Đang tải... (xem toàn văn)
Hiện nay , các loại chế phẩm sinh học từ vi sinh vật đã và đang được phổ biến
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN DUY KHÁNH KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN DUY KHÁNH KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY EXAMINE CULTURE CONDITION AND SPORULATION OF Bacillus subtilis GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr.NGUYEN NGOC HAI NGUYEN DUY KHANH TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM ƠN Với tất cả lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường. Em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hướng dẫn dạy dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cám ơn TS. Lê Anh Phụng, BSTY. Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn Phòng vi sinh, Khoa Chăn nuôi – Thú Y đã cho phép và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại phòng. Tôi xin cảm ơn các bạn lớp CNSH 28 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Sinh viên thực hiện Nguyễn Duy Khánh ii TÓM TẮT NGUYỄN DUY KHÁNH, ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis”. Hội đồng hướng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Việt nam là một nước nông nghiệp có nghành chăn nuôi rất phát triển và có đóng góp rất lớn vào sự phát triển kinh tế của đất nước. Vì vậy, vấn đề nâng cao năng suất, chất lượng sản phẩm và cải thiện môi trường chăn nuôi rất được quan tâm ở nước ta hiện nay. Xuất phát từ vấn đề này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtils, tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp và xử lí bào tử để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm cung cấp những thông tin để chọn lựa những điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, từ đó sản xuất chế phẩm sinh học cung cấp cho nghành chăn nuôi. Qua quá trình thực hiện đề tài chúng tôi đã có những ghi nhận sau: Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ) thì chế độ nuôi cấy lắc cho số lượng vi khuẩn cao hơn. Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường khác nhau (TSB, TSB + 1% glucose, TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men) thì môi trường TSB cho số lượng vi khuẩn thấp nhất, 3 môi trường còn lại là những môi trường phù hợp cho Bacillus subtilis phát triển. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường (pH 7 và 7,5), thời gian (24,36 và 48 giờ) và nhiệt độ nuôi cấy (nhiệt độ phòng, 37 o C) thì ở pH 7, thời gian 48 giờ và nhiệt độ nuôi cấy 37 o C cho số lượng vi khuẩn lớn nhất. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (50, 70), pH (6, 9) và thời gian xử lí (3, 5 và 7 giờ) đến sự hình thành bào tử thì khi xử lí ở các nhiệt độ và pH này có sự ảnh hưởng đến quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis. iii MỤC LỤC Trang tựa Lời cảm tạ . i Tóm tắt . ii Mục lục . iii Danh sách chữ viết tắt iv Danh sách các hình v Danh sách các bảng vi Phần 1. MỞ ĐẦU . 1 1.1. Đặt vấn đề . 1 1.2. Mục đích – Yêu cầu . 1 Phần 2. TỔNG QUAN . 2 2.1. Đại cương về vi khuẩn Bacilus subtilis . 2 2.1.1. Lịch sử phát triển 2 2.1.2. Đặc điểm phân loại . 2 2.1.3. Đặc điểm phân bố . 2 2.1.4. Đặc điểm hình thái 2 2.1.5. Đặc điểm nuôi cấy . 3 2.1.6. Đặc điểm sinh hoá . 3 2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên . 4 2.1.8. Tính chất đối kháng của B. subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh . 4 2.2. Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis . 5 2.2.1. Khả năng sinh bào tử 6 2.2.2. Cấu tạo của bào tử 7 2.2.3. Thành phần hoá học của bào tử 8 2.2.4. Sự nảy mầm của bào tử 9 2.2.5. Sức đề kháng của bào tử 9 2.3. Hệ vi sinh vật đường ruột và sự loạn khuẩn . 10 2.3.1. Hệ vi sinh vật đường ruột . 10 2.3.2. Vai trò của hệ vi sinh vật đường ruột 11 iv 2.3.3. Sự loạn khuẩn . 12 2.4. Giới thiệu chung về probiotic . 13 2.4.1. Định nghĩa 13 2.4.2. Chức năng sinh học của probiotic 13 2.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn Bacillus subtilis 14 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 16 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 16 3.2. Vật liệu thí nghiệm 16 3.2.1. Giống vi khuẩn . 16 3.2.2. Môi trường nuôi cấy . 16 3.2.3. Hoá chất 16 3.2.4. Thiết bị và dụng cụ 16 3.3. Nội dung nghiên cứu . 17 3.4. Phương pháp thực hiện đề tài . 17 3.4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 17 3.4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis 17 3.4.2.1. Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) và thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn . 17 3.4.2.2. Khảo sát môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển tạo sinh khối 18 3.4.2.3. Khảo sát pH môi trường thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn Bacilus subtilis 19 3.4.3. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis . 20 3.4.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 20 3.4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis . 21 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 22 4.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus sutilis 22 v 4.1.2. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis . 22 4.1.3. Quan sát dăc điểm nuôi cấy Bacillus subtilis trên môi trường canh23 4.1.4. Tính chất sinh hoá . 23 4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtíils . 25 4.2.1. Khảo sát chế độ (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) và thời gian nuôi cấy thích hợp . 25 4.2.2. Khảo sát môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp 27 4.2.3. Khảo sát pH môi trường nuôi cấy vi khuẩn thích hợp 29 4.2.4. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis . 30 4.2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của Bacillus subtilis . 30 4.2.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 32 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 34 5.1. Kết luận 34 5.2. Đề nghị 34 Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 Phần 7. PHỤ LỤC 38 vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis 3 Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử . 6 Hình 2.3. Cấu tạo bào tử Bacillus sutilis . 7 Hình 4.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần . 22 Hình 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis trên môi trường TSA . 23 Hình 4.3. Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trường thạch tinh bột . 23 Hình 4.4. Phản ứng lên men một số loại đường của vi khuẩn Bacillus subtilis 25 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hoá của Bacillus subtilis . 4 Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào sinh dưỡng của Bacillus subtilis 8 Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm 1 18 Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm 2 19 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm 3 20 Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm 4 21 Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm 5 21 Bảng 4.1. Ảnh hưởng của thời gian và chế độ nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis . 25 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis . 27 Bảng 43. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis 29 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 30 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis . 32 [...]... trường và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ Sau đó quan sát và xem sự thay đổi của môi trường nuôi cấy 3.4.2 Các thí nghiệm về Bacillus subtilis 3.4.2.1 Ảnh hƣởng của chế độ nuôi cấy (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) và thời gian nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Nguyên tắc Khi nuôi cấy vi sinh vật trong cùng một loại môi trường nhưng khác nhau về thời gian và chế độ nuôi cấy (Nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc)... trường nuôi cấy thích hợp Cách làm Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 -5 ml môi trường TSB, ủ ở 37oC trong 24 giờ Sau đó, chuyển vi khuẩn từ ống nghiệm vào môi trường được chọn từ thí nghiệm 2 ở các pH khác nhau với tỉ lệ 2% và nuôi cấy ở chế độ nuôi cấy (1) Sau 48 giờ đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Từ thí nghiệm chúng tôi chọn ra pH môi trường nuôi cấy vi khuẩn. .. triển tạo sinh khối Nguyên tắc Khi nuôi cấy vi khuẩn trong các loại môi trường khác nhau ở điều kiện nuôi cấy giống nhau (pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy) thì số lượng vi khuẩn sẽ khác nhau Mục đích Xác định môi trường nuôi cấy nào là thích hợp Cách làm Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml môi trường TSB, ủ ở 37oC trong 24 giờ 19 Sau đó, chuyển vi khuẩn từ ống nghiệm vào 4 loại... Bacillus subtilis: hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn, tính chất nuôi cấy trên một số môi trường, thử đặc tính sinh hoá So sánh phương pháp đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đỗ đĩa và phương pháp đếm trên kính hiển vi Ảnh hưởng của hình thức và thời gian nuôi cấy đến số lượng tế bào vi khuẩn Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy đến số lượng tế bào vi khuẩn 3.4 Phƣơng pháp thực... 2%, nuôi cấy trong 2 chế độ khác nhau: nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc (lắc 15 phút, nghỉ 45 phút) ở điều kiện 37oC Kiểm tra số lượng vi khuẩn sau thời gian 24, 36, 48 giờ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Từ khảo sát trên chúng tôi chọn được chế độ nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtiis thích hợp để tiếp tục khảo sát thi nghiệm tiếp theo 3.4.2.2 Khảo sát môi trƣờng và thời gian nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn. .. sinh khối khác nhau Mục đích Xác định số lượng vi khuẩn ở thời gian và chế độ nuôi cấy nào là phù hợp 18 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm 1 Môi trường Thời gian Nuôi cấy tĩnh Nuôi cấy lắc 24h 36h 48h Cách làm Cấy vi khuẩn Bacillus subtilis từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 - 5 ml môi trường TSB đã được hấp tiệt trùng (121oC/15 phút), đem đi ủ ở 37oC trong 24 giờ Sau đó, cấy vi khuẩn từ ống nghiệm vào... bào tử (prospore) Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp màng Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng phân giải và bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử hút nước và bị trương ra Sau đó vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới Mỗi tế bào sinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương,... thường, ức chế vi sinh vật có hại cho vật nuôi Ngoài ra, chế phẩm sinh học còn cải thiện lượng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hoá, cung cấp chất dinh dưỡng… Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis” 1.2 Mục đích – Yêu cầu Mục đích Tìm hiểu điều kiện: nhiệt... chất của bào tử đối với tế bào bên ngoài 10 Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng làm cho các chất hoá học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử 2.3 Hệ vi sinh vật đƣờng ruột và sự loạn khuẩn 2.3.1.Hệ vi sinh vật đƣờng ruột Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1987), ở ruột và dạ dày động vật khi mới sinh ra hoàn toàn không có vi khuẩn, sau vài giờ từ khi chúng sinh. .. hiện của một vài vi khuẩn và từ đó chúng bắt đầu sinh sản dần Sau đó một vài vi khuẩn khác sẽ theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hoá, sống và sinh sôi nảy nở ở đó, chúng sẽ biến đổi ít nhiều nhưng cơ bản chúng vẫn tồn tại cho đến khi con vật chết Thành phần, số lượng của vi sinh vật đường tiêu hoá phụ thuộc vào tuổi tác của gia súc, cách nuôi dưỡng, chăm sóc…ngoài ra còn có các điều kiện vật lí, . hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp và xử lí bào tử để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm cung cấp những thông tin để chọn lựa những điều kiện nuôi cấy vi khuẩn. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo vi n hƣớng