Vi sinh vật lên men kị khí

I Lên men kị khí 1Định nghĩaLên men kị khí là quá trình tổng hợp chuyển đổi đường thành sản phẩm như: acid, khí hoặc rượu...nhờ VSV, hoặc trong trường hợp lên men acid lactic trong tế bào cơ ở điều kiện thiếu khí oxy. Lên men KK cũng được sử dụng rộng rãi hơn trong sự tăng sinh khối của vi sinh vật trên môi trường sinh trưởng_sự tích lũy các sản phẩm trao đổi chất hữu ích cho con người trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Lên men KK còn đc sử dụng từ lâu để bảo qản tp.2cơ chế:Quá trình lên men KK diễn ra trong điều kiện thiếu oxy (khi chuỗi vận chuyển electron không thể diễn ra) và trở thành phương tiện chủ yếu của tế bào để sản xuất ATP (năng lượng). Nó chuyển NADH và pyruvate được sản sinh trong bước thủy phân glucoza thành NAD+ và những phân tử nhỏ hơn. Khi có mặt của O2, NADH và pyruvate được dùng cho hô hấp; đó là sự oxy hóa phosphoryl hóa, nó sinh ra nhiều ATP hơn, vì lý do đó, các tế bào thường tránh quá trình lên men nếu có sự hiện diện của oxy. Ngoại lệ bao gồm VSV kỵ khí bắt buộc, nó không chịu được oxy. N ADH được oxy hoá thành N AD+ và chất nhận electron thường là pyruvate hoặc một chất dẫn xuất từ pyruvate. Trong lên men cơ chất bị oxy hoá một phần, ATP chỉ được tạo thành bởi phosphoryl hoá ở mức độ cơ chất và O2 là không cần thiết3các sản phẩm lên men kị khí:lên men sữa chua (vk lactic)lên men rượu, bia (saccharmyces.sp) len men nước tương, sản xuất chao ,lên men thịt làm nem chua.....lên men muối dưa, cà...4. VSV lên men kị khí và nguồn gốc phân lập: Các VSV phổ biến để lên men kị khí là Vk lactic, VK malolalic...., các loại nấm men ( saccharomyces. sp,...)Nguồn phân lập VSV lên men kị khí thường là từ tự nhiên: +) VK lactic : phân lập từ : sữa tự lên men,các sp từ sữa( men sữa sẽ tự đông tụ nhờ emzym và acid ,à lactococci và các vsv khác sinh ra, hiện tượng đông tụ sẽ tiến hành xảy ra trong giờ thứ 10 . canh trường này được sử dụng là nguồn phân lập ). Nguồn phân lập từ các nguyên liệu của các sp lên men như rau củ muối chua(cải muối chua,cà pháo muối chua,)….hay nước hồ . nước giếng, nước bọt của người (lấy trực tiếp nước lên men làm canh trường để phân lập chủng vsv cần thiết mà k cần them thao tác lên men nào trong phòng thí nghiệm)+) nấm men : từ vỏ nho (sx rượu vang), mầm lúa mạch (sx bia)II) Lên men sản xuất rượu vang1. rượu vang.Là sản phẩm được lên men từ nước ép trái cây có chứa đường thường là nước ép nho. Hàm lượng etanol trong rượu từ 8 13% . rượu vang có hàm lượng chất dinh dưỡng cao, có giá trị kinh tế lớn, nguồn gốc lâu đờiPhân loại theo màu sắc Vang trắng (White wine) Vang hồng (Rose wine) Vang đỏ (Red wine)Phân loại theo độ ngọt Rượu vang khô: tất cả đường được chuyển hóa thành rượu. Rượu vang ngọt: Có vị ngọt do còn một phần đường trong trái cây chưa chuyển thành rượu, do thời gian lên men ngắn hay sử dụng chủng nấm men sinh độ cồn thấpPhân loại theo quá trình lên men Rượu vang tự nhiên Rượu vang cao độ. Phân loại theo lượng CO2 Rượu vang có gas Rượu vang không có gas Phân loại theo nơi sản xuấtPhân loại theo quốc gia Phân loại theo vùng2. Các loại VSV lên men rượu vang và nguồn gốc phân lập:Nội sinh : trong vỏ nho: Nấm men: chủ yếu là KloeckeraHanseniaspora, một lượng ít Candida, Metchnikowia, Cryptococcus, Pichia, Kluyveromyces và một lượng nhỏSaccharomyces cerevisiae…• Vi khuẩn Lactic: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus.• Vi khuẩn sinh Acid acetic: Gluconobacter, Acetobacter.• Nấmmốc: Botrytis, Penicillium, Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Alternaria, Ucinula và Cladosporium.• Cả nấm men và vi khuẩn đềucóthểđóng vaitrò tiêu cựcvàtíchcực trong sảnxuất. LM truyềnthống: chỉ sử dụng nhóm VSV nộisinh, và quan trọng hơn là nhóm VSV trên bềmặtthiếtbị (chủ chốtlà Saccharomycescerevisiae) Đưa vào• Chủng Saccharomyces cerevisiae đượclựachọnkỹ lưỡng làm giống khởi động thay vìdựavàohệ VSV tự nhiên.• Giống khởi động cầncónhững đặctínhsau:Di truyền: đồng hình nhị bội(thường là đabội)Phát triển: pha khởi động ngắn hay không có; đặc tính “killer”; chịuSO2Trao đổichất: LM nhanh và ổn định; hiệusuấtchuyển hóa đường thành ethanol caoHương vị: nồng độ acid bay hơihợp lý; thànhphầnhương vị phù hợp (esters, terpens, acid succinic, glycerol); acetaldehyde thấp; thànhphầncáchợpchấtchứaS cân đối.Đặc điểmkhác: bàitiết urea ngoạibàothấp nhằm hạn chế khả năng sinh ethyl carbamate gây ung thư• Trong sản xuất rượu vang người ta hay sử dụng các chủng của saccharomyces. Trong đó chủ yếu là Sac. cerevisiae, Sac. awamori, Sac. oryzae…3. nuôi cấy VSV lên men RV trong PTN.• Có ảnh hưởng tới sự phát triển của nấm men bao gồm các yếu tố sau đây: Sinh trưởng tại các nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 37, 420C. Tạo thành tinh bột. Sản sinh acid từ glucoz Thủy phân Urê Phân giải Arbutin Phân giải lipid Năng lực sản sinh sắc tố Sinh trưởng trên môi trường chứa 50% và 60% glucoza (người ta thường nuôi cấy nấm men trong môi trường thạch :mạch nha và môi trường mạch nha dịch thể) Hóa lỏng gelatine Phát triển trên môi trường chứa acid acetic 1%, Sinh trưởng khi thiếu hụt một số vitamin (myoInositol, calcium pantothenate, biotin, thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, paminobenzoic acidpH: 4,55,5 (Mức độ hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzym tham gia vào sự tổng hợp protein, tạo vitamin đều tùy thuộc vào độ pH, pH ngoài 4,55,5, làm chất lượng nấm men giảm đi.)Nấm men được nuôi cấy trong các ống nghiệm thạch nghiêng hoặc đứng đựng 3 ml môi trường dịch thể. cấy nấm men theo đường thẳng hoặc zich zăc vào đĩa Petri chứa môi trường bột ngô, để ở 200C sau từng thời điểm 3, 5,7,10, 15 ng ày. Úp ngược đĩa Petri lên một phiến kính sạch, để qua đ êm. Quan sát bào t ử bắn trên phiến kính trên kính hiển vi. Quan sát bào t ử túi (ascospore) thu sinh khối nấm men khô bằng li tâm dịch nấm men lỏng. 4.Quá trình lên men rượu vang ở quy mô công nghiệp.Dịch nấm men Saccharomyces cerevisiae (106 107 tế bào ml)  Dạng đông khô : giống khô hòa tan trong nước ấm 400C, để yên 15 phút kế đó khuấy đều dịch nấm men và cấy vào dịch ép “must’’● Mặc dù lên men rượu là một quá trình yếm khínhưng ở giai đoạn đầu của quá trình lên men cần cho nước quả tiếp xúc với O2 bằng cách sục khí. • ● Giai đoạn sau mới cho lên men yếm khí.Nhiệt độ có ảnh hưởng đến đời sống nấm men, quá trình lên men và chất lượng sản phẩm Nhiệt độ lên men rượu vang trắng thích hợp: 15300 C Lên men rượu vang đỏ: 250 CDịch quả thường có pH từ 2,8 3,8. Khoảng pH này nấm men vẫn hoạt động được. Vùng pH tối ưu của nấm men 4 6 Trong CN sản xuất rượu vang người ta chuẩn bị môi trường nước quả có pH 3 3,5Trong nước nho hàm lượng đường từ 10÷25%, quá trình lên men vẫn bình thường. Nếu hàm lượng đường >25% thì quá trình lên men bị chậm và khó khăn.Quy trình chiết dịch nho Quy trình lên men rượu vang • Có 2 quá trình lên men cơ bảnxảyra– lên men sơ cấp (primary fermentation) – lên men thứ cấp (secondary fermentation)Và mộtsố các quá trình lên men khác.Lên men sơ cấp (primary fermentation)• Chuyển hoá hai loại đường chính có trong nho(glucose và fructose) thành rượu ethylic (ethanol) theo con đường Embden MeyerhofParnas.• Trong gian đoạn đầucủa quá trình LM, nhómnấmmen khácvới Saccharomyces đóng vai tròchủđạo (Kloeckera, Hansenniaspora, Candida, Metschnikowia…).• Nhóm này khá mẫncảmvới ethanol và giảmdầnsố lượng (chết) sau 4 ngày LM khi nồngđộ cồn đạtkhoảng 5%.• Trong giai đoạntiếp theo, quá trình LM đượcthựchiệnchủ yếubởi các chủng rượu Sac.cerevisiae có thể chống chịu đượcnồng độ cồncao (tớikhoảng 15%).Trong điềukiệnkỵ khí, nấmmen loạiCO2khỏi pyruvate trong phản ứng xúc tác bởienzyme pyruvate decarboxylase tạoraacetaldehyde và CO2 Acetaldehyde đượckhử thành ethanol dướitácđộng củaenzyme alcohol dehydrogenase vàNADH. Tạo thành trong quá trình lên men dịch quả có thểđược quan sát là nhữngbọt bóng CO2 nổitrênbề mặtdịch chất.Lên men thứ cấp (secondary fermentation) • Acid malic trong nho được chuyển hoá thànhacid lactic => lên men malolactic.• vi khuẩn lactic.Acid lactic yếuhơn acid malic =>giảm tính acid nói chung củarượu vang. sảnphẩmphụ => góp phầntíchcựcvàotínhphứctạpcủa rượu vang. Các quá trình lên men khác• VK lên men glycerol trong rượu  acid lactic + acid acetic. • VK biến đổi đường nho tự nhiên acid lactic + acid acetic. • VK biến đổi acid tartaric trong rượu  acid lactic + acid acetic + khí CO2• VK giấmbiến đổirượu  acid acetic nước+ khí CO2=> làm giảm đichấtlượng rượuvang. => bảo đảm quá trình lên men sơ cấpvàthứ cấpdiễnracókiểmsoátvà đúng đắn. rượuvangcầnđược đánh giá, ngửivànếmthường xuyên• Ngoài ethanol và CO2 còn 1 sảnphẩmquantrọng nữa của quá trình LM là glycerol. Nồngđộ glycerol trong RV có thể thay đổi trongkhoảng từ 210 gl, tùy thuộvàochủng loạinấmmen và điềukiệnLM. • Glycerol đượctạo ra trong phản ứng sau: • Mặc dù, glycolysis là quá trình cơ bảntrongđồng hóa nguồn cacbon, 1 số chu trình kháccũng xảyratrongquátrìnhLM dịch nho: – con đường pentose phosphate– chu trình acid citric > acid succinic (0,5gl). • Các quá trình này tạora:CồnbậccaoEsterAcid hữucơAldehyde và ketoneHợpchấtchứaLưuhuỳnh=> Tổng thể tác dụng củanhững chấtnàytạonên hương vị củaRV.• Nồng độ tương đối củanhững thành phầnkểtrên phụ thuộc vào chủng giống nấmmen sửdụng và điềukiệnLM, đặcbiệt là nhiệt độ.5. Tác nhân gây ảnh hưởng tới quá trình lên men rượu vang.Sự phát triển, sinh trưởng và sản phẩm trao đổi chất của 1 số vsv trong quá trình LM có thể gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng rượu vang. nhiều công đoạn trong sản xuất cũng như bản thân ng liệu có thể bị đe dọa bởi vsv gây thối hỏng, quá trình oxyhóa. Biện pháp : loại trừ Oxy bổ sung sunfua dioxide (sử dụng như chất tẩy rửa)?: Môi trường mạch nha: Lấy lúa đại mạch đã ủ cho nảy mầm (loại nhập khẩu dùng để làm bia), đem phơi khô rồi xay nhỏ thành bột. Cân 1kg bột này, thêm 3 lít nước, giữ ở 60°C để đường hoá cho đến khi hết tinh bột (thử với dịch Lugol không thấy có màu xanh lam). Lọc lấy dịch trong có thể thêm 3 lòng trắng trứng rồi trộn đều, đun sôi rồi lọc lấy dịch trong. Điều chỉnh bằng nước để có nồng độ đường đạt 6° Baume.Sinh khối nấm men dạng thương mại 4.1 . Men lỏng Nấm men lỏng là một sản phẩm thu nhận được ngay sau khi quá trình lên men hiếu khí kết thúc. Khi sử dụng nấm men lỏng thì vấn đề chất lượng rất được quan tâm do nó rất dễ bị nhiễm những vi sinh vật lạ, bị l ẫn các sản phẩm trao đổi chất của nấm men. Nhược điểm rất lớn là khó bảo quản, thời gian sử dụng chỉ nằm trong giới hạn 24 giờ sau khi sản xuất.Chính vì thế, việc sản xuất và sử dụng nấm men lỏng thường được tổ chức như một phân xưởng riêng trong các cơ sở sản xuất. 4.2.Men dạng paste Nấm men paste là khối nấm men thu được sau khi ly tâm nấm men lỏng. Nấm men paste thường có độ ẩm khoảng 7075%. Nấm men paste thường có hoạt lực nở kém hơn nấm men lỏng do quá trình ly tâm và thời gian kéo dài, nhiều tế bào nấm men chết. Nếu được bảo quản lạnh ở 47 0C, ta có thể sử dụng nấm men paste trong khoảng 10 ngày. Như vậy nếu chuyển nấm men lỏng sang nấm men paste, ta có thể kéo dài thời gian sử dụng và thuận lợi trong việc vận chuyển. Thường sử dụng ở các cơ sở sản xuất bánh mì, liều lượng sử dụng 45% so với khối bột lên men. 4.3. Men khô Nấm men khô lại được sản xuất từ nấm men paste. Người ta sấy nấm men paste ở nhiệt độ < 400C hoặc sử dụng phương pháp sấy thăng hoa. Nấm men khô có độ ẩm < 10%, ưu điểm rất lớn là thời gian sử dụng rất lâu và dễ vận chuyển. 5. Điều kiện nuôi cấy nấm men: 5.1.Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất sinh khối nấm men 5.1.1. Nhiệt độ Có ảnh hưởng lớn lên tốc độ tăng trưởng của nấm men. Nhiệt độ thích hợp nhất để nấm men phát triển tốt là 2830ºC.Trên 43ºC và dưới 28ºC sự sinh sản của nấm men bị chậm hay ngừng lại. 5.1.2. Độ pH của môi trường Độ pH tốt nhất cho sự tăng trưởng của men bánh mì là 4,5 – 5,5; pH= 4: tốc độ tích lũy sinh khối giảm. Nếu pH=3,5 hay pH=3 sẽ làm sự sinh sản của nấm men bị ngừng lại. Mức độ hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzym tham gia vào sự tổng hợp protein, tạo vitamin đều tùy thuộc vào độ pH, pH ngoài 4,55,5, làm chất lượng nấm men giảm đi.