xác định đột biến gen alpha globin gây bệnh thalassemia bằng kỹ thuật PCR đa mồi

90 807 3
xác định đột biến gen alpha globin gây bệnh thalassemia bằng kỹ thuật PCR đa mồi

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

    ALPHA GLOBIN     - 2014     ALPHA GLOBIN   Chuyên ngành:  : 60 42 01 21   :  - 2014 LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS. TS. Võ Thị Thương Lan, người đã chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình em thực hiện đề tài. Cô không chỉ truyền thụ cho em nhiều kiến thức về chuyên môn mà còn giúp em bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực hiện luận văn, là hành trang giúp em tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này. Em cũng xin trân trọng cảm ơn ThS. Tạ Bích Thuận. Cô đã luôn động viên, dành cho em nhiều lời khuyên quý báu trong những lúc em gặp khó khăn. Về phía nhà trường, em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Khoa Sinh học đã giảng dạy cho em nhiều kiến thức quý báu; em xin cảm ơn Bộ môn Di truyền học, Phòng sau đại học, Phòng công tác chính trị Học sinh - Sinh viên đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn thạc sỹ. Em cũng xin cảm ơn Phòng thí nghiệm Sinh Y, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym - Protein là nơi em thực hiện đề tài nghiên cứu cho luận văn thạc sỹ. Về phía cơ quan, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể Khoa Di truyền & SHPT, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương là nơi em đang công tác. Các anh chị luôn chia sẻ với em trong công việc, thường xuyên động viên về tinh thần giúp em vững tin trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Những kiến thức chuyên môn anh chị chia sẻ đã giúp em hoàn thiện luận văn tốt nhất có thể. Em xin chân thành cảm ơn NCS. Ngô Thị Hà và các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh Y đã giúp đỡ và cổ vũ em trong suốt thời gian qua. Đặc biệt em xin cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Thu Hường đã luôn kề bên động viên tinh thần, giúp đỡ tận tình mỗi khi em gặp khó khăn trong quá trình thực hiện luận văn cũng như những vấn đề trong cuộc sống. Lời cuối em xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, người thân và bạn bè luôn ủng hộ, giúp đỡ em rất nhiều về cả vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2014 Học viên Trần Tuấn Anh BNG KÝ HIU VÀ CH VIT TT Vit tt Vi ADN : Acid Deoxyribonucleic ARN : Acid Ribonucleic bp : Base pair dNTP : Deoxynucleotide Triphosphates G6PD : Glucose-6-phosphate dehydrogenase kb : Kilobase MCH : Mean Cell Hemoglobin MCV : Mean Corpuscular Hemoglobin PCR : Polymerase Chain Reaction WHO : World Health Organization DANH MC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1. α-globin  (16p13.3) 9 Hình 2.  + -thalassemia 10 Hình 3.  + -thalassemia 11 Hình 4.  o - α-globin 12 Hình 5.  15 Hình 6.  thalassemia 23 Hình 7.  nghiên cu 26 Hình 8. Kt qu n di ADN tng s trên gel agarose 1% 32 Hình 9. Kt qu tu kin ni kim LIS 33 Hình 10. Kt qu sàng lt bin SEA 34 Hình 11. Kt qu sàng lt bin THAI 35 Hình 12. Kt qu sàng lc và tu kin phn i n - 3.7 n - 4.2 (B) 36 Hình 13. Kt qu sàng lc khun ln chèn SEA bng cp mi vector M13-F/R 38 Hình 14. Kt qu sàng lc khun ln chèn SEA bng cp mi SEA-F/R 39 Hình 15. Kt qu sàng lc khun ln chèn 4.2 bng cp mi vector M13-F/R 39 Hình 16. Kt qu sàng lc khun ln chèn 4.2 vi cp mi 4.2-F/R 40 STT Tên hình Trang Hình 17.  40 Hình 18. Kt qu n SEA vi ngân hàng d liu NCBI 41 Hình 19. Kt qu n 4.2 vi ngân hàng d liu NCBI 42 Hình 20. Kt qu tu kin phn ng PCR vi hai cp m 44 Hình 21. Kt qu n di sn phm PCR s dng ba cp m 45 Hình 22. Kt qu tu kin phn ng PCR s dng ba cp m SEA 46 Hình 23. Kt qu n di sn phm PCR s dng bn cp m và 4.2 48 Hình 24. Kt qu tu kin phn ng PCR vi m-F mi thit k 49 Hình 25. Kt qu kim tra tính nh ca m-F mi thit k 49 Hình 26. Kt qu tu kin PCR vi 4 cp mi có b sung DMSO 51 Hình 27. Kt qu sàng ti 5 cp m 52 Hình 28. Kt qu PCR mt s mt bin vi quy i t 53 DANH MC CÁC BNG STT Tên bng Trang Bng 1. Trình t các cp mi dùng trong nghiên cc sn phm ng 24 Bng 2. Thành phu kin phn m  28 Bng 3. Thành phu kin nt bin vào vector pTZ5T-R/T 37 Bng 4. Thành phu kin sàng lc khun lc vi cp mi vector M13-F/R 38 Bng 5. Thành phu kin phn ng PCR s dng hai cp mi LIS và  43 Bng 6. Thành phu kin phn ng PCR s dng ba cp m và SEA 45 Bng 7. Thành phu kin phn ng PCR t dng ba cp mi  46 Bng 8. Thành phu kin phn ng PCR s dng bn cp mi LIS,  47 Bng 9. Thành phu kin phn i có b sung DMSO 50 Bng 10. Thành phu kin tn ng PCR s dng 5 cp m 52 Bng 11. Tng hp s lit bin 66 MC LC  1 NG QUAN TÀI LIU 3 1.1.  QUAN   ALPHA THALASSEMIA 3  3  3  5  8 1.1.4.1. Cu trúc và t chc cm gen globin  i 8  t bin 9 1.2. SÀNG   MANG GEN VÀ    ALPHA THALASSEMIA 13  13  16 t hc 16 1.2.2.2. Phân tích thành phn hemoglobin 17 1.2.2.3. Phân tích t l tng hp chui alpha/beta-globin 17 c phân t 18 1.3.  PHÁP PCR   TRONG    ALPHA THALASSEMIA 19 IÊN CU 22 2.1. NGUYÊN  HÓA  VÀ   22 ng nghiên cu 22 2.1.2. Hóa cht 22 2.1.3. Các cp mi 23 2.1.4. Thit b 24 2.2.  PHÁP NGHIÊN  25 2.2. nghiên cu 25 nh n ADN b 27 2.2.3. K thui 27 n di 28 2.2.5.  28 2.2.5.1. Bin np bng sc nhit 29 2.2.5.2. Sàng lc khun lc và nuôi t bào bão hòa 29 2.2.5.3. Tách plasmid 30 T QU VÀ THO LUN 31 3.1.   NHÓM  NHÂN NGHIÊN  31 3.2.   SÀNG     32 3.2.1. Sàng lc mn SEA 33 3.2.2. Sàng lc hai mn THAI, FIL 34 -- 35 3.3. BIN NP, TÁCH DÒNG VÀ GII TRÌNH T N T BIN 37 3.3.1. Kt qu sàng lc khun lc t bin SEA 37 3.3.2. Kt qu sàng lc khun ln t bin 4.2 39 3.3.3. Kt qu gii trình t t bin 40 3.4. KT QU TI  HÓA U KIN PHN NG PCR  MI 43 3.4.1. Ti cp m 43 [...]... cùng một phản ứng PCR [43] Trong khi đó, ở Việt Nam hiện tại ch có 4 t nh thành 19 (Hà Nội, HCM, TT Huế, Bến Tre) thực hiện xét nghiệm gen phục vụ chẩn đoán bệnh thalassemia [1] Vì vậy xây dựng quy trình xác định đồng thời nhiều đột biến gen thalassemia được chúng tôi quan tâm nghiên cứu trong đề tài Xác định đột biến gen alpha globin gây bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật gap PCR đa mồi với mục đích... thì không có đột biến mất cả 2 gen α -globin mà chủ yếu là đột biến mất một gen α2 -globin; khu vực đứt gãy nằm tại vị trí từ 145.000 đến 165.000 bp [29] b) Cơ chế phát sinh alpha + -thalassemia do đột biến điểm Trong bệnh alpha- thalassemia, tỷ lệ đột biến mất đoạn chiếm chủ yếu so với đột biến điểm (đột thay thế, chèn hoặc mất nucleotide) Tuy nhiên, đột biến điểm trong α+ -thalassemia có thể gây giảm tổng... khẳng định bằng xét nghiệm gen, được thực hiện trong giai đoạn 3 [1, 3, 56, 62] Giai đoạn 3 - Xác định đột biến bằng phương pháp sinh học phân tử Trường hợp HbΑ2 < 3,2 % được kiểm tra với đột biến mất đoạn gen globin Trường hợp, HbΑ2 > 3,5 % trước tiên phải sàng lọc đột biến điểm trên gen β -globin, nếu ch phát hiện một đột biến gen β -globin dị hợp tử cần phải tiếp tục xét nghiệm phát hiện đột biến gen. .. hiện của gen α2 -globin gấp 2 - 3 lần mức độ biểu hiện của gen α1 -globin Sự khác biệt mức độ biểu hiện của 2 gen α -globin liên quan đến sự đa dạng về kiểu gen cũng như đặc điểm lâm sàng trong thể mang và bệnh sinh α -thalassemia [61] Cho đến nay đã xác định được hơn 40 loại đột biến mất đoạn và hơn 100 đột biến điểm liên quan đến bệnh α -thalassemia, những đột biến này gây giảm tổng hợp (α + -thalassemia) ... FIL, MED, α3.7 , -α4.2 trong bệnh α -thalassemia [1] 1.3 PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ALPHA THALASSEMIA Như đã đề cập, hầu hết đột biến trong bệnh α -thalassemia là các mất đoạn trên gen α -globin Những đột biến này có thể được phát hiện bằng phương pháp PCR sử dụng hai mồi thiết kế dựa vào trình tự ở hai vùng biên đoạn đứt gãy Với những đột biến mất đoạn lớn, mồi thiết kế ở hai vùng biên... alen bình thường bởi vì khoảng cách giữa hai mồi quá lớn Kỹ thuật này được gọi là PCR khoảng cách hay "gap PCR" Theo các nghiên cứu công bố, cho đến nay đã xác định được hơn 35 đột biến mất đoạn phổ biến trên vùng gen α -globin trong đó có hơn 20 mất đoạn lớn (mất đoạn 2 gen) , 15 đột biến mất đoạn nhỏ (mất đoạn 1 gen) [34, 44] Kỹ thuật gap PCR đơn mồi ch xác định từng mất đoạn đơn lẻ, nên không phù hợp... Cơ sở phân tử bệnh alpha thalassemia 1.1.4.1 Cấu trúc và tổ chức cụm gen globin ở người người bình thường, chuỗi α -globin được tổng hợp bởi gen α1 -globin và gen α2 -globin nằm cạnh nhau trên nhiễm sắc thể 16 (băng 16p13.3) Cấu trúc cụm gen α -globin được xác định lần đầu bằng kỹ thuật lai ADN (blot hybridization) từ năm 1978 [50] Hình 1 mô tả cấu trúc cụm gen α -globin với 2 gen alpha1 và alpha2 mã hóa... đồng Tần suất những đột biến mất đoạn gen α -globin đặc trưng cho từng vùng lãnh thổ và từng tộc người Trong quá trình xét nghiệm đột biến trên gen α -globin, những mất đoạn lớn phổ biến được xác định trước tiên bằng phương PCR khoảng cách hay gap PCR Kỹ thuật này đã được áp dụng để phát hiện 2 mất đoạn phổ biến trong α+ -thalassemia là –α3.7 , –α4.2 và 5 mất đoạn phổ biến trong α o -thalassemia gồm: –α20,5,... Phụ lục 1 - Kết quả giải trình tự đoạn đột biến SEA 69 Phụ lục 2 - Kết quả giải trình tự đoạn đột biến α4.2 .70 Phụ lục 3 - Kết quả phát hiện đột biến trên 100 mẫu bằng kỹ thuật PCR đa mồi .71 Phụ lục 4 - Bảng tổng hợp kết quả xét nghiệm cận lâm sàng 74 Phụ lục 5 - Những đột biến điểm gây α -thalassemia 79 Phụ lục 6 - Những đột biến alpha- thalassemia trong khu vực Đông Nam Á 80... α -globin (αothalassemia) 8 Nhiễm sắc thể 16 Cụm gen α -globin Hình 1 Cấu trúc cụm gen α -globin nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 16 (16p13.3) gồm 2 gen mã hóa cho chuỗi α -globin - alpha1 và alpha2 , 1 gen zeta2 mã hóa cho chuỗi ζ -globin trong phôi, 3 gen giả (pseudo zeta1, pseudo alphal và pseudo alpha2 ) và 1 gen theta1 chưa rõ chức năng [4, 40] 1.1.4.2 Cơ chế phát sinh đột biến a) Cơ chế phát sinh alpha .  Thalassemia            ,  alpha globin (α -globin) beta globin ( -globin) .  thalassemia. 1.1.4 alpha thalassemia 1.1.4.1.   -globin   gen α1 -globin và gen α2 -globin trên.  α -globin  ADN  1978 [50]. Hình       gen α -globin  2 gen alpha1 và alpha2 mã hóa cho   -globin,

Ngày đăng: 18/05/2015, 23:29

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan