BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ THẢO NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI HÀ NỘI NĂM 2013 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ THẢO NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI HÀ NỘI NĂM 2013 CHUYÊN NGÀNH: THÚ Y MÃ SỐ: 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN PHAN HÀ NỘI – 2014 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: - Các kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. - Các thông tin trích dẫn trong luận văn được chỉ dẫn rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thảo Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được đề tài nghiên cứu này, tôi nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tận tình của các tập thể và cá nhân. Cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn và cảm ơn chân thành tới: Ban giám đốc Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, Ban đào tạo sau Đại học, Khoa Thú y, các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi học tập, tiếp thu nâng cao kiến thức của chương trình học. Đặc biệt tôi xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến Thầy TS. Lê Văn Phan - Giảng viên khoa Thú y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, đã tận tình chỉ dạy, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và viết khóa luận tốt nghiệp. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân cùng bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài. Một lần nữa tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn, cảm ơn chân thành nhất tới những tập thể và cá nhân đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập./. Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thảo Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1. Tính cấp thiết của đề tài. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tình hình bệnh LMLM trên thế giới và tại Việt Nam 3 1.1.1. Sơ lược về bệnh lở mồm long móng 3 1.1.2. Lịch sử và địa dư bệnh 3 1.1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trên thế giới 4 1.1.4. Tình hình nghiên cứu bệnh lở mồm long móng tại Việt Nam 6 1.2. Đặc điểm sinh học phân tử của virus lở mồm long móng 8 1.2.1. Căn bệnh 8 1.2.2. Sự phân bố các chủng virus gây bệnh 11 1.2.3. Dịch tễ học 12 1.2.4. Triệu chứng 14 1.2.5. Bệnh tích 18 1.2.6. Các phương pháp chẩn đoán 19 1.2.7. Phòng bệnh 23 1.2.8. Điều trị 24 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26 2.2. Đối tượng nghiên cứu 26 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 2.3. Nội dung nghiên cứu 26 2.4. Nguyên vật liệu 26 2.4.1. Hóa chất 26 2.4.2. Trang thiết bị máy móc 28 2.5 . Phương pháp nghiên cứu 28 2.5.1. Chẩn đoán virus gây bệnh Lở mồm long móng từ mẫu bệnh phẩm 28 2.5.2. Phân lập virus gây bệnh Lở mồm long móng từ mẫu bệnh phẩm 31 2.5.3. Giải trình tự gen VP1 và xây dựng cây phả hệ (phylogenetic tree) 33 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1. Kết quả chẩn đoán và định type virus gây bệnh Lở mồm long móng bằng phương pháp RT-PCR một bước (One-step RT-PCR) 34 3.2. Kết quả phân lập virus Lở mồm long móng type O 36 3.2.1. Kết quả nuôi cấy và duy trì tế bào BHK-21 36 3.2.3 Kết quả chuẩn độ virus LMLM 40 3.3. Kết quả giải trình tự gene mã hoá protein VP1 41 3.4. Kết quả xây dựng cây phả hệ (phylogenetic tree) 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 Kết luận 53 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG STT TÊN BẢNG TRANG Bảng 1.1: Tổng hợp tình hình dịch bệnh LMLM giai đoạn 1999 -2010 7 Bảng 1.2: Sự phân bố các type virus LMLM trên thế giới 11 Bảng 2.1: Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu 30 Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng RT-PCR 30 Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR 30 Bảng 3.1: Thông tin về 6 mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu 34 Bảng 3.2. Kết quả xác định hiệu giá virus (TCID 50 ) của các chủng virus LMLM phân lập được 41 Bảng 3.3. Thông tin một số chủng virus LMLM tham chiếu khác thuộc type O, Topotype ME-SA ở Việt Nam sử dụng trong nghiên cứu 43 Bảng 3.4. Tỷ lệ tương đồng (%) về gen VP1 của 6 chủng virus LMLMO/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013, O/VN/HN3/2013, O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013, và O/VN/HN6/2013 với nhau và với các chủng virus LMLM tham chiếu khác của Việt Nam 45 Bảng 3.5. Tỷ lệ tương đồng (%) về trình tự amino acid của gen VP1 của 6 chủng virus LMLMO/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013, O/VN/HN3/2013, O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013, và O/VN/HN6/2013 với nhau và với các chủng virus LMLM tham chiếu khác của Việt Nam 46 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC HÌNH STT TÊN HÌNH TRANG Hình 1.1. Bản đồ hiện trạng bệnh LMLM của các nước thành viên chính thức OIE (theo OIE, 2/2014) 5 Hình 1.2: Hình thái và cấu tạo virus Lở mồm long móng 9 Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virus LMLM 10 Hình 1.4: Sự phân bố bệnh LMLM trên thế giới tháng 9/2013 12 Hình 1.5: Niêm mạc lưỡi bò bong tróc 15 Hình 1.6: Một số triệu chứng xuất hiện ở trâu, bò 16 Hình 1.7: Một số triệu chứng xuất hiện ở lợn 17 Hình 1.8: một số hình ảnh lở mồm long móng trên dê 18 Hình 1.9: Hình ảnh bệnh tích trâu mắc LMLM 19 Hình 3.1: Kết quả chạy RT-PCR với cặp mồi định tính 1F/1R (Reid và cs., 2000). Sản phẩm PCR thu được có kích thước theo dự kiến là 328bp; Giếng 1-6: Các mẫu bệnh phẩm tương ứng với O/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013, O/VN/HN3/2013, O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013, O/VN/HN6/2013; M: DNA Marker 100bp (INtRON Biotechnology). 35 Hình 3.2:Kết quả định type virus LMLM bằng phương pháp RT-PCR. Giếng 1 - 6: Các mẫu bệnh phẩm tương ứng với O/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013, O/VN/HN3/2013, O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013, O/VN/HN6/2013; M: DNA Marker 100bp (INtRON Biotechnology) 36 Hình 3.3. Kết quả nuôi cấy tế bào BHK-21 dùng để phân lập virus LMLM 37 Hình 3.4: Gây nhiễm virus Lở mồm long móng lên tế bào BHK-21, đời thứ 1 (sau 24 giờ gây nhiễm virus) 38 Hình 3.5: Gây nhiễm virus Lở mồm long móng lên tế bào BHK-21, đời thứ 2 (sau 24 giờ gây nhiễm virus) 39 Hình 3.6: Gây nhiễm virus Lở mồm long móng lên tế bào BHK-21, đời thứ 3 (sau 24 giờ) 40 Hình 3.7. Hiệu giá virus (TCID 50 ) của các chủng virus LMLM phân lập được 41 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii Hình 3.8: Kết quả chạy RT-PCR với cặp mồi VN-VP1F/VN-VP1R (Le và cs., 2012). Sản phẩm PCR thu được có kích thước theo dự kiến là 821 bp; Giếng 1 - 6: Các chủng virus LMLM type O tương ứng với O/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013, O/VN/HN3/2013,O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013, O/VN/HN6/2013; M: 1 Kb Marker ADN (INtRON Biotechnology). 42 Hình 3.9. So sánh trình tự gen VP1 của 6 chủng virus LMLM O/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013, O/VN/HN3/2013, O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013, và O/VN/HN6/2013 với nhau và với các chủng virus LMLM type O, topotype ME-SA tham chiếu khác của Việt Nam 47 Hình 3.9 (Tiếp). So sánh trình tự gen VP1 của 6 chủng virus LMLM O/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013, O/VN/HN3/2013, O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013, và O/VN/HN6/2013 với nhau và với các chủng virus LMLM type O, topotype ME-SA tham chiếu khác của Việt Nam 48 Hình 3.10. So sánh trình tự amino acid suy diễn (deduced amino acid) của gen VP1 của 6 chủng virus LMLM O/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013, O/VN/HN3/2013, O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013, và O/VN/HN6/2013 với nhau và với các chủng virus LMLM type O, topotype ME-SA tham chiếu khác của Việt Nam 49 Hình 3.11. Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của 6 chủng virus LMLM type O (O/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013, O/VN/HN3/2013, O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013, và O/VN/HN6/2013) phân lập tại Hà Nội với các chủng virus LMLM tham chiếu khác. 51 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt Aa Amino acid BHK Baby Hamster Kidney Bp Base pair Cặp base Cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid α-MEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ELISA Enzyme Linked Imunosorbent Assay FMD Foot and Mouth Disease Bệnh lở mồm long móng LMLM Lở mồm long móng Nt Nucleotide OIEORF Office International des EpizootiesOpen Reading Frame Khung đọc mở ORFPCR Open Reading Frame Polymerase Chain Reaction Khung đọc mở PCRRNA Polymerase Chain ReactionRibonucleic acid RNART- PCR Ribonucleic acidReverse Trancription Polymerase Chain Reaction RT- PCRUTR Reverse Trancription Polymerase Chain ReactionUntranslated region Vùng không mã hóa UTR Untranslated region Vùng không mã hóa [...]... chẩn o n, định type, phân lập và giải trình tự gen của virus lở mồm long móng Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của virus lở mồm long móng Type O phân lập được tại Hà Nội năm 2013 2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn o n và định type nhanh các chủng virus LMLM gây bệnh - Phân lập virus LMLM trên... điểm và thời gian nghiên cứu - Đề tài được thực hiện tại phòng Nghiên cứu và phát triển (Research & Development Laboratory) của Công ty cổ phần phát triển công nghệ nông thôn (RTD) - Thời gian: 2 /2013 – 8/2014 2.2 Đối tượng nghiên cứu - Nghiên cứu được tiến hành trên các chủng virus LMLM type O phân lập được tại Hà Nội năm 2013 2.3 Nội dung nghiên cứu - Chẩn o n và định type virus gây bệnh ở mồm long. .. mồm long móng trong các mẫu bệnh phẩm thu thập được tại Hà Nội năm 2013 bằng phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction) - Phân lập virus Lở mồm long móng trên môi trường tế b o BHK-21 - Giải trình tự, phân tích trình tự gen cũng như trình tự amino acid suy diễn (deduced amino acid) của gen VP1 của các chủng virus LMLM type O phân lập được - Xây dựng cây phả hệ (phylogenetic... Cổ năm 2005 (Le và cs., 2010b) Tương tự năm 2011 và 2012, Le và cs cũng đã phát triển thành công phương pháp One-step multiplex RT-PCR để nhanh chóng chẩn o n và định type virus gây bệnh LMLM type O, A, Asia 1 đang lưu hành và gây bệnh trên đàn gia súc nuôi tại Việt Nam 1.2 Đặc điểm sinh học phân tử của virus lở mồm long móng 1.2.1 Căn bệnh 1.2.1.1 Các đặc tính sinh học chung của virus LMLM Virus lở. .. hội Năm 2004, dịch xảy ra ở cả 3 vùng miền, tăng hơn nhiều so với năm 2003 cả về diện dịch và số thiệt hại Số tỉnh có dịch LMLM là 24 tỉnh , trong đó có 9 tỉnh do virus LMLM type A, 12 tỉnh do virus LMLM type O và 3 tỉnh do cả hai virus LMLM type O và A Năm 2005, số tỉnh có dịch LMLM là 37 tỉnh, trong đó có 3 tỉnh do virus LMLM type A, 13 tỉnh do virus LMLM type O, 3 tỉnh do cả hai virus LMLM type O. .. nghiên cứu gần đây, khi giải mã và phân tích gen VP1 của các chủng virus LMLM type O và Asia1 phân lập được tại Việt Nam v o những năm 2005, 2006 và 2007 thấy type O phân lập được thuộc phân type Southeast Asia (SEA) và chi Mya-98 trong tổng số 10 phân type được ghi nhận trên thế giới Trong khi đó, chủng virus LMLM type Asia1 được xác định thuộc nhóm IV và V và có độ tương đồng rất cao với chủng virus. .. lở mồm long móng có kích thước vô cùng nhỏ bé phải quan sát dưới kính hiển vi điện tử Đây là loại vi sinh vật ký sinh nội b o tuyệt đối, nó chỉ có thể sống và nhân lên trong môi trường tế b o sống Virus không có cấu t o tế b o, người ta chia nó theo một giới riêng độc lập, nó chỉ gồm vỏ capsid (protein) bên trong là nhân (acid nucleic) được t o thành từ DNA hoặc RNA 1.2.1.2 Hình thái, cấu t o của virus. .. sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8 Hình 1.2: Hình thái và cấu t o virus Lở mồm long móng (Nguồn:http://ias-cnsh.org/TrangCh%E1%BB%A7/tabid/36/BlogDate/2009-1031/DateType/month/Default.aspx) Ở virus có vỏ bọc, acid nucleic chiếm một phần nhỏ 1-2% và ở virus trần là 25-50% so với cơ chất Trong quá trình nhiễm v o vật chủ, hệ gen của virus thoát khỏi vỏ protein và v o trong tế b o Nhân của virus LMLM là một. .. môi trường tế b o BHK-21 - Giải mã, phân tích gen VP1 (gen mã hóa cho kháng nguyên capsid của virus LMLM) của các chủng virus LMLM phân lập được tại Hà Nội năm 2013 - Xây dựng cây phả hệ (phylogenetic tree) để đánh giá về nguồn gốc tiến hóa, sự biến đổi di truyền của các chủng virus LMLM phân lập được 3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Phương pháp sinh học phân tử RT- PCR là một phương pháp... ngày càng tăng, đặc biệt là bệnh lở mồm long móng (LMLM ) Bệnh lở mồm long móng (LMLM) được Tổ chức Thú y Thế giới OIE (World Organisation for Animal Health) coi là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trong tất cả những bệnh truyền nhiễm ở gia súc Sự nguy hiểm của bệnh là do khả năng lây lan rất nhanh và mạnh Đến nay theo các tài liệu nghiên cứu, virus gây bệnh LMLM được chia thành 7 type là O, A, C, SAT1, . gen của virus lở mồm long móng. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của virus lở mồm long móng Type O phân lập được tại Hà Nội. NGUYỄN THỊ TH O NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI HÀ NỘI NĂM 2013 CHUYÊN NGÀNH: THÚ Y MÃ SỐ: 60.64.01.01 . 1.1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trên thế giới 4 1.1.4. Tình hình nghiên cứu bệnh lở mồm long móng tại Việt Nam 6 1.2. Đặc điểm sinh học phân tử của virus lở mồm long móng 8 1.2.1. Căn