1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ LUẬN ÁN 1. Tính cấp thiết của luận án Tôm hùm là một loại đặc sản được nhiều nước trên thế giới quan tâm nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cũng như bệnh trên tôm hùm nuôi, đặc biệt các nước như: Úc, Canada,…. Ở Việt Nam, nghề nuôi tôm hùm đã và đang phát triển từ những năm 2000 tại các tỉnh khu vực Nam Trung Bộ. Trong đó, Khánh Hòa có số lượng lồng nuôi chiếm khoảng 60% so với cả nước (29.206 lồng vào năm 2006) và nghề nuôi này thực sự mang lại hiệu quả kinh tế-xã hội cho địa phương. Tuy vậy, do sự phát triển tự phát, thiếu qui hoạch, thức ăn cho tôm là loại tươi sống với hệ số chuyển đổi cao, cùng với việc quản lý môi trường vùng nuôi và kỹ thuật nuôi chưa tốt đã tạo cơ hội cho các tác nhân gây bệnh phát triển, tạo thuận lợi cho sự bùng phát bệnh: đỏ thân, đen mang, mòn đuôi và đã gây thiệt hại đáng kể cho người nuôi tôm. Ngoài ra, chưa có công trình nghiên cứu và tài liệu nói về bệnh ở tôm hùm nuôi lồng tại Việt Nam. Xuất phát từ những yêu cầu cấp thiết của thực tiễn sản xuất đã nêu, luận án: “Nghiên cứu một số bệnh thường gặp ở tôm hùm bông (Panulirus ornatus Fabricius, 1798) nuôi lồng tại vùng biển Khánh Hoà và các biện pháp phòng trị” đã được thực hiện. 2. Mục tiêu của luận án Xác định được các tác nhân chính gây nên một số bệnh chủ yếu ở tôm hùm bông nuôi lồng tại tỉnh Khánh Hòa. Đưa ra cơ sở khoa học và các phương pháp phòng trị bệnh tôm hùm nuôi lồng tại địa phương. 3. Nội dung nghiên cứu của luận án + Điều tra thực trạng, phát hiện các bệnh chủ yếu ở tôm hùm bông nuôi lồng vùng biển Khánh Hòa. + Nghiên cứu một số bệnh có tần số bắt gặp cao và gây tác hại cho tôm hùm bông nuôi lồng tại Khánh Hòa. 2 + Thử nghiệm dùng thuốc và hóa chất để phòng trị bệnh ở tôm hùm bông nuôi lồng. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Góp phần làm phong phú thêm kết quả nghiên cứu bệnh học trên giáp xác nuôi ở Việt Nam. Đưa ra cơ sở và các biện pháp phòng trị bệnh cho tôm hùm ở Khánh Hòa và các tỉnh miền Trung Việt Nam. 5. Những đóng góp của luận án + Luận án là công trình có hệ thống đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu sâu về một số bệnh thường gặp ở tôm hùm bông (Panulirus ornatus) nuôi lồng. + Luận án đã nghiên cứu xác định tác nhân của hai bệnh: bệnh đỏ thân, bệnh đen mang ở tôm hùm bông nuôi lồng tại Khánh Hòa và các yếu tố liên quan đến sự bùng phát của hai bệnh này. + Luận án đã đưa ra cơ sở và các biện pháp phòng bệnh đỏ thân và bệnh đen mang ở tôm hùm bông nuôi lồng; đưa ra biện pháp trị bệnh đen mang, góp phần nâng cao năng suất, sản lượng tôm hùm nuôi ở Việt Nam, đặc biệt là tại Khánh Hòa. 6. Bố cục của luận án Luận án gồm 141 trang, trong đó có 23 bảng số liệu, 44 hình và được cấu trúc như sau: Mở đầu: 3 trang Chương 1: Tổng quan tài liệu 32 trang Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 25 trang Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 59 trang Kết luận và kiến nghị 2 trang Danh mục công trình công bố của tác giả 1 trang Tài liệu tham khảo: 19 trang (gồm 136 tài liệu tham khảo, trong đó có 32 tài liệu tiếng Việt và 104 tài liệu tiếng Anh) 3 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số đặc điểm sinh học và sinh thái phân bố của tôm hùm Panulirus spp 1.1.1. Đặc điểm sinh học tôm hùm Panulirus spp: đặc điểm hình thái, phân loại, chu kỳ sống, phân bố và dinh dưỡng đã được đề cập. 1.1.2. Sinh thái phân bố của tôm hùm Panulirus spp: nhiệt độ nước, độ mặn, nền đáy và độ sâu đã được đề cập trong luận án. 1.2. Tình hình nuôi tôm hùm trong nước và Thế giới 1.2.1. Tình hình nuôi tôm hùm trên Thế giới: các hình thức nuôi, loài tôm nuôi và một số quốc gia nuôi tôm hùm trên Thế giới được đề cập. 1.2.2. Tình hình nuôi tôm hùm bằng lồng tại Việt Nam: những nghiên cứu về nuôi tôm hùm, loài tôm nuôi, số lượng lồng và sản lượng tôm hùm nuôi tại Việt Nam đã được đề cập trong luận án. 1.3. Các nghiên cứu về bệnh ở tôm hùm nuôi 1.3.1. Một số phương pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu bệnh trên tôm hùm: Các phương pháp vi in vitro sinh vật học, mô bệnh học; kỹ thuật kính hiển vi điện tử, sinh học phân tử cũng đã được sử dụng. 1.3.2. Các nghiên cứu về bệnh ở tôm hùm trên Thế giới và VN: 1.3.2.1. Trên thế giới : hiện nay có các bệnh và hội chứng bệnh ở tôm hùm: bệnh do vi rút (PaV1), bệnh do vi khuẩn (bệnh đỏ đuôi, bệnh vỏ, ), bệnh do nấm (Fusarium, Lagenidium, ), bệnh do ký sinh trùng (vi bào tử trùng, trùng máu, ) và bệnh do các yếu tố vô sinh (do độc tố, do các yếu tố môi trường, ). 1.3.2.2. Tại Việt Nam: mới bắt đầu từ năm 2001 bởi Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Thị Bích Thúy và Võ Văn Nha. Ngoài ra, luận án cũng đề cập đến các nghiên cứu về bệnh sữa trên tôm hùm, một bệnh vừa xuất hiện vào năm 2006 và đầu 2007. 4 CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, phạm vi và địa điểm nghiên cứu: Một số bệnh thường gặp ở tôm hùm bông nuôi thương phẩm tại Khánh Hòa. 2.2. Vật liệu nghiên cứu: tôm hùm bông (Panulirus ornatus) 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Sơ đồ khối nghiên cứu của luận án: cũng đã được đề cập. 2.3.2. Phương pháp điều tra hiện trạng bệnh tôm hùm nuôi lồng: Thông tin được thu thập từ 2 nguồn thứ cấp và sơ cấp. 2.3.3. Các phương pháp phân tích mẫu đã được sử dụng + Phương pháp thu mẫu phân tích: thu chọn lọc, chọn tôm hùm sống có dấu hiệu đặc thù: đỏ thân (166 con), đen mang (97 con), tôm khỏe (50 con) của cùng một hộ nuôi từ năm 2003-2005. Mẫu nước thu ở đáy lồng nuôi, mỗi tháng 1 lần trong năm 2003. + Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn: theo phương pháp nghiên cứu vi khuẩn trên tôm hùm của Evans (2003) và Whitman (2004) + Phương pháp nghiên cứu nấm: * Nuôi cấy, phân lập theo Rhoobunjongde & cs (1991), Lê Văn Khoa, Hatai & Aoki (2004). * Phân loại nấm theo Nelson và cs(1983) và xác định trình tự đoạn DNA của nấm theo White & cs (1990), O’Donnell (1992). * Xác định một số đặc điểm sinh thái của nấm gây bệnh, kiểm tra tác dụng của các loại hóa chất/thuốc kháng nấm trong điều kiện theo Kitancharoen & Hatai (1995) với các mức thí nghiệm về nhiệt độ: 12 o C, 22 o C, 26 o C, 28 o C, 30 o C, 32 o C, 35 o C, 40 o C; độ mặn: 0 ‰, 5 ‰, 10‰, 15‰, 20‰, 25‰, 30‰, 35‰, 40‰, 45‰, 50‰ và pH: 5, 6, 7, 7.5, 8, 9. Nồng độ và loại hóa chất/thuốc kháng nấm sử dụng tương ứng ở Bảng 2.4. 5 Bảng 2.4: Một số loại hóa chất/thuốc kháng nấm và nồng độ tương ứng dùng làm thí nghiệm Ghi chú : ( * ) - Nồng độ được tính bằng đơn vị UI/mL * Cảm nhiễm nấm trên tôm khỏe: áp dụng theo phương pháp của Rhoobunjongde & cs (1991). + Phương pháp nghiên cứu vi rút: * Kỹ thuật mô bệnh học: áp dụng phương pháp mô bệnh học cho giáp xác của Lightner (1996) * Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction): thực hiện theo tiêu chuẩn ngành thủy sản 28 TCN 202:2004 * Phương pháp kính hiển vi điện tử: thực hiện tại Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương. Gan tụy và mang tôm bệnh và tôm khỏe đã được kiểm tra, đọc qua kính hiển vi điện tử hiệu JEOL 1010, Mỹ. * Phương pháp cảm nhiễm dịch gan tụy tôm bệnh dưới màng lọc 0,2 µ m để xác định vai trò của vi rút trong việc gây bệnh đỏ thân cho tôm hùm: Áp dụng theo phương pháp của Takahashi (1994) (Hình 2.9). Loại hóa chất Nồng độ (ppm) Cách 1 (cho trực tiếp) Cách 2 (ngâm) Formalin 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 H 2 O 2 500, 750, 1000, 1500 Nistatine ( * ) 0; 30; 35; 40; 45; 50 25, 30, 35 Ketoconazol 0, 50, 100, 200, 500, 750, 1000 400, 500, 600 Griseofuvine 0, 25, 50, 100, 500, 1000, 1500 300, 500, 700 6 + Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng: Áp dụng phương pháp Dogiel (1960), được Hà Ký (1968) bổ sung. Tôm hùm bông khỏe (27,5±2,5g/con) được thuần dưỡng 7 ngày TN 2 (tiêm 0,1 mL dịch gan tụ y tôm bệnh trong NaCl 0,85% lọc qua 0,2 µm) ĐC 3 (cho tôm ăn thức ăn không tiêm dịch gan tụ y tôm bệnh đã lọc qua 0,2 µm) TN 3 (tiêm dịch gan tụy tôm bệnh với BPS, lọc qua 0,2 µm vào thứ c ăn cho ăn 7 ngày) ĐC 4 Ngâm tôm trong dung dịch BPS pha loãng ở cùng nồng độ) TN 4 (Ngâm tôm trong dịch lọc qua 0,2 µm pha loãng với BPS trong 30 phút) TN1 (tiêm 0,1 mL dị ch gan tụ y tôm đỏ thân trong BPS lọ c qua 0,2 µm ) ĐC 2 (tiêm 0,1 mL NaCl 0,85%) - Mỗi lô có 10 con - Sục khí 24/24 giờ - Nhiệt độ = 28 o C; S‰=33‰; pH = 8,2 - Theo dõi liên tục hàng ngày - Thí nghi ệm đ ư ợc lặp lại 2 lần ĐC 1 (tiêm 0,1 mL dung dịch BPS) Tiêm trực tiếp vào đốt bụng thứ 2 của tôm kh ỏ e Tiêm dịch lọc gan tụy vào thứ c ăn cho tôm ăn Ngâm tôm trong dịch lọc gan tụy tôm b ệ nh Hình 2.9: Thí nghiệm đánh giá vai trò của vi rút với bệnh đỏ thân trên tôm hùm 7 2.3.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm điều trị bệnh đen mang ở tôm hùm bông trong điều kiện thí nghiệm: Bố trí điều trị bệnh đen mang ở tôm hùm bông được thể hiện qua sơ đồ Hình 2.11 Hình 2.11: Sơ đồ điều trị bệnh đen mang ở tôm hùm bông trong điều kiện thí nghiệm 2.3.5. Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường: nhiệt độ, độ mặn, pH, hàm lượng H 2 S, DO, BOD 5 được xác định theo các phương pháp hiện hành. 2.3.6. Các phương pháp xử lý số liệu: Các thông tin, số liệu của luận án đã được xử lý trên máy vi tính bằng phần mềm SPSS. Nấm gây bệnh Tôm hùm bông khoẻ (khối lượng:145,6±3,2g/con) Tôm hùm bông bị bệnh đen mang Tắm tôm trong hóa chất Trộn thuốc vào thứ c ăn và cho tôm ăn TN1 Hóa chất 1 (HC1) TN2 Hóa chất 2 (HC2) TN3 Thuố c kháng nấ m (KN) ĐC1 Đối chứ ng dương (không điều trị) ĐC2 Đối chứng âm (tôm khoẻ) Đánh giá kết quả của việc sử dụng thuốc trong việc điều trị bệnh đen mang ở tôm hùm bông trong điều kiện thí nghiệm 8 CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả điều tra hiện trạng bệnh tôm hùm bông nuôi lồng tại Khánh Hòa đến năm 2006 3.1.1. Tình hình nuôi tôm hùm bằng lồng ở Khánh Hòa Năm 2006, toàn tỉnh có khoảng 29.206 lồng đạt 1.142 tấn, tăng hơn 3 lần về số lượng lồng và hơn 2 lần sản lượng tôm nuôi so với năm 2000 (Hình 3.1). Hình 3.1: Số lượng lồng và sản lượng tôm hùm nuôi lồng tại các vùng nuôi ở Khánh Hòa qua các năm (nguồn: Báo cáo của Sở Thuỷ sản Khánh Hoà) 3.1.2. Những bệnh thường gặp trên tôm hùm nuôi lồng ở Khánh Hòa Kết quả điều tra cho thấy có 9 loại hội chứng bệnh khác nhau đã xảy ra trong các lồng nuôi tôm hùm ở Khánh Hòa đến năm 2004. Trong đó, dấu hiệu đỏ thân và đen mang có tần suất xuất hiện cao (65,1% và 66,4% tương ứng). 3.1.3. Một số đặc điểm dịch tễ của hội chứng đỏ thân và hội chứng đen mang trên tôm hùm bông nuôi lồng tại Khánh Hòa. 3.1.3.1. Sự xuất hiện của hội chứng bệnh theo các tháng nuôi trong năm (mùa vụ) 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Năm Số lượng lồ ng nu ô i (cái) Vạn Ninh Cam Ranh Nha T rang Ninh Hoà 0 100 200 300 400 500 600 700 800 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Năm Sản lư ợ ng (tấ n) Vạn Ninh Cam Ranh Nha Trang Ninh Hoà 9 Hình 3.3: Phân bố của hội chứng đỏ thân và hội chứng đen mang trên tôm hùm bông theo tháng tại Khánh Hòa năm 2003-2004 (n=229). Từ Hình 3.3 nhận thấy: hội chứng đỏ thân thường xuất hiện nhiều từ tháng 2-7, hội chứng đen mang thường xuất hiện tập trung từ tháng 5-9 hàng năm. Phân tích chỉ số nguy cơ tương đối (RR) và chỉ số chênh (OR) mô tả sự liên quan giữa sự xuất hiện hội chứng bệnh và mùa vụ cho thấy, nguy cơ xuất hiện hội chứng đỏ thân hay đen mang trong mùa khô cao gấp 2,74 hay 1,4 lần (tương ứng) so với mùa mưa (RR đỏ thân =2,74>1; RR đen mang =1,40>1; OR đỏ thân =2,32>1; OR đen mang = 1,59>1). 3.1.3.2. Sự xuất hiện của hội chứng bệnh theo giai đoạn tôm trong một chu kỳ nuôi Bảng 3.3: Phân bố của hội chứng đỏ thân/đen mang trên tôm hùm bông theo nhóm kích cỡ tôm nuôi khác nhau. Có dấu hiệu bệnh Không dấu hiệu bệnh Loại hội ch ứng bệnh Tôm con (n=115) Tôm thương phẩm (n=114) Tôm con (n = 115) Tôm thương phẩm (n=114) T ần số gặp 88 61 27 53 Đỏ thân Tỷ lệ (%) 76,5 53,5 23,5 56,5 T ần sốgặp 48 104 67 10 Đen mang Tỷ lệ (%) 41,7 91,2 48,3 8,8 (n- Số hộ nuôi trả lời có hội chứng bệnh và giai đoạn tôm nuôi) Hội chứng đỏ thân 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Thời gian (tháng) Tần suất gặp (%) Hội chứng đen mang 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Thời gian (tháng) Tần suất gặp (%) 10 Từ kết quả Bảng 3.3, phân tích chỉ số RR và OR cho thấy nguy cơ xuất hiện hội chứng đỏ thân ở tôm con (≤7 tháng nuôi) cao hơn tôm thương phẩm (RR=1,43>1; OR= 2,83>1); còn nguy cơ xuất hiện hội chứng đen mang ở tôm thương phẩm (>7 tháng nuôi) lại cao hơn ở tôm con (RR= 2,18>1; OR= 14,52>1). 3.1.3.3. Ảnh hưởng của kiểu lồng nuôi lên sự xuất hiện hội chứng đỏ thân/đen mang Bảng 3.4: Phân bố của hội chứng đỏ thân/đen mang trên tôm hùm bông theo các kiểu nuôi lồng khác nhau. Có dấu hiệu bệnh Không dấu hiệu bệnh Loại hội ch ứng bệnh Lồng nổi (n=53) Lồng chìm (n=89) Lồng găm (n=87) Lồng nổi (n=53) Lồng chìm (n=89) Lồng găm (n=87) Tần số gặp 27 64 58 26 25 29 Đỏ thân Tỷ lệ (%) 50,9 71,9 66,7 40,1 28,1 33,3 Tần số gặp 25 66 61 28 23 26 Đen mang Tỷ lệ (%) 47,2 74,2 70,1 52,8 25,8 29,9 n- Số hộ nuôi có hội chứng bệnh và loại hình nuôi khác nhau Từ kết quả Bảng 3.4, phân tích chỉ số RR và OR cho thấy, nguy cơ xuất hiện hội chứng đỏ thân/đen mang ở kiểu nuôi bằng lồng nổi thấp hơn không nuôi bằng kiểu lồng nổi (RR đỏ thân = 0,74<1; RR đen mang = 0,65<1; OR đỏ thân = 0,46<1 và OR đen mang = 0,34 <1). 3.1.3.4. Ảnh hưởng của mật độ tôm nuôi lên sự xuất hiện hội chứng đỏ thân/đen mang Từ kết quả Bảng 3.5, phân tích chỉ số RR và OR cho thấy, ở mật độ nuôi nhỏ hơn 5con/m 2 , nguy cơ xuất hiện hội chứng đỏ thân/đen mang thấp hơn nuôi ở mật độ từ 5 con/m 2 trở lên (RR đỏ thân = 0,74<1; RR đen mang =0,62<1; OR đỏ thân = 0,46<1; OR đen mang = 0,32<1). 11 Bảng 3.5: Phân bố của hội chứng đỏ thân/đen mang trên tôm hùm bông theo mật độ nuôi khác nhau (n=224) Có dấu hiệu bệnh Không dấu hiệu bệnh Loại hội ch ứng bệnh Mđ≤ 5 con/ m 2 5<Mđ≤ 9 con/m 2 Mđ>9 con/m 2 Mđ≤5 con/m 2 5<Mđ≤ 9 con/m 2 Mđ>9 con/m 2 T ần số gặp 29 58 62 26 22 27 Đỏ thân Tỷ lệ (%) 19,5 38,9 41,6 34,7 29,3 36,0 T ần số gặp 24 55 65 31 25 24 Đen mang Tỷ lệ (%) 16,7 38,2 45,1 38,8 31,2 30,0 Mđ: Mật độ; n: Số hộ có trả lời mật độ nuôi và hội chứng bệnh 3.1.3.5. Ảnh hưởng giữa việc vệ sinh lồng với sự xuất hiện hội chứng đỏ thân/đen mang Bảng 3.6: Ảnh hưởng của việc vệ sinh lồng bè nuôi đến sự xuất hiện của hội chứng đỏ thân/đen mang Có dấu hiệu bệnh Không dấu hiệu bệnh Lo ại hội chứng bệnh Có v ệ sinh lồng/bè (n=120) Không v ệ sinh lồng/ bè (n=98) Có v ệ sinh lồng/bè (n=120) Không vệ sinh lồng/bè (n=98) Tần số gặp 72 77 48 21 Đỏ thân Tỷ lệ (%) 60,0 78,6 40,0 21,4 Tần số gặp 77 75 43 23 Đen mang Tỷ lệ (%) 64,2 76,5 35,8 23,5 (n- Số hộ nuôi trả lời có hội chứng bệnh và vệ sinh lồng bè) Từ kết quả Bảng 3.6, phân tích chỉ số RR và OR cho thấy, nguy cơ xuất hiện hội chứng đỏ thân/đen mang ở nhóm có vệ sinh lồng bè nuôi thấp hơn nhóm không vệ sinh lồng bè nuôi. (RR đỏ thân = 0,76<1; RR đen mang =0,84<1; OR đỏ thân = 0,41<1; OR đen mang =0,55<1) 12 3.1.4. Những biện pháp phòng, trị bệnh tôm của người nuôi tôm hùm lồng tại Khánh Hòa Qua điều tra cho thấy tỷ lệ số hộ nuôi thực hiện các biện pháp phòng bệnh cho tôm hùm là khá cao (95,2%): dọn thức ăn dư thừa (99,5%), vệ sinh lồng/bè (64,4%). Các biện pháp trị bệnh cho tôm hùm hiếm gặp (3,1%) và sử dụng kháng sinh điều trị bệnh ở tôm sú để trị bệnh tôm hùm nhưng không có hiệu quả tại thời điểm điều tra. 3.2. Kết quả nghiên cứu về bệnh đen mang ở tôm hùm bông 3.2.1. Các dấu hiệu bệnh lý đặc trưng Mang có màu nâu đỏ ở những vùng tổn thương, các tổ chức mô tại đó bị phá hủy. Vị trí tổn thương chuyển thành màu đen và lan rộng khắp cả mang, toàn bộ tơ mang phá hủy. Tôm khó thở và ngoi lên mặt lồng/bè. Ngoài ra, luận án còn chỉ ra một dấu hiệu đen mang do chất thải hữu cơ bám vào mang và gây đen mang. 3.2.2. Các loại tác nhân là sinh vật tìm thấy trên tôm hùm bông bệnh đen mang Kết quả phân tích cho thấy tần suất bắt gặp từng loài vi khuẩn, ký sinh trùng, WSSV là ít đặc trưng và tỷ lệ nhiễm tương đương trên nhóm tôm bệnh và tôm khỏe. Trong khi đó, 100% mẫu (n=97) đều phát hiện có nấm Fusarium sp. trên tôm bệnh nhưng lại không tìm thấy trên tôm khỏe (0,0%). Những quan sát tiêu bản soi tươi phiến mang tôm bệnh và những nghiên cứu về bệnh đen mang do nấm gây ra trên tôm hùm của Lightner & Fontaine (1975), Evans & cs(1994), Đỗ Thị Hòa & cs (2004), cho phép nhận định: rất có thể nấm Fusarium sp. là tác nhân chính gây ra bệnh đen mang ở tôm hùm bông nuôi lồng khu vực Khánh Hòa. 3.2.3. Đặc điểm mô bệnh học ở tôm hùm bông bị bệnh đen mang 13 Kết quả quan sát mô mang với thuốc nhuộm H&E ở 100X, 400X đã phát hiện nấm Fusarium sp. trên tôm bệnh (Hình 3.9) Hình 3.9: Mô học mang tôm hùm bông bệnh đen mang và tôm khỏe nhuộm H&E. 3.2.4. Kết quả cảm nhiễm nấm trên tôm khỏe Kết quả cảm nhiễm nấm cho thấy, tôm hùm bắt đầu chết ở ngày thứ 5 sau khi cảm nhiễm. Tỷ lệ tôm chết sau 14 ngày cảm nhiễm với các mật độ nấm 8x10 3 , 8x10 4 , 8x10 5 BTĐ/mL là khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Kiểm tra tôm tại ngày thứ 3, 7 và 10 và những tôm chết ở các lô thí nghiệm cho thấy có hơn 75% tôm có mang chuyển sang màu nâu đen đặc thù của tôm bệnh đen mang và khi phân lập trở lại đều tìm thấy nấm đã gây nhiễm ban đầu. Trong khi đó, ở lô đối chứng tôm đều không bị chết; mang của tôm không bị đổi màu và không nhiễm nấm. Như vậy, nấm Fusarium sp. là nguyên nhân chính gây nên dấu hiệu đen mang ở tôm hùm bông nuôi lồng. 50 µm C 50 µm D A 50 µm 150µm B 14 3.2.5. Một số đặc điểm hình thái, phân loại chủng nấm có tần số bắt gặp cao trên tôm hùm bông bệnh đen mang 3.2.5.1. Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, cấu tạo của nấm: Các đặc điểm hình thái, cấu tạo của nấm được chỉ ra và so sánh chúng với đặc điểm phân loại nấm của Nelson & cs (1983) cho thấy chủng nấm Fusarium sp. tìm thấy tương tự với loài F. solani. 3.2.5.2. Phân loại dựa vào trình tự gen của nấm: Tiến hành xác định trình tự gen vùng ITS (bao gồm cả 5.8 S rDNA), trình tự đoạn D1/D2 rDNA 28S ba chủng nấm phân lập từ mẫu tôm hùm bông bệnh đen mang ở các đợt khác nhau (F1, F2, F4) cùng với các chủng nấm đã xác định tên (F3- Fusarium incarnatum;F179-F. oxysporum và F180 – F. solani) để so sánh. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.11. Hình 3.11: Cây quan hệ giống loài của các chủng nấm phân lập từ mẫu tôm hùm bông bệnh đen mang và các loài có mối quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự các vùng ITS (bao gồm cả trình tự 5.8 S rDNA) Fusarium sambucinum NRRL13708 (U34579) Fusarium equiseti (AB277550) Fusarium chlamydosporum (AJ853773) F3 Fusarium incarnatum voucher NJM0177(AY633745) Fusarium culmorum (AM262427) Gibberella moniliformis (EF158026) Gibberella zeae (EF158024) Fusarium lateritium (EF560605) 84 53 51 F179_I4_4 Fusarium oxysporum f cubense (EF590328) Fusarium redolens (AB304483) 100 Fusarium polyphialidicum (U34580) 100 100 58 Fusarium solani f.sp.phaseoli NRRL22158(L36630) F180_I Stenocarpella maydis (AY332489) Fusarium ambrosium AF178397 Nectria ipomoeae (AF178398) Chaetomium globosum (AY429049) Thanatephorus cucumeris (DQ339103) F4_I1_1 F1_I1 Fusarium solani (AM412641) F2_I Fusarium oxysporum (AY928412) Nectria haematococca (DQ535186) 51 60 98 94 52 67 100 73 98 58 100 0.02 15 Như vậy, ở mức độ phân tử có thể khẳng định rằng nấm Fusarium phân lập được trên tôm hùm bông bệnh đen mang tại Khánh Hòa là loài F. solani 3.2.6. Một số đặc điểm sinh thái của nấm có tần số bắt gặp cao trên tôm hùm bông bệnh đen mang Kết quả của luận án đã chỉ ra nấm Fusarium solani sinh trưởng mạnh ở nhiệt độ từ 28-35 o C, tốt nhất là 30 o C (p<0,05). Giá trị pH từ 5,0-7,5 và 8,0-9,0; độ mặn từ 25-35‰ và 45-50‰, sinh trưởng của nấm F. solani không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p>0,05). 3.3. Kết quả nghiên cứu về bệnh đỏ thân ở tôm hùm bông 3.3.1. Dấu hiệu bệnh lý đặc trưng + Trạng thái: tôm bệnh không nhanh nhẹn và kém bắt mồi + Màu sắc: mặt bụng của phần lưng xuất hiện màu đỏ nhạt, sau đó toàn bộ thân tôm xuất hiện màu đỏ nhạt đến đỏ bầm. + Biến đổi hình thái bên ngoài: đôi khi gặp tình trạng phù nề của phần cơ giữa giáp đầu ngực và phần bụng. + Mức độ ảnh hưởng: tôm chết rải rác đến hàng loạt, tỷ lệ chết tích lũy lên đến 80% Ngoài ra, năm 2007 còn bắt gặp một dạng tôm hùm bông bị đỏ thân kèm theo dấu hiệu trắng sữa ở bụng nhưng loại tôm với dấu hiệu này không được đưa vào nghiên cứu trong luận án. 3.3.2. Các loại tác nhân gây bệnh là sinh vật tìm thấy trên tôm hùm bông bệnh đỏ thân Có nhiều loài sinh vật ký sinh khác nhau tìm thấy ở trên và ở trong cơ thể tôm hùm bị đỏ thân: các giống ký sinh trùng, vi khuẩn, động vật bám, WSSV và cũng được tìm thấy ở nhóm tôm khỏe với tỷ lệ nhiễm tương đương. Ngoại trừ một vi rút lạ có thể vùi dạng hình cầu hay bầu dục, bắt màu tím của hematoxylin, 16 nằm ngoài nhân các tế bào mô liên kết tổ chức gan tụy tôm (Hình 3.21) chỉ gặp ở nhóm tôm bị bệnh đỏ thân (91,6%), nhưng không gặp ở nhóm tôm khỏe (0,0%); 2 loài vi khuẩn: Vibrio alginotylicus và V. parahaemolyticus đã gặp trên nhóm tôm bị bệnh với tần số 67,5% và 33,1% tương ứng, cao hơn so với nhóm tôm khỏe (4,0%). Vì thế, vi rút tìm thấy (Hình 3.21) và 2 loài vi khuẩn V.alginolyticus, V. parahaemolyticus đã nghi ngờ là tác nhân chính gây bệnh đỏ thân ở tôm hùm bông nuôi lồng. Hình 3.21: Mô bệnh học của tổ chức gan tụy tôm hùm bị bệnh đỏ thân cho thấy các thể vùi (mũi tên) có màu tím của hematoxylin nằm ngoài nhân của các tế bào mô liên kết, nằm xen kẽ giữa các biểu mô gan tụy hình ống 50µm A 10µm 30µm B C 17 3.3.3. Kết quả cảm nhiễm lên tôm khỏe dịch nghiền gan tụy tôm bệnh đỏ thân qua màng lọc 0,2 µm. Ở lô thí nghiệm TN1 và TN2, khi tiêm vào cơ thể tôm khỏe dịch nghiền gan tụy tôm bị bệnh lọc qua màng lọc 0,2µm, đã làm tôm chết với tỷ lệ 80-100% sau 5-7 ngày thí nghiệm và những con tôm hùm chết đều có dấu hiệu đỏ toàn thân. Quan sát tế bào mô liên kết của tổ chức gan tụy và mang những tôm này thấy dạng thể vùi hình cầu hay bầu dục, bắt màu tím của hematoxylin và nằm ngoài nhân, nhưng không tìm thấy nó trong các mô của tôm ở lô tôm khỏe (đối chứng) (Hình 3.22). Hình 3.22: Sự biến đổi mô bệnh học trong mô liên kết của tổ chức gan tụy và mô mang tôm hùm bông bị bệnh đỏ và tôm hùm bông khỏe từ cảm nhiễm nhân tạo. 20µm C 10µm D B 20 µm 30µm A 20µm E 20µm F 18 Như vậy, xác nhận rằng có một loại vi rút tồn tại và nhân lên trong bào tương, nằm bên ngoài nhân tế bào mô liên kết ống gan tụy và tế bào mang tôm bệnh là nguyên nhân gây ra hiện tượng đỏ thân ở tôm hùm bông nuôi lồng. Đồng thời xác nhận hai loài vi khuẩn: Vibrio alginolyticus và V. parahaemolyticus không phải là tác nhân gây bệnh chính mà chỉ là tác nhân góp phần làm tôm hùm bông chết tại các vùng nuôi thuộc tỉnh Khánh Hòa. 3.3.4. Kết quả quan sát mẫu mô gan tụy và mô mang tôm hùm bông bị bệnh đỏ thân và tôm khỏe dưới kính hiển vi điện tử Hình 3.23: Tế bào gan tụy tôm hùm bông bệnh đỏ thân (do cảm nhiễm nhân tạo) và tôm khỏe dưới kính hiển vi điện tử. Nu Nu Cyt A B Nu D C 19 Hình 3.23 cho thấy tế bào mô liên kết ống gan tụy và tế bào mang tôm bị bệnh thể hiện rất rõ sự nhiễm của một vi rút dạng hình bầu dục, có kích thước đường kính khoảng 96-100nm, chiều dài khoảng 288-310nm. Các hạt vi rút quan sát dưới kính hiển vi điện tử có dạng hoàn chỉnh, bao gồm cả phần lõi và vỏ (nucleocapsit) tập trung thành đám trong một bọc lớn (Hình 3.23B), nằm trong sinh chất, bên ngoài nhân của các tế bào mô liên kết gan tụy tôm. Trong khi đó, mẫu tôm khỏe không thể hiện các dấu hiệu này (Hình 3.23A). 3.4. Kết quả thử nghiệm dùng thuốc và hóa chất hạn chế bệnh đen mang ở tôm hùm bông nuôi lồng trong điều kiện thí nghiệm 3.4.1. Kết quả thử nghiệm hiệu quả của một số hóa chất và thuốc kháng nấm trong việc kìm hãm sự phát triển nấm Fusarium solani gây bệnh đen mang ở tôm hùm trong điều kiện in vitro 3.4.1.1. Dùng Formalin với nồng độ, thời gian và phương pháp sử dụng khác nhau: Khi đưa trực tiếp Formalin nồng độ từ 200-350 ppm có thể kìm hãm sự phát triển của nấm Fusarium solani. Còn khi ngâm rìa khuẩn lạc nấm Fusarium solani đang phát triển trong Formalin với thời gian (10, 20 và 30 phút) và nồng độ khác nhau (100, 150, 200, 250, 300, 350 và 400ppm) cho thấy, trong thời gian ngâm 20 phút, nhóm nồng độ Formalin từ 150-400 ppm cho sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa kích thước khuẩn lạc nấm ở các lô dùng Formalin và lô đối chứng (p<0,05). 3.4.1.2. Dùng Hydrogen peroxyde (H 2 O 2 ) với các nồng độ khác nhau: Khi ngâm rìa khuẩn lạc nấm Fusarium solani đang phát triển trong H 2 O 2 ở các thời gian (10, 20 và 30 phút) và nồng độ khác nhau (500, 750, 1000 và 1500ppm) thì với thời gian ngân là 10 phút, ở nồng độ H 2 O 2 từ 500ppm trở lên mới có thể kìm hãm được sự phát triển của nấm sau 120 giờ nuôi cấy (p<0,05). Mặt khác, trong cùng 20 một nồng độ H 2 O 2 sử dụng (500, 750, 1000 hay 1500 ppm), sự phát triển của rìa khuẩn lạc nấm ở các thời gian ngâm khác nhau (20, 30 phút) không cho sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p>0,05). 3.4.1.3. Dùng một số thuốc kháng nấm (Griseofulvine, Ketoconazol, Nistatin) với các nồng độ, thời gian và phương pháp sử dụng khác nhau: Kết quả nghiên cứu cho thấy + Có sự sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (p<0,05) giữa kích thước khuẩn lạc nấm ở các nồng độ khác nhau của Griseofulvine/Ketoconazol/Nistatin (phương pháp đưa thuốc trực tiếp trong môi trường nuôi cấy nấm) và kích thước khuẩn lạc nấm ở các nồng độ khác nhau của Griseofulvine/Ketoconazol (phương pháp ngâm rìa khuẩn lạc nấm). Đây chính là cơ sở để dùng Griseofulvine hay Ketoconazol bằng cách duy trì nồng độ thuốc trong một thời gian để kìm hãm sự phát triển của nấm gây bệnh đen mang ở tôm hùm trong điều kiện thí nghiệm. + Ở cùng nồng độ 500ppm (Griseofulvine, Ketoconazol) và 30UI (Nistatin), sau 120 giờ nuôi cấy, phương pháp đưa thuốc trực tiếp trong môi trường nuôi cấy nấm có tác dụng ức chế sự phát triển của nấm tốt hơn so với phương pháp ngâm rìa khuẩn lạc nấm trong thuốc 20 phút trước khi nuôi cấy, sự sai khác này có ý nghĩa thống kê (p<0,05). 3.4.2. Kết quả thử nghiệm điều trị bệnh đen mang ở tôm hùm bông trong điều kiện thí nghiệm in vivo Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tắm Formaline 300 ppm trong 20 phút, 2 ngày lần, liên tục 3 lần cho kết quả khá tốt trong trị bệnh đen mang ở tôm hùm bông nuôi lồng so với tắm Hydrogen peroxide. [...]... (tháng 2-7) và b nh en mang (tháng 5-9), ngư i nuôi tôm hùm l ng c n có k ho ch phòng b nh cho tôm nuôi b ng các gi i pháp k thu t khô (t tháng 1 n tháng 8) và Ngoài ra, khi tôm hùm bông có d u hi u b thân, c n lo i b tôm b nh ra kh i l ng nuôi và không nên dùng kháng sinh b nh; thông báo v i c ng năng a phương ch a ng ngư i nuôi tôm hùm và cơ quan ch c có bi n pháp phòng tránh k p th i 3.5.2 Bi n pháp. .. tôm hùm bông nuôi l ng nhi m vi rút này, tôm ho t ng không nhanh nh n, kém b t m i; m t b ng c a ph n lưng tôm thư ng xu t hi n màu nh t n b m, sau ó màu r ng ra toàn b cơ th , tôm b ăn hoàn toàn và ch t r i rác lan n hàng lo t 4 Bi n pháp phòng t ng h p b nh tôm hùm bông nuôi l ng t i Khánh Hòa thân và b nh en mang 23 24 + Ngư i nuôi tôm hùm l ng c n có k ho ch phòng b nh cho tôm nuôi b ng các gi i pháp. ..21 3.5 22 K T LU N VÀ KI N NGH xu t bi n pháp phòng tr b nh tôm hùm bông nuôi l ng t i Khánh Hòa 3.5.1 Bi n pháp phòng t ng h p b nh en mang và b nh thân + Nên khuy n khích nuôi tôm hùm bông b ng l ng n i nh m h n ch s xu t hi n b nh + Nuôi tôm hùm bông thương ph m h n ch ư c s Ngoài ra, m t theo Quy t xu t hi n c a b nh nuôi m t ≤5con/m2 l ng s thân và b nh en mang t ng kích c tôm cũng c n ư c th... thu t vào mùa thư ng x y ra b nh thân (tháng 2-7) và b nh en mang (tháng 5-9) + Nên khuy n khích ngư i dân nuôi tôm hùm b ng ki u l ng n i + C n v sinh l ng/bè nuôi thư ng xuyên trong su t quá trình nuôi + Trong quá trình nuôi c n th c hi n vi c nuôi tôm hùm úng qui trình k thu t ã ư c B NN&PTNT ban hành, t im t c bi t chú ý tôm hùm nuôi 5 Bi n pháp tr b nh en mang tôm hùm bông nuôi l ng t i Khánh Hòa: ... i nh ng vùng t n thương và lan r ng kh p c mang, toàn b tơ mang b phá h y, gây ch t tôm nuôi r i rác ây là th i kỳ mùa u mùa mưa c a t nh Khánh Hòa tôm hùm bông nuôi l ng t i Khánh Hòa năm 2003-2005 là do n m Fusarium solani Khi lưu thông, thông thoáng c a nư c trong l ng nuôi v i môi trư ng ó tránh ư c s xu t hi n c a b nh nuôi và vi c v sinh l ng/bè nuôi + Ngư i nuôi tôm c n v sinh l ng/bè nuôi thư... NN&PTNT K T LU N 1 Tôm hùm bông nuôi l ng vùng bi n Khánh Hòa có các d u hi u b nh lý a d ng, trong ó b nh có t n su t xu t hi n cao, gây h i cho tôm hùm nuôi và s bùng phát c a b nh có liên quan mb os n m t s y u t nguy cơ như: mùa v nuôi, giai o n tôm trong m t chu kỳ nuôi, ki u l ng nuôi, m t 2 Tác nhân chính gây b nh en mang tôm hùm bông nhi m n m Fusarium solani bi n, t có màu nâu + Vào mùa thư ng... nh en mang tôm hùm bông nuôi l ng Khi tôm b nh en mang do n m Fusarium solani v i nh ng d u hi u b nh lý như mang có màu nâu nh ng vùng t n thương, các t ch c mô t i v trí này b phá h y, t i v trí t n thương chuy n thành màu en thì có th dùng Formaline 300 ppm t m tôm trong 20 phút, 2 ngày t m 1 l n, t m liên t c 3 l n tôm hùm bông nuôi l ng t i Khánh Hòa i u tr b nh en mang m c cao, mang tôm , sau... Dùng Formalin v i n ng 300ppm t m tôm trong 20 phút, 2 ngày/l n, 3 l n liên t c h n ch b nh en mang tôm hùm bông nuôi l ng KI N NGH 1 C n v n d ng các d u hi u b nh lý phòng t ng h p b nh thân, b nh en mang c trưng và bi n pháp nh n bi t s m ư c b nh và có các gi i pháp x lý k p th i, tránh lây lan m m b nh trong khu v c 2 C n ti p t c nghiên c u con ư ng xâm nh p và s lan truy n c a vi rút tìm th... a vi rút tìm th y trong t bào mô liên k t ng gan t y tôm hùm bông b nh thân t ó xu t bi n pháp nh m h n ch s lây lan c a m m b nh gi a các l ng nuôi cũng như gi a các khu v c nuôi v i nhau 3 C n ti p t c nghiên c u gi i trình t o n o n gen vi rút tìm th y trong t bào mô liên k t ng gan t y tôm hùm bông b nh thân t ó nh lo i và s n xu t kít ch n oán vi rút này b ng k thu t sinh h c phân t ... t và kìm hãm s phát tri n c a sinh v t gây b nh; thân và b nh en mang 3 Tác nhân chính gây b nh thân tôm hùm bông nuôi l ng t i Khánh Hòa năm 2003-2005 là do m t lo i vi rút có v b c, ư c nhân lên trong nguyên sinh ch t c a t bào ký ch , kích thư c vi th vi rút t 96-100nm x 288-310nm và có th vùi hình c u hay b u d c t n t i trong nguyên sinh ch t c a t bào mô liên k t gan t y và mô mang tôm Khi tôm . Nghiên cứu một số bệnh thường gặp ở tôm hùm bông (Panulirus ornatus Fabricius, 1798) nuôi lồng tại vùng biển Khánh Hoà và các biện pháp phòng trị đã được thực hiện. 2. Mục tiêu của luận án Xác. mang ở tôm hùm bông nuôi lồng tại Khánh Hòa. 22 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Tôm hùm bông nuôi lồng vùng biển Khánh Hòa có các dấu hiệu bệnh lý đa dạng, trong đó bệnh đỏ thân và bệnh. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, phạm vi và địa điểm nghiên cứu: Một số bệnh thường gặp ở tôm hùm bông nuôi thương phẩm tại Khánh Hòa. 2.2. Vật liệu nghiên cứu: tôm hùm bông (Panulirus ornatus)