Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa asparaginase của aspergillus oryzae trong nấm men pichia pastoris

69 681 1
Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa asparaginase của aspergillus oryzae trong nấm men pichia pastoris

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. ACRYLAMIDE TRONG THỰC PHẨM 3 1.1.1. Khả năng gây bệnh của acrylamide 3 1.1.2. Cơ chế tạo acrylamide trong sản xuất bánh nƣớng 4 1.1.3. Hàm lƣợng acrylamide trong một số thực phẩm 5 1.2. ASPARAGINASE 5 1.2.1. Asparaginase 5 1.2.2. Ứng dụng asparaginase để làm giảm acrylamide trong thực phẩm 6 1.2.3. Công nghệ sản xuất asparaginase 8 1.2.3.1. Sản xuất asparaginase từ chủng E. coli tái tổ hợp 8 1.2.3.2. Sản xuất asparaginase từ các chủng đã đƣợc chứng nhận an toàn (chủng GRAS) tái tổ hợp 10 1.3. HỆ BIỂU HIỆN TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS 12 1.3.1. Những đặc điểm chung của hệ biểu hiện trong nấm men 12 1.3.2. Những ƣu điểm của hệ biểu hiện nấm men 13 1.3.3. Hệ biểu hiện P. pastoris 14 1.3.3.1. Promoter AOX1 14 1.3.3.2. Chủng biểu hiện 15 1.3.3.3. Vector biểu hiện gen 17 1.3.3.4. Tích hợp gen ngoại lai vào hệ gen P. pastoris 18 1.3.4. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastoris 19 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. VẬT LIỆU 21 2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid 21 2.1.2. Hóa chất, enzyme, máy móc và thiết bị 21 2.1.3. Dung dịch và môi trƣờng sử dụng 22 2.1.3.1. Môi trƣờng và dung dịch sử dụng để biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli DH10b 22 2.1.3.2. Dung dịch đƣợc sử dụng để tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli 22 2.1.3.3. Dung dịch đƣợc sử dụng trong điện di DNA trên gel agarose 23 2.1.3.4. Môi trƣờng biến nạp và biểu hiện gen ngoại lai trong tế bào nấm men P. pastoris 23 2.1.3.5. Dung dịch sử dụng trong điện đi SDS-PAGE 23 2.1.3.6. Dung dịch sử dụng trong nhuộm bạc 24 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1. Nghiên cứu phân tích và cải biến trình tự gen bằng các công cụ tin sinh 24 2.2.2. Phƣơng pháp PCR 25 2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 26 2.2.4. Quy trình biến nạp sốc nhiệt 27 2.2.5. Quy trình tách DNA plasmid 28 2.2.6. Kiểm tra DNA thu đƣợc bằng enzyme hạn chế 29 2.2.7. Tinh sạch DNA plasmid để gửi đi giải trình tự bằng cột Qiagen 29 2.2.8. Phản ứng nối ghép gen 30 2.2.9. Biến nạp DNA vào tế bào nấm men bằng phƣơng pháp xung điện 30 2.2.10. Lên men chủng P. Pastoris 31 2.2.11. Điện di SDS – PAGE 31 2.2.12. Thử hoạt tính asparaginase bằng phƣơng pháp điện di không biến tính và thử hoạt tính bằng đặt gel trên đĩa thạch 32 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1. CẢI BIẾN TRÌNH TỰ GEN ASPARAGINASE CỦA A. ORYZAE 3.1.1. Lựa chọn vùng gen thích hợp để biểu hiện asparaginase tái tổ hợp 36 3.1.2. Cải biến sơ bộ gen asparaginse 37 3.1.3. Đánh giá các chỉ số phù hợp mã bộ ba của gen asp1 đối với chủng biểu hiện . 41 3.1.4. Thiết kế vùng gen để biểu hiện asp1 trong P. pastoris 42 3.2. NHÂN DÒNG GEN ASP1 43 3.2.1. Kiểm tra các dòng plasmid tái tổ hợp bằng các enzyme hạn chế 44 3.2.2 Giải trình tự gen asp1 45 3.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN pPIC-ASP1 45 3.3.1 Ghép nối gen asp1 vào vector biểu hiện pPIC9 45 3.3.2. Kiểm tra gen asp1 trong plasmid tái tổ hợp pPIC-asp1 bằng PCR 47 3.3.3. Tách lƣợng lớn vector biểu hiện tái tổ hợp mang gen asp1 48 3.4. TẠO CHỦNG NẤM MEN P. PASTORIS MANG ASP1 49 3.5. BIỂU HIỆN PROTEIN ASP1 TRONG NẤM MEN P. PASTORIS SMD1168 TRONG BÌNH TAM GIÁC 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ Hình 1. Sơ đồ minh họa sự hình thành acrylamide trong chế biến thực phẩm 5 Hình 2. Sơ đồ minh họa cơ chế phản ứng của L-asparaginase 7 Hình 3. Bản đồ vector biểu hiện pPIC9 ngoại lai trong nấm men P. pastoris. 18 Hình 4. Sự tích hợp vector biểu hiện vào hệ gen P. pastoris tại locus his4 19 Hình 5. Sơ đồ tóm tắt quá trình thiết kế vector biểu hiện để biểu hiện gen asp1 trong tế bào nấm men P. pastoris SMD1168 35 Hình 6. Đồ thị dự đoán sự có mặt, vị trí và điểm cắt tín hiệu tiết có trong asparaginase của A. oryzae. 36 Hình 7. Trình tự đoạn gen asp đƣợc sử dụng để cải biến và biểu hiện trong nấm men P. pastoris. 37 Hình 8. Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp định biểu hiện trong P. pastoris (A). Biểu đồ mức độ phù hợp của các bộ mã trên asp so với bộ mã trong chủng biểu hiện P. pastoris (B). 38 Hình 9. Đồ thị so sánh tần suất sử dụng của các codon trong hai chủng A. oryzae (đỏ) và P. pastoris (đen) 39 Hình 10. So sánh trình tự protein đƣợc dịch mã từ gen asp và asp1 40 Hình 11. So sánh trình tự gen asp1 đã đƣợc cải biến và trình tự gen asp chƣa cải biến 41 Hình 12. Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp1 định biểu hiện trong P. pastoris (A). Biểu đồ phần trăm phù hợp của các bộ mã của gen asp1 khi đƣợc biểu hiện trong chủng biểu hiện P. pastoris (B) 41 Hình 13. Trình tự gen asp1 cần đặt có chứa thêm trình tự mã hóa cho vị trí cắt của tín hiệu tiết trong nấm men (trình tự đƣợc gạch chân), vị trí cắt của enzyme giới hạn XhoI, NotI (đƣợc tô đậm). 42 Hình 14. Phân tích các dòng plasmid pUC-asp1 trên gel điện di agarose 1%. 44 Hình 15. Phân tích sản phẩm cắt plasmid pUC-asp1 bằng cặp enzyme XhoI và NotI trên gel agarose 1%. 45 Hình 16. Sơ đồ vector pPIC9 (trái) và ảnh điện (phải) kết quả cắt pPIC9 bằng NotI (đƣờng chạy 1) và XhoI ( đƣờng chạy 2) 46 Hinh 17. Phân tích gen asp1, pPIC9 sau khi đã đƣợc cắt bằng cặp enzyme NcoI+XhoI và đƣợc tinh chế trên gel agarose 1%. 47 Hình 18. Ảnh điện di kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen asp1 trong vector pPIC9 bằng cặp mồi AOX1 48 Hình 19. Phân tích plasmid pPIC-asp1 và sản phẩm cắt kiểm tra pPIC-asp1 bằng NotI và XhoI trên gel điện di agarose 1%. 49 Hình 20. Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra pPUC-asp1 bằng StuI 50 Hình 21. Sản phẩm biến nạp pPIC-asp1 vào nấm men P. pastoris. 50 Hình 22. Phân tích sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc chủng tái tổ hợp P. pastoris SMD1168 mang gen asp1 với cặp mồi AOX1. 51 Hình 23. Đƣờng cong sinh trƣởng của 4 chủng P. pastoris tái tổ hợp theo thời gian 53 Hình 24. Phân tích protein ngoại bào từ dịch nuôi cấy chủng nấm men tái tổ hợp ở các thời điểm khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6% 54 Hình 25. A: Gel không biến tính nhuộm Commassie; B: Xác định hoạt tính ASP trên gel bằng thẩm thấu gel điện di không biến tính xuống đĩa thạch có 1% asparagine. 55 Bảng 1. Một số chủng P. pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp. 16 Bảng 2. Khả năng sinh trƣởng của các dòng nấm men tái tổ hợp đƣợc giám sát thông qua OD 600 theo thời gian lên men 52 BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN AOX APS ARN ASP Amp BMGY BMMY bp dNTP EDTA ETBr E. coli GRAS kb kDa LB MCS MD mARN P. pastoris PCR SDS TAE TE Axit deoxyribonucleic Alcohol oxidase Ammonium persulfate Axit ribonucleic Asparaginase Ampicillin Buffered Minimal Glycerol Yeast Buffered Minimal Methanol Yeast Base pair 2’- deoxyribonucleotide 5’ – triphosphate Ethylene diamine tetra acetic acid Ethidium bromide Escherichia coli Generally Recognized as Safe Kilobase Kilo Dalton Luria-Bertani Multiple cloning site ( vị trí đa nối) Minimal Dextrose Messenger RNA (ARN thông tin) Pichia pastoris Polymerase Chain Reaction ( phản ứng chuỗi trùng hợp) Sodium dodecyl sunfat Tris-acetate-EDTA Tris-EDTA 1 MỞ ĐẦU Hiện nay tỷ lệ ngƣời mắc bệnh ung thƣ ngày càng tăng. Một trong các yếu tố dẫn đến bệnh ung thƣ là do chế độ ăn uống. Những thực phẩm chứa nhiều mỡ, ƣớp muối, hun khói đƣợc coi là những thực phẩm có thể dẫn đến căn bệnh chết ngƣời này. Tuy vậy, rất ít ngƣời dân nhận thức đƣợc rằng các thực phẩm tƣởng chừng vô hại nhƣ các loại bánh nƣớng lại chứa acrylamide, một chất có khả năng gây ung thƣ. Năm 2002 các nhà khoa học Thụy Điển đã tìm ra chất này trong các sản phẩm thực phẩm nhƣ khoai tây chiên, bánh mỳ, bánh quy, ngũ cốc [10]. Acrylamide hình thành khi các thực phẩm giàu tinh bột đƣợc chiên rán ở nhiệt độ trên 120 o C. Nguyên nhân là do ở nhiệt độ cao, asparagine trong bột làm bánh phản ứng với đƣờng khử tạo thành hợp chất có màu vàng nâu chứa acrylamide [29]. Các nhà khoa học trên thế giới đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học của việc sử dụng asparaginase để làm giảm lƣợng acrylamide trong thực phẩm giàu tinh bột nhờ việc loại bỏ asparagine. Enzyme asparaginase sẽ xúc tác thủy phân asparagine thành axit aspartic và ammonia, không cho asparagine tham gia phản ứng Maillard để hình thành acrylamide [8]. Trên thế giới hiện nay hãng Novozymes A/S Denmark đã sản xuất và thƣơng mại hóa thành công asparaginase tái tổ hợp từ chủng nấm sợi A. oryzae ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm với tên thƣơng mại là Acrylaway®L (2007) [24]. Trong dƣợc phẩm asparaginase đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ máu với tên thƣơng mại Elspar [11]. Hiện nay giá thành asparaginase trên thị trƣờng rất cao nên việc ứng dụng enzyme để làm giảm acrylamide trong quá trình chế biến các thực phẩm chiên nƣớng ở Việt Nam còn rất hạn chế. Với mong muốn tạo ra chủng sản xuất asparaginase tái tổ hợp giống với asparaginase thƣơng mại để sử dụng ở trong nƣớc, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa asparaginase của Aspergillus oryzae trong nấm men Pichia pastoris”. Nấm men P. pastoris là hệ thống biểu hiện protein ngoại lai đƣợc các nhà khoa học sử dụng rộng rãi bởi những đặc tính ƣu việt đó là chủng an toàn sinh học, 2 là chủng eukaryote đơn giản, có thể thực hiện biến đổi sau dịch mã tốt, có khả năng sinh trƣởng mạnh tạo lƣợng sinh khối lớn trong quá trình lên men, thao tác dễ dàng [3,49]. Ngoài ra, hệ thống P. pastoris có thể sản xuất lƣợng lớn protein mục tiêu với nguồn nguyên liệu methanol rẻ tiền và ít bị tạp nhiễm. Chính vì những ƣu điểm này mà P. pastoris đƣợc xem là hệ biểu hiện thích hợp nhất đƣợc lựa chọn để biểu hiện gen mã hóa asparaginase từ nấm sợi A. oryzae. Hiện nay, có rất nhiều công trình trên thế giới biểu hiện asparaginase từ các nguồn khác nhau để phục vụ chủ yếu cho mục đích chữa bệnh và làm chất phụ gia. Các gen có nguồn gốc từ vi khuẩn thƣờng đƣợc biểu hiện trong E. coli và Bacillus [27, 50, 51, 52] còn các gen có nguồn gốc từ nấm thƣờng đƣợc biểu hiện ở các chủng nấm tƣơng ứng [36, 53, 54, 55]. Ngoài ra có hai công trình nghiên cứu biểu hiện asparaginase I và III của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong nấm men P. pastoris [53]. Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng chủng nấm men P. pastoris để biểu hiện asparaginase của A. oryzae. Toàn bộ công việc nghiên cứu đƣợc tiến hành tại phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ACRYLAMIDE TRONG THỰC PHẨM 1.1.1. Khả năng gây bệnh của acrylamide Các nhà khoa học trên thế giới đã từng cảnh báo ngƣời tiêu dùng về nguy cơ ung thƣ do ăn khoai tây chiên. Trên thực tế, nhiều loại thực phẩm tƣởng nhƣ vô hại khác nhƣ cà phê, bánh mì, bánh quy cũng có thể dẫn đến ung thƣ. Nguyên nhân chính là do các thực phẩm trên có acrylamide. Ngay sau khi ăn, acrylamide trong thực phẩm sẽ nhanh chóng chuyển đi khắp cơ quan trong cơ thể thông qua hệ tuần hoàn. Nó đƣợc phát hiện trên gan, tim, não, thận, tuyến ức và thậm chí là cả trong sữa mẹ. Acrylamide chuyển hoá thành glycidamide ở trong gan thông qua cytochrome P540. Khi nồng độ của acrylamide và glycidamide tăng cao, chúng có thể tƣơng tác với các đại phân tử nhƣ DNA, hemoglobin và các enzyme gây đột biến DNA hoặc làm ảnh hƣởng tới chức năng sinh học của hệ enzyme trong cơ thể [16]. Những nghiên cứu trƣớc đây đã chứng minh acrylamide có ảnh hƣởng xấu đến sức khoẻ con ngƣời nhƣ gây ung thƣ và ảnh hƣởng đến hệ thần kinh [38]. Thông thƣờng chỉ ở nồng độ cao nó mới ảnh hƣởng đến hệ thần kinh (liều không độc ≤ 0,5 mg/kg trọng lƣợng cơ thể/ngày), tuy nhiên nồng độ này thƣờng khó đạt đƣợc thông qua ăn uống. Ngƣợc lại, khả năng gây ung thƣ và đột biến gen của acrylamide và glycidamide đã đƣợc công bố ở nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng nhƣ trên động vật. Nghiên cứu trong nuôi cấy tế bào cho thấy acrylamide và glycidamide có thể làm gãy nhiễm sắc thể và gây đột biến điểm dẫn đến sự khác thƣờng trên nhiễm sắc thể nên phá vỡ quá trình nguyên phân, tạo thể bội không chỉnh. Những nghiên cứu trên tế bào chuột và ngƣời đƣợc xử lý bằng acrylamide cho thấy, acrylamide làm tăng tỉ lệ đột biến, đặc biệt là đột biến thay thế các nucleobase nhƣ adenine bằng guanine và guanine bằng cytosine. Đối với thí nghiệm trên chuột, acrylamide thúc đẩy quá trình hình thành khối u trên não, phổi, tinh hoàn và tuyến vú. Khi chuột đƣợc xử lý với liều 2 mg acrylamide trên 1 kg trọng lƣợng cơ thể sẽ làm tăng 4 đáng kể u não, tuyến ức, tử cung và những tế bào khác. Mặc dù vậy, acrylamide đƣợc sử dụng với liều cao trong các nghiên cứu trên động vật có thể không phản ánh trung thực những ảnh hƣởng, tác động của acrylamide hấp thu đƣợc trong thức ăn. Do đó rất nhiều nghiên cứu về dịch tễ học đã đƣợc thực hiện để đánh giá nguy cơ gây ung thƣ của acrylamide cho con ngƣời. Mucci và cộng sự (2003) đã chứng minh rằng acrylamide hầu nhƣ không liên quan tới ung thƣ bóng đái, ruột, thận, thanh quản, thực quản, vú và buồng trứng [32]. Tuy nhiên, Tô ̉ chức Y tế thế giới (WHO), Tô ̉ chức Nông lƣơng liên hiệp quốc (FAO), Tổ chức Hóa học Châu Âu và Tổ chức Nghiên cứu ung thƣ thế giới (IARC) đều coi acrylamide là chất có khả năng gây ung thƣ cho ngƣời, thuộc nhóm 2A [24]. Vì vậy, nồng độ của acrylamide trong thực phẩm phải đƣợc kiểm soát ở mức độ cho phép. Vì lý do đó, con đƣờng hình thành acrylamide cần phải đƣợc xác định để kiểm soát lƣợng acrylamide hấp thu vào cơ thể. Tổ chức Bảo vệ môi trƣờng Mỹ (EPA) và WHO đã đƣa ra hàm lƣợng acrylamide tối đa trong đồ uống là 0,5 ppb hoặc 0,05 µg/lít. Hiện nay, số liệu về lƣợng acrylamide vào cơ thể từ thức ăn và liều gây chết còn hạn chế [9]. 1.1.2. Cơ chế tạo acrylamide trong sản xuất bánh nƣớng Bột mỳ là nguyên liệu chính giàu carbohydrate đƣợc sử dụng trong quá trình sản xuất các loại bánh nƣớng nhƣ bánh mỳ, bánh bích quy Bột mỳ đƣợc trộn với nguyên phụ liệu, nhào bột, ép nặn tạo hình, ủ, nƣớng, làm nguội, phân loại và bao gói. Quá trình nƣớng trải qua ba giai đoạn với nhiệt độ nƣớng là 160 o C, 190 o C và trên 225 o C từ 10 đến 20 phút tùy theo yêu cầu về màu sắc và độ giòn [24]. Tuy nhiên, nghiên cứu của các nhà khoa học Na Uy , Thụy Sĩ, Anh và Mỹ đã cho thấy các loại thực phâ ̉ m có nguồn gốc thực vâ ̣ t giàu carbohydrate khi đƣợc chế biến bằng các phƣơng pháp đòi hỏi nhiê ̣ t đô ̣ cao (>120 o C) đều sản sinh acrylamide [16, 30, 41]. Nguyên nhân là trong sản xuất bánh nƣớng, sự tạo thành màu vàng sau khi nƣớng là do các axit amin phản ứng với đƣờng glucose (phản ứng Maillard) tạo thành hợp chất có màu vàng nâu. Tuy nhiên, chỉ có asparagine là tiền chất chủ yếu tạo thành acrylamide. Những loại đƣờng khử tham gia tạo thành acrylamide mạnh mẽ nhất là glucose, fructose [16, 30]. Hàm lƣợng asparagine tự do trong các loại bột [...]... FAO/WHO năm 2006 [42] 1.3 HỆ BIỂU HIỆN TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS 1.3.1 Những đặc điểm chung của hệ biểu hiện trong nấm men Nấm men là một cơ thể vi sinh vật nhân chuẩn đơn giản, nhƣng chúng mang đầy đủ các đặc điểm của một cơ thể và là một mô hình tiêu biểu cho cấu trúc tế bào Chính vì sự đơn giản trong cấu trúc mà nấm men đƣợc nghiên cứu rất kỹ về mặt di truyền Tế bào nấm men có dạng hình elip hoặc... đƣợc biểu hiện mạnh trong Pichia và định hƣớng plasmid tích hợp với hệ gen nấm men tại locus AOX1 Ngoài ra còn có trình tự nằm sau trình tự kết thúc phiên mã ở đầu 3’ của gen aox1 cũng có tác dụng định hƣớng plasmid tích hợp với hệ gen nấm men tại vị trí locus aox1 (2) Một hoặc nhiều vị trí đa nối (MCS) cho phép chèn gen mong muốn vào vector biểu hiện (3) Trình tự kết thúc dịch mã có nguồn gốc từ gen. .. vi sinh vật - Chủng vi khuẩn E coli DH10b của hãng Invitrogen (Mỹ) đƣợc sử dụng để tách dòng - Chủng nấm men P pastoris SMD1168 của hãng Invitrogen (Mỹ) đƣợc sử dụng làm chủng biểu hiện gen asp1 Plasmid - pUC57 do hãng Invitrogen (Mỹ) sản xuất đƣợc sử dụng làm vector tách dòng - Plasmid pPIC9 của hãng Invitrogen (Mỹ) đƣợc dùng để biểu hiện gen asp1 trong P pastoris Trình tự mồi - Mồi xuôi (5’AOX1):... chứa gen kháng kháng sinh: Gen kháng Ampicillin kí hiệu là amp (AmpR), gen kháng tetracycline kí hiệu tet (TetR) Các vector nấm men thƣờng chứa các gen URA3, HIS 3, LEU 2, TRP 1, LYS 2 Đây chính là các dấu chuẩn chọn lọc trong các dòng nấm men tái tổ hợp, chúng có khả năng bổ sung cho những đột biến khuyết dƣỡng tƣơng ứng [35] 1.3.2 Những ƣu điểm của hệ biểu hiện nấm men Nấm men có những thuận lợi trong. .. g; H2O 50 ml 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Nghiên cứu phân tích và cải biến trình tự gen bằng các công cụ tin sinh Trƣớc khi cải biến gen, trình tự gen ban đầu (A oryzae asp) đƣợc phân tích sơ bộ bằng công cụ phân tích mã bộ ba hiếm (Rare codon analysis tool, Genscript) Công cụ này cho phép đánh giá khả năng biểu hiện của gen ngoại lai A oryzae asp trong chủng chủ P pastoris và S cerevisiae thông... một công bố nghiên cứu nào về việc biểu hiện asparaginase tái tổ hợp trong S cerevisiae Hãng Novozymes A/S Denmark và DSM đã sản xuất và thƣơng mại hóa thành công asparaginase tái tổ hợp từ các chủng nấm sợi biến đổi gen tƣơng ứng A oryzae và A Niger để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhằm làm giảm sự hình thành acrylamide trong thực phẩm Tên thƣơng mại của sản phẩm asparaginase từ A oryzae là Acrylaway®L,... - Nấm men có khả năng tiết protein ngoại lai ra môi trƣờng rất hiệu quả Một mặt có thể sử dụng các trình tự tín hiệu tiết của bản thân gen đƣa vào trong cơ thể vật chủ, hoặc cũng có thê sử dụng trình tự tín hiệu tiết của tế bào nấm men Hệ vector thiết kế dùng trong việc biểu hiện protein ngoại lai ở nấm men ngày càng đƣợc cải biến theo hƣớng tăng cƣờng các trình tự tín hiệu tiết [46] 1.3.3 Hệ biểu hiện. .. thúc dịch mã 3’AOX1 (TT): nucleotide 1253-1586 Khung đọc mở (ORF) HIS4: nucleotide 4514-1980 Đoạn 3’ AOX1: nucleotide 4870-5626 Hình 3 Bản đồ vector biểu hiện pPIC9 ngoại lai trong nấm men P pastoris [43] ColE1 origin: bases 6708-6034 Gen kháng Ampicillin: nucleotide 713-6853 1.3.3.4 Tích hợp gen ngoại lai vào hệ gen P pastoris Cách đơn giản nhất để vector biểu hiện đƣợc tích hợp vào hệ gen P pastoris. .. hiện P pastoris P pastoris là nấm men đƣợc Koichi Ogata phát hiện vào năm 1969, có khả năng sử dụng methanol làm nguồn cacrbon và nguồn năng lƣợng Trong những năm 1970, P pastoris đƣợc ứng dụng để sản xuất protein đơn bào Đến những năm 1980, cùng với sự phân lập thành công gen aox, P pastoris trở thành vật chủ nhân chuẩn để biểu hiện gen ngoại lai hiệu quả [13] Ƣu điểm lớn nhất của việc biểu hiện protein... hydrogenperoxid (H2O2) và formaldehyde Để tránh độc tố của H2O2, sự trao đổi methanol diễn ra bên trong một bào quan chuyên biệt của tế bào là peroxisome, do đó peroxisome cô lập sản phẩm độc khỏi phần khác của tế bào [44] 14 Hệ gen của P pastoris chứa 2 gen alcohol oxidase là aox1 vào aox2 Các vùng mã hóa protein của 2 gen này chiếm 92% gen và chúng tƣơng đồng nhau đến 97% nucleotide Tuy nhiên, gen . tôi đã tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa asparaginase của Aspergillus oryzae trong nấm men Pichia pastoris . Nấm men P. pastoris là hệ thống biểu hiện protein ngoại. trình nghiên cứu biểu hiện asparaginase I và III của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong nấm men P. pastoris [53]. Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng chủng nấm men P. pastoris để biểu hiện asparaginase. gen asp1 định biểu hiện trong P. pastoris (A). Biểu đồ phần trăm phù hợp của các bộ mã của gen asp1 khi đƣợc biểu hiện trong chủng biểu hiện P. pastoris (B) 41 Hình 13. Trình tự gen asp1 cần

Ngày đăng: 14/06/2015, 09:56

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan