu dân hàng năm là rất lớn, nhưng tỷ lệ này chỉ là 1/10, dù vậy, sản xuất dược ở nước ta hơn 90% nguyên liệu phải nhập khẩu (theo báo cáo tổng kết công tác dược của cục quản lý dược Việt Nam năm 2005). Vì vậy, việc phát triển ngành dược nước ta hiện nay, nguồn dược liệu thiên nhiên góp phần không nhỏ, thậm chí rất quan trọng với thực tế: nước ta có nguồn dược liệu phong phú, có kinh nghiệm sử dụng thuốc từ thiên nhiên lâu đời, có điều kiện môi trường phù hợp cho nuôi trồng phát triển nhiều loại dược liệu. Trong đợt điều tra sơ bộ nguồn tài nguyên dược liệu vùng đồng bằng sông Cửu Long do Trung tâm Sâm & Dược liệu thực hiện, phát hiện vùng Đồng Tháp Mười có tơ xanh (Cassytha filiformis), mọc hoang và ký sinh trên các thực vật khác như tràm gió (Melaleuca leucadeudron), lức (Pluchea indica) với lượng sinh khối lớn. Tơ xanh là một cây thuốc dân gian đã được dùng từ lâu và phổ biến tại nhiều nước trên thế giới như ở Indonesia và Châu Phi dùng chữa giun sán, ký sinh trùng, Trung Quốc dùng chữa vàng da ở trẻ em. Nước ta, tơ xanh cũng được xem như một vị thuốc dân gian rất có ích, nước sắc tơ xanh dùng làm thuốc bổ, chữa thận hư, liệt dương, mắt mờ, chân tay yếu mỏi…. [3]. Từ những nghiên cứu về dược liệu này với yêu cầu thực tiễn phát triển nguyên liệu sạch dùng làm thuốc và thực phẩm chức năng ở trong nước, chúng tôi thực hiện đề tài với hy vọng làm tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn, tiến 2 đến việc ứng dụng một dược liệu vốn rất giàu trữ lượng ở khu vực Đồng tháp mười với mục tiêu: - Khảo sát đặc điểm thực vật học của tơ xanh. - Phân tích thành phần hoá thực vật, định tính và định lượng alkaloid có trong tơ xanh - Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất alkaloid từ tơ xanh. - Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết, phân đoạn alkaloid toàn phần và các alkaloid tách được. [...]... Asteraceae Một ít ngun liệu tươi dùng để nghiên cứu về thực vật học, còn lại rửa sạch phơi khơ bảo quản ở nhiệt độ phòng để nghiên về hóa học Mẫu nghiên cứu thực hiện trên tơ xanh ký sinh ở tràm gió (Melaleuca leucadeudron) - Các dòng tế bào HeLa, ung thư phổi NIC-H460, ung thư vú MCF-7 được cung cấp bởi PTN SHPT trường đại học Khoa học tự nhiên - Dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa và ung thư phổi A549... tính tế bào của chất nghiên cứu Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB - Giải đơng nguồn tế bào ung thư bảo quản trong Nitơ lỏng, ni cấy tế bào đến thế hệ thứ 4 (P4) - Ni tế bào trong bình ni cấy đạt độ phủ khoảng 70 - 80% - Phủ tế bào vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ tế bào/ giếng ban đầu là 104 tế bào/ giếng (đối với dòng tế bào HeLa và MCF-7) và 7,5.103 tb/giếng (đối với dòng. .. dụng độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư như HeLa, Mel-5, HL-60, chống ngưng tập tiểu cầu và kháng ký sinh trùng Trypanosoma brucei brucei gây bệnh ngủ, đặc biệt, nghiên cứu dược lý của tác giả này chứng minh actinodaphnine là alkaloid có tác dụng ức chế chọn lọc trên các dòng tế bào ung thư invitro (trên dòng tế bào thư ng 3T3 IC50: 66.4 µM, trên các dòng tế bào ung thư HeLa: 30.9 µM, Mel-5:... tăng trưởng tế bào theo cơng thức: Với - ODTN là giá trị OD của mẫu thử - ODC là giá trị OD của mẫu chứng (control) 2.4.2 Thử nghiệm WST-1 Ngun tắc Độc tính tế bào được khảo sát trên 2 dòng tế bào ung thư HeLa và A549, sử dụng muối tetrazolium WST-1 (phương pháp WST-1), phương pháp đo quang dựa trên sự khử tetrazolium thành formazan do các enzym dehydrogenase có trong tế bào còn sống Tiến hành: - Giải... quả & bàn luận 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả nghiên cứu thực vật học 3.1.1 Khảo sát về phân bố và sinh thái Ở Việt Nam tơ xanh phân bố phổ biến hầu như khắp nơi từ các tỉnh miền núi dưới 1500m đến vùng trung du các tỉnh đồng bằng, ven biển và hải đảo Ở khu vực phía Nam, qua khảo sát nhận thấy tơ xanh (Cassytha filiformis L.) thư ng gặp ở các vùng ngập nước, các tỉnh, thành ở đồng bằng, ven biển có... kế thử nghiệm của 1 mẫu, gồm: + 2 giếng tế bào + mơi trường ni cấy có chứa chất thử ở nồng độ khảo sát + 2 giếng khơng có tế bào + mơi trường ni cấy có chứa chất thử ở nồng độ khảo sát (2 giếng blank) Xử lý kết quả 17 Đối tượng & phương pháp - Sau khi có giá trị mật độ quang ở bước sóng 492nm và 620nm (ký hiệu là OD492 và OD620) - Tính giá trị OD’= OD492 - OD620 - Tính OD = OD’tb - OD’blank - Tính phần. .. về hình thái của tơ xanh trên cây chủ khác nhau Cây chủ Kích thư c thân Cỏ Dài 1, 5-2 m, Ф 1, 5-3 mm Màu sắc Vàng lục thân Kích thư c 5-8 mm quả 3.1.3 Khảo sát đặc điểm vi học Táo Dương Tràm gió Dài 1, 7-2 m Ф 0, 5-2 ,5 mm Dài 1, 2-1 ,5 m Ф 1-1 ,5 mm Dài 1,51,7m Ф 0, 5-2 mm Xanh lục Xanh lục Xanh sẫm 6-8 mm 5-6 mm 5-7 mm 3.1.3.1.Vi phẫu Vi phẫu thân Tiết diện tròn, phần vỏ bằng 1/3 trụ trung tâm Trên bề mặt thân... hình chữ nhật, kích thư c khoảng 15x20µm có cutin dày khoảng 1/3 kích thư c tế bào biểu bì - Ngay dưới biểu bì là lớp giao mơ góc khoảng 1-2 lớp tế bào - Nhu mơ vỏ gồm 5-7 hàng tế bào, kích thư c khoảng Ф=25µm - Các bó libe nằm trên một vòng khơng liên tục, khoảng 1 3-1 8 bó - Tầng phát sinh libe-mộc khơng liên tục - Các bó mộc và nhu mơ gỗ xếp thành vòng liên tục, khoảng 1 3-1 8 bó - Tế bào nhu mơ tuỷ lớn,... trong tế bào có chứa nhiều lục lạp - Sợi cương mơ tập hợp thành hình cung xếp thành vòng khơng liên tục nằm trên bó libe và trong phần trong nhu mơ vỏ, bề ngang khoảng 10µm, gồm 2-4 hàng tế bào - Các bó libe nằm trên một vòng khơng liên tục, khoảng 1 3-1 8 bó - Tầng phát sinh libe-mộc khơng liên tục - Các bó mộc với mạch mộc to và nhu mơ gỗ xếp thành vòng liên tục, khoảng 8-1 2 bó - Nhu mơ tủy, các tế bào. .. hành: - Giải đơng nguồn tế bào ung thư bảo quản trong Nitơ lỏng, ni cấy tế bào: Dòng HeLa và A549 trong mơi trường DMEM và RPMI có bổ sung 10 % FCS, ủ ở 370C, 5% CO2 đến thế hệ thứ 4 - Ni tế bào trong bình ni cấy đạt độ phủ khoảng 70 - 80% - Cho 90 µl dịch tế bào vào đĩa 96 giếng với lượng 1x104 tế bào/ giếng, tiếp tục thêm 10 µl dịch mẫu thử với nồng độ gấp 10 lần nồng độ muốn thử và ủ trong 24h, đo độ . Phần mở đầu 1. Tên đề tài: Khảo sát thực vật học, thành phần hoá học và thử độc tính trên một số dòng tế bào ung thư của tơ xanh (Cassytha filiformis L. ) ở vùng Đồng Tháp. 2. Chủ. - Khảo sát đặc điểm thực vật học của tơ xanh. - Phân tích thành phần hoá thực vật, định tính và định l ợng alkaloid có trong tơ xanh - Phân l p và xác định cấu trúc hợp chất alkaloid từ tơ. thành phần hoá học và thử độc tính trên một số dòng tế bào ung thư của tơ xanh (Cassytha filiformis L. ) ở vùng Đồng Tháp. Chủ nhiệm đề tài: Bùi Thế Vinh Cơ quan (Tổ chức) chủ trì đề