Công nghệ Sinh học PGS.TS. Nguyễn Bá Lộc TRƯỜNG ĐHSP HUẾ Khoa: Sinh Học BÀI TIỂU LUẬN Học phần: Công nghệ Sinh học Đề tài: Học viên thực hiện: Phan Thị Ái Linh Giao viên hướng dẫn: Chuyên ngành: Thực Vật Học PGS.TS. Nguyễn Bá Lộc Khóa: XXII “Qúa trình can thiệp RNA” HVTH: Phan Thị Ái Linh 1 Công nghệ Sinh học PGS.TS. Nguyễn Bá Lộc BỐ CỤC ĐỀ TÀI A. Đặt vấn đề B. Nội Dung I . Giới thiệu về RNAi 1. Dòng thông tin di truyền trong tế bào 2. Khái niệm và vai trò của RNAi trong tế bào 2.1 Khái niệm 2.2 Vai trò 3. Lịch sử nghiên cứu II. Khám phá cơ chế RNAi và giải thưởng Nobel y học 2006 1. Quá trình nghiên cứu khám phá ra sự can thiệp RNA của Z.Fire và C.Mello 1.1 Thí nghiệm nghiên cứu 1.2 Những suy luận từ kết quả thí nghiệm : 2. Ý nghĩa của công trình nghiên cứu III. Bộ máy can thiệp RNAi 1. Các thành phần tham gia vào quá trinh can thiệp RNAi 1.1 siRNA : 1.2 miRNA : 2. Con đường hình thành các bộ máy can thiệp RNAi 2.1. Con đường hình thành siRNA : 2.2. Con đường hình thành miRNA : 3.Sự khác nhau giữa siRNA và miRNA IV. Cơ chế can thiệp RNA 1. Cơ chế chung 2. Cơ chế phân tử 2.1 Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA 2.2 Cơ chế làm tắt gene bởi miRNA V. Những thành tựu và triển vọng của việc nghiên cứu ứng dụng RNAi 1. Những thành tưu khoa học ứng dụng RNAi 2. Triển vọng của việc nghiên cứu ứng dụng RNAi C. Kết Luận Tài liệu tham khảo “Qúa trình can thiệp RNA” HVTH: Phan Thị Ái Linh 2 Công nghệ Sinh học PGS.TS. Nguyễn Bá Lộc A. ĐẶT VẤN ĐỀ Như chúng ta đã biết, trong tế bào có nhiều loại RNA khác nhau, mỗi loại đảm nhận một chức năng sinh hoc riêng biệt. Một số chức năng quan trọng của RNA: + Chức năng vận chuyển thông tin di truyền + Chức năng tham gia tổng hợp và vận chuyển Protein + Chức năng hoàn thiện các phân tử RNA + Ngoài ra RNA còn có các chức năng quan trọng khác + Đặc biệt gần đây các nhà sinh học phân tử đã phát hiện ra chức năng điều hoà biểu hiện gene của RNA Kể từ khi khám phá ra RNAi thì việc nghiên cứu cơ chế và ứng dụng của nó ngày càng trở thành một vấn đề lý thú thu hút sự quan tâm của các nhà sinh học góp phần tạo nên cơn sốt “ Thế giới RNA – RNA word ) . * Một số thuật ngữ : + RNAi : RNA inteference ( RNA can thiệp ) + dsDNA : double strand DNA ( DNA mạch kép dài) + miRNA : micro RNA ( tiểu RNA ) + RISC : RNA – incluced silencing complex (phức hệ tắt gene tích ứng bởi RNA) + Dicer : RNase III ( Một loại enzyme endonuclease ) + siRNA : small interfeing RNA ( RNA can thiệp kích thước nhỏ ) “Qúa trình can thiệp RNA” HVTH: Phan Thị Ái Linh 3 Công nghệ Sinh học PGS.TS. Nguyễn Bá Lộc B. NỘI DUNG I . Giới thiệu về RNAi 1.Dòng thông tin di truyền trong tế bào : Hình 1. Dòng thông tin di truyền trong tế bào - Thông tin di truyền lưu trữ trong DNA được sao chép sang RNA và sau đó được dùng để tổng hợp protein - Tuy nhiên không phải mọi thông tin di truyền đều được sử dụng mà chỉ có một phần thông tin di truyền trong hệ gene được sử dụng trong mỗi loại tế bào. - Việc gene nào được biểu hiện là do cơ chế kiểm soát của bộ máy sao chép DNA sang mRNA trong quá trinh phiên mã - Quá trình phiên mã cũng bị điều khiển bởi nhiều nhân tố khác và được con người nghiên cứu, tìm hiểu ngày càng rõ. 2. Khái niệm và vai trò của RNAi trong tế bào 2.1. Khái niệm RNAi “ RNA can thiệp ” ( RNAi ) là một hệ thống bên trong các tế bào sống , giúp kiểm soát được các gene đang hoạt động. Đó là những đoạn RNA ngắn có thể ức chế sự biểu hiện của các gene có trình tự tương đồng với nó. “Qúa trình can thiệp RNA” HVTH: Phan Thị Ái Linh 4 Công nghệ Sinh học PGS.TS. Nguyễn Bá Lộc Các phân tử RNAi này có thể gây lên các hiêu ứng: 1. Ức chế dịch mã đơn vị mRNA 2. Ức chế sự phiên mã của gene ở trong nhân 3. Phân giải mRNA 2.2. Vai trò RNAi RNAi có rất nhiều chức năng quan trọng trong tế bào : + Bảo vệ tế bào chống lại gene ký sinh trùng, virut và các yếu tố di truyền vận động ( Transposon). + Điều hoà biểu hiện gene . + Điều khiển sự phát triển của tổ chức. + Giữ gìn NST và tăng cường phiên mã. + Có thể RNAi còn có nhiều chức năng khác mà con người chua khám phá ra hết, và sẽ được khám phá dần dần trong tương lai. 3. Lịch sử nghiên cứu Trong lịch sử , sự can thiệp RNA được biết đến với những tên gọi khác như : RNA silening , quelling, cosuppresion, RNA inteference . . . . - Năm 1984, Pesthea và các cộng sự đã nghiên cứu kỹ thuật Antiense-RNA trên vi khuẩn Escherichia Coli. - Đến những năm dầu thâp niên 1990 một số nhà khoa học công bố kết qua nghiên cứu trên các tạp chi quốc tế ( Napoli và cộng sự , Vander và cộng sự). - Năm 1994 Cogoni và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm tăng màu cam của nấm Neurospora crassa - Năm 1995 trên tạp chí Cell số 81, nhóm nghiên cứu của Guo và Kemphues đã đưa ra bằng chứng đầu tiên trên tuyến trùng Caenorhabditis elegans rằng : Phân tử RNA chiều thuận ( sense RNA ) cũng gây ra sự ức chế gene. - Đến năm 1998, nhóm nghiên cứu Fire đã giải thích được điều nghịch lý này băng những thí nghiệm trên tuyến trùng C. elegans. - Năm 2000, trên tạp chí Nature cũng công bố việc phát hiện hiện tượng RNAi trên loài ruồi dấm ProSophila do nhóm nghiên cứu của Richard Cathew tiến hành - Năm 2001, lần đầu tiên RNAi được mô tả trong các tế bào động vật có vú ( Tuschl và cộng sự ) Năm 2006 giải thưởng Nobel sinh lý và y học cho phát hiện cơ chế RNAi của 2 nhà bác học Mỹ là Andrew Fire (ĐH Stanford) và Craig Mello (ĐH Massachusetts “Qúa trình can thiệp RNA” HVTH: Phan Thị Ái Linh 5 Công nghệ Sinh học PGS.TS. Nguyễn Bá Lộc Hình 2. 2 nhà bác học Mỹ đạt giải thưởng Nobel Năm 2006 II. Khám phá cơ chế RNAi và giải thưởng Nobel y học 2006 1. Quá trình nghiên cứu khám phá ra sự can thiệp RNA của Z.Fire và C.Mello: - Andrew Fire và Craig Mello đã tiến hành nghiên cứu về cơ chế điều khiển biểu hiện gien ở giun tròn Caenorhabditis elegans(C.elegans.). - Hai ông đã thực hiện hàng loạt các thí ngiệm ngoạn mục nhằm kiểm tra kiểu hình ảnh hưởng của việc tiêm RNA vào bộ phận sinh dục của C.elegans. 1.1. Thí nghiệm nghiên cứu: Hình 3. Thí nghiệm nghiên cứu “Qúa trình can thiệp RNA” HVTH: Phan Thị Ái Linh 6 Công nghệ Sinh học PGS.TS. Nguyễn Bá Lộc - Tiêm các phân tử mRNA mã hoá một protein cơ bắp ( sợi “ có nghĩa “ ) => không làm thay đổi hành vi của giun tròn. - Khi tiêm RNA “vô nghĩa” ( antisence RNA) cũng không tháy hiện tượng gì . - Tuy nhiên, khi Fire và Mello tiêm cả RNA “sence" và “antisence" vào cơ thể giun tròn, thấy giun có những chuyển động lạ, cụ thể là co giật. - Các chuyển động tương tự cũng xảy ra ở những con giun hoàn toàn thiếu một gien chịu trách nhiêm tạo protein cơ bắp . 1.2. Những suy luận từ kết quả thí nghiệm - RNA chuỗi đôi có thể làm các gien ngừng hoạt động (bất hoạt gen ) - Cơ chế can thiệp RNA này mang tính đặc trưng đối với gien mang mã di truyền giống với mã di truyền của phân tử RNA được tiêm vào. - Ngoài ra, cơ chế can thiệp RNA có thể lan giữa các tế bào và thậm chí được di truyền sang đời sau. Chỉ cần tiêm một lượng nhỏ phân tử RNAi cũng có thể đạt được kết quả mong muấn. Do vậy, có thể coi cơ chế can thiệp RNAi là một quá trình xúc tác. 1.3. Ý nghĩa khoa học của công trình nghiên cứu - Công trình nghiên cứu này của hai nhà bac hoc Z.Fire và C.Mello đã được công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/2/1998 . - Kết quả của nghiên cứu này vô cùng quan trọng : + Cung cấp lời giải thích cho các hiện tượng nghiên cứu ở thuạc vật.: Phiên mã bổ nhiệm gen im lặng ( PTGS- post transcriptional gene silening ) => làm sáng tỏ nhiều quan sát thí nghiệm mâu thuẫn và khó hiểu trong nhiều năm trước đây. + Đồng thời nó tiết lộ một cơ chế tự nhiên để kiểm soát dòng thông tin di truyền trong tế bào + RNAi được sử dụng trong khoa học cơ bản nghiên cứu chức năng của gene. + Với nghiên cứu mới này , giới khoa học cũng đang tìm ra các ứng dụng của RNAi trong những nghiên cứu y học chữa bệnh băng liệu pháp gene, các ứng dụng trên cây trồng, vật nuôi trong nông nghiệp nhằm tạo ra các sản phẩm với chất lượng tốt hơn. + Từ kết quả của nghiên cứu này đã mở ra nhiều hướng nghiên cứu và được tạp chí Science bình chọn là “ Break Through in 1998 “(Bước đột phá của năm 1998 ) dựa theo số lượng ra tăng cấp số nhân các bài báo khoa học đăng trên các tạp chí khoa học quốc tế hàng đầu. III. Bộ máy can thiệp RNA 1. Các thành phần tham gia vào quá trinh can thiệp RNAi Quá trình can thiệp RNAi được thực hiện bởi 2 cơ chế : + siRNA “Qúa trình can thiệp RNA” HVTH: Phan Thị Ái Linh 7 Công nghệ Sinh học PGS.TS. Nguyễn Bá Lộc + miRNA 1.1. siRNA : các thành phần tham gia - dsRNA ( double strand RNA – RNA sợi đôi ) : là những đoạn RNA dài mạch kép có trình tự bổ xung với gene đích ( target RNA ) có 2 đầu thò là 3’OH - Dicer : là một loại enzyme endonuclease ( Ribonuclease III ) chịu trách nhiệm hoàn thiện sợi dsRNA. - Phức hệ RISC (RNA – incluced silencing complex ) : Phức hệ gắng gene kích ứng bởi RNA. Phức hệ này có chứa enzyme helicase và một số protein trong đó quan trọng nhất là protein thuộc họ Agronaut ( liên kết RNA ) hoạt động như một endonuclea và cắt mRNA . - siRNA (small interfeing RNA ) : là RNA can thiệp kích thước nhỏ được tạo ra từ dsRNA 1.2. miRNA Là những đoạn RNA ngắn khoảng từ 19 – 24 nu, không tham gia vào quá trình tổng hợp protein. Bộ máy miRNA bao gồm : - Pri- mRNA ( primary-mRNA ) : chuỗi mRNA nguyên thuỷ , dài hàng nghìn nu và mang đầu 5’CAP, đuôi poly A. Pri- mRNA chữa ít nhất một hay nhiều vòng kẹp tóc ( hairpin ) mỗi vòng dài khoảng 70 nu. - Phức hệ RISC (RNA – incluced silencing complex ): Phức hệ gắng gene kích ứng bởi RNA. Phức hệ này có chứa enzyme helicase và một số protein trong đó quan trọng nhất là protein thuộc họ Agronaut ( liên kết RNA ) hoạt động như một endonuclea và cắt mRNA . - Hai enzyme cắt : + Drosha : ở trong nhân tế bào + Dicer : ở ngoài tế bào chất 2. Con đường hình thành bộ máy can thiệp RNAi 2.1 Con đường hình thành siRNA : Quá trình hình thành siRNA diễn ra ở tế bào chất (cytoplasma ) - Các đoạn dsRNA sợi kép được cắt bởi enzyme Dicer tạo ra những đoạn RNA ngắn ( siRNA ) - Sau đó các siRNA được tháo xoắn dưới táuc dụng của enzyme helicase và biến tính thành 2 mạch đơn khi gắng với phức hệ RISC. + Trong 2 mạch đơn này, chỉ mạch nào có đầu 5’ có hoạt lực với Agronauttrong phức hệ RISC mới gằn được với phức hệ RISC => tạo phức hợp siRNA-RISC + Mạch còn lại đầu 5’ không có hoạt lực với Agronaut => không liên kết với RISC được . - Sự xuất hiện của mạch đơn siRNA sẽ hoạt hoá RISC thành trạng thái hoạt động (RISC* ) “Qúa trình can thiệp RNA” HVTH: Phan Thị Ái Linh 8 Công nghệ Sinh học PGS.TS. Nguyễn Bá Lộc Hình 4. Con đường hình thành siRNA 2.2 Con đường hình thành miRNA - Quá trình hình thành miRNA diễn ra ở nhân tế bào (nuclear ) và trong tế bào chất ( cytoplasma) *Trong nhân : Các phân tử miRNA được tạo ra thông qua quá trình phiên mã từ các gen gọi là các phân tử miRNA nguyên thuỷ ( pri- miRNA ), các phân tử này có chúa các cấu trúc kẹp tóc ( hairpin ) - Các phân tử pri- miRNA được cắt bởi enzyme Drosha để tạo thành những sợi Pre- miRNA ( phân tử tiền microRNA ) => gọi là quá trình chế biến pri- miRNA - Các phân tử Pre- miRNA sẽ được di chuyển ra ngoài tế bào chất . * Tại Tế bào chất : - Pre- miRNA sau khi được di chuyển ra ngoài tế bào chất => sẽ được enzyme Dicer cắt thành những đoạn RNA nhỏ ( khoảng 19 – 21 nu ) - Các đoạn miRNA được tách đôi => tạo ra các sợi miRNA đơn. Trong đó sợi có dầu 5’ có hoạt lực vói Agronaut trong phức hợp RISC => sẽ kết hợp với phức hợp RISC tạo thành phức hệ miRNA-RISC . “Qúa trình can thiệp RNA” HVTH: Phan Thị Ái Linh 9 Công nghệ Sinh học PGS.TS. Nguyễn Bá Lộc Hình 5. Con đường hình thành miRNA 3. Sự khác nhau giữa siRNA và miRNA Tiêu chí siRNA miRNA Nguồn gốc RNA mạch kép (dsRNA ) có cấu trúc là chuỗi xoắn kép. Tiền miRNA(Pre- miRNA) có cấu trúc dạng thân vòng ( steen-loop ) hay dạng kẹp tóc (hairpin) Vị trí hình thành Xảy ra ở ngoài tế bào chất Gồm 2 quá trình trong nhân và ngoài tế bào chất. “Qúa trình can thiệp RNA” HVTH: Phan Thị Ái Linh 10 [...]...Công nghệ Sinh học PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Hình 6 Sự khác nhau giữa siRNA và miRNA IV Cơ chế can thiệp RNA 1 Cơ chế chung - Quá trình can thiệp RNA được kích hoạt khi phân tử RNA tồn tại trong tế bào với cấu trúc sợi đôi - RNA sợi đôi kích hoạt một cơ chế hoá sinh dể phân huỷ các phân tử mRNA có mã di truyền giống với nó - Khi các phân tử mRNA này biến mất => gene tương ứng bi... “Qúa trình can thiệp RNA 20 HVTH: Phan Thị Ái Linh Công nghệ Sinh học PGS.TS Nguyễn Bá Lộc C KẾT LUẬN Như chúng ta thấy, qua trên nửa thế kỷ, những nhà nghiên cứu sinh học phân tử đã thu được những khám phá ngoạn mục Sự khám ra tế bào có một cơ chế đặc biệt – cơ chế can thiệp RNA (RNAi – RNA interference), đã vượt quá mong đợi và mở rộng hiểu biết của chúng ta về cơ chế kiểm soát gene trong cơ thể sinh. .. trình can thiệp RNA 15 HVTH: Phan Thị Ái Linh Công nghệ Sinh học PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Hình 11 Cơ chế hình thành màu hoa hồng ở hoa hồng xanh của Florigene “Qúa trình can thiệp RNA 16 HVTH: Phan Thị Ái Linh Công nghệ Sinh học PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Hình 12 Hoa hồng xanh 1.2 iRNA với ung thư Trong những năm gần đây, ARN can thiệp (iRNA) đã nổi lên như là một cơ chế quản lý lớn trong biểu hiện gene ở sinh. .. đồng giữa siRNA và mRNA chỉ là một phần thì xu hướng xảy ra là sự ức chế dịch mã do khi chung bám trên mRNA => ngăn cản sự dịch chuyển của Ribosome trong quá trình dịch mã => quá trình dịch mã bi ngưng lại => không tạo ra được protein Hình 8 Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA “Qúa trình can thiệp RNA 13 HVTH: Phan Thị Ái Linh Công nghệ Sinh học PGS.TS Nguyễn Bá Lộc - Cơ chế tắt gene bởi siRNA có hiệu quả... nhau của RNA là cơ sở cho quan điểm cho rằng RNA có thể là đại phân tử sinh học xuất hiện đầu tiên trong quá trình tiến hoá chứ không phải là DNA hay protein như nhiều giả thiết trước đây “Qúa trình can thiệp RNA 21 HVTH: Phan Thị Ái Linh Công nghệ Sinh học PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Tài liệu tham khảo 1 http://vietsciences.free.fr 2 http://www.hmu.edu.vn 3 http:// www.thuvienkhoahoc.com 4 http://www.rnaiweb.com... nhiễm virus + Can thiệp RNA bảo đảm ổn định hệ gen bằng cách chống lại các yếu tố di truyền vận động(transposon): + Can thiệp RNA như cơ chế kiềm chế tổng hợp protein và điều khiển sự phát triển của tổ chức: + Can thiệp RNA như cơ chế giữ gìn nhiễm sắc tử cô đặc và tăng cừơng phiên mã: + Can thiệp RNA cống hiến một công cụ thí nghiệm mới để kiềm chế gene chuyên biệt Can thiệp RNA phải là một giải quyết... trình biểu hiện của hệ gene là rất quan trọng đối với giới sinh vật “Qúa trình can thiệp RNA 14 HVTH: Phan Thị Ái Linh Công nghệ Sinh học PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Hình 9 Cơ chế làm tắt gene bởi miRNA V Những thành tựu và triển vọng của việc nghiên cứu ứng dụng RNAi 1 Những thành tưu khoa học ứng dụng RNAi 1.1 Trong nông nghiệp - Tạo Hoa Hồng Xanh: Hình 10 Sự hình thành màu hoa hồng ở hoa “Qúa trình can. .. siRNA - Các miRNA có chiều dài khoảng 19-24 nu được tạo từ tác động cắt các đoạn Pre- miRNA có trình tự kẹp tóc (được phiên mã từ các đoạn DNA không mã hoá protein) bởi 2 enzyme là Drosha và Dicer - Gần 70% các miRNA được phát sinh liên quan đến sự điều tiết trong quá trình phiên mã tạo ra các mRNAvà các RNA không sinh tổng hợp các protein 30% còn lại được phát sinh độc lập không liên quan đến quá trình. .. trình can thiệp RNA 11 HVTH: Phan Thị Ái Linh Công nghệ Sinh học PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Hình 7 Cơ chế chung 2 Cơ chế phân tử 2.1 Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA - Trong tế bào, sự biểu hiện hoặc cảm ứng của RNA mạch kép dài là kết quả của sự bắt cặp giữa mạch mang mã ( sợi có nghĩa ) và mạch đối mã ( sợi vô nghĩa ) - Các đoạn dsRNA sợi kép dài được cắt bởi enzyme Dicer tạo ra những đoạn RNA ngắn ( siRNA... một cách đặc hiệu và nhưng RNA mục tiêu tiềm năng - Sợi đơn siRNA sau khi được nạp vào RISC được gọi là mạch hướng dẫn, nó đóng vai trò chỉ đạo trong việc đưa phức hợp siRNA-RISC* đến các phân “Qúa trình can thiệp RNA 12 HVTH: Phan Thị Ái Linh Công nghệ Sinh học PGS.TS Nguyễn Bá Lộc tử mRNA có trình tự bổ xung với nó.Việc chỉ đạo của siRNA thông qua một endonuclease có trong RISC là Agronaute protein . các bài báo khoa học đăng trên các tạp chí khoa học quốc tế hàng đầu. III. Bộ máy can thiệp RNA 1. Các thành phần tham gia vào quá trinh can thiệp RNAi Quá trình can thiệp RNAi được thực hiện. can thiệp RNA 1. Cơ chế chung - Quá trình can thiệp RNA được kích hoạt khi phân tử RNA tồn tại trong tế bào với cấu trúc sợi đôi. - RNA sợi đôi kích hoạt một cơ chế hoá sinh dể phân huỷ các phân. phân tử miRNA được tạo ra thông qua quá trình phiên mã từ các gen gọi là các phân tử miRNA nguyên thuỷ ( pri- miRNA ), các phân tử này có chúa các cấu trúc kẹp tóc ( hairpin ) - Các phân tử