1 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH VÀ SO SÁNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC DÒNG KEO TAI TUỢNG TỨ BỘI VÀ NHỊ BỘI Ở VIỆT NAM Lê Đình Khả 1 , R. Griffin 2 , Hà Huy Thịnh 3 , J. Harbard 2 , Lê Sơn 3 , Dương Thanh Hoa 3 , Nghiêm Quỳnh Chi 3 Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Sciennce and Technology Journal of Agriculture & Rural Developmmet) ISSN 0888-7209. 2009, No 9. pp. 114-120. TÓM TẮT Nghiên cứu xác định mức độ đa bội và so sánh các dòng Keo tai tượng tứ bội (4n) với nhị bội (2n) tương ứng đã được thực hiện tại phòng thí nghiệm và khảo nghiệm tại Ba Vì (Hà Nội), Đông Hà (Quảng Tri) và Bầu Bàng (Bình Dương). Kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ số đa bội được xác định bằng Flow Cytomtry (Partec Ploidy Analyser) của cây 4n lớn hơn 180, của cây 2n là 75 - 95, diện tích tương đối trung bình của tế bào khí khổng ở cây 4n là 14.413 - 14.421 đơn vị , ở cây 2n là 8.480-9.030 đơn vị, thể tích tương đối của khối phấn ở cây 4n giao động từ 55,726 đến 65,804 đơn vị, ở cây 2n là từ 30,730 đến 32,764 đơn vị. Trong các dòng đã qua xử lý colchicine đã xác định được một số dòng là tứ bội, một số dòng khác là nhị bội. Các dòng có mức độ đa bội được xác định chắc chắn là các dòng đã được đếm số lượng nhiễm sắc thể hoặc có sự thống nhất giữa chỉ số đa bội, kích thước tế bào khí khổng và kích thước khối phấn. Ở giai đoạn 4 tuổi cây tứ bội (4n) có thể tích thân cây 7,03 - 67,22 dm 3 /cây, trong khi của cây 2n tương ứng là 20,20 - 99,99 dm 3 /cây. Chiều dài sợi gỗ của cây 4n (644,5 - 695,4  m), sai khác không đáng kể so với cây 2n (600,8 -626,6  m), trong khi đường kính sợi gỗ của cây 4n và 2n tương ứng là 16.91 - 19.52 và 13.80 - 15.96  m (sai khác rõ rệt). Các dòng tứ bội sẽ được sử dụng để chọn tạo giống tam bội có ưu thế lai ở Keo tai tượng. Từ khóa: Keo tai tượng, mức bội thể, tứ bội, chỉ số đa bội, kích thước tế bào khí khổng, kích thước khối phấn. 1. MỞ ĐẦU Đa bội hoá tự nhiên (natural polyploidy) là một trong những con đường tiến hoá của thực vật và là con đường chủ yếu nhất để hình loài, đặc biệt là ở các loài thực vật ngành Hạt kín (White et al, 2007). Một số họ thực vật gồm nhiều loài với số lượng nhiễm sắc thể của các loài thay đổi theo cấp số cộng. Ví dụ, ở họ Rutaceae , số lượng nhiễm sắc thể (2n) của các loài giao động rất lớn: 2n = 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, v.v Các loài cây ở họ Meliaceae cũng có số luợng thể nhiễm sắc thay đổi tương tự như họ Rutaceae (Gill and Singhal, 1998). Đa bội hoá tự nhiên cũng tồn tại ở một số chi (genus) thuộc họ Liliaceae (Bolkhovskikh et al., 1969) và ở các chi Alnus, Betula, Hevea, Acer, Eugenia thuộc nhóm cây rừng (Wright, 1976). Một thí dụ về đa bội tự nhiên trong lâm nghiệp được nhiều người đề cập là Dương núi (Populus tremula) tam bội (3n=57 thể nhiễm sắc) do Nilsson Eler phát hiện ở Thụy Điển năm 1935, hoặc Populus tremula ở Nga và Populus tremuloides ở 1 GS.TS. Viện cải thiện giống và Phát triển lâm sản, email: ledinhkha@fpt.vn 2 GS.TS., TS. Trường đại học tổng hợp Tasmania, Australia, email: griffinr@postoffice.utas.edu.au 3 TS., KS, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng, email: ha.huy.thinh@fsiv.org.vn 2 Mỹ đều có sinh truởng nhanh hơn rõ rệt so với cây nhị bội (Matskevish, 1962, Wright, 1976). Tăng số lượng thể nhiễm sắc có thể làm tăng thêm các tổ hợp gen mới và tăng khả năng biến dị, tăng tính thích ứng với môi trường mới (Gill and Singhall, 1998). Vì thế các nhà khoa học tìm cách tạo giống đa bội nhân tạo với hy vọng có được những tính chất như cây đa bội tự nhiên. Nghiên cứu thu nhận cây đa bội nhân tạo đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới từ những năm 1950 như Mỹ, Anh, Nga, v.v Yêu cầu của trồng rừng lấy gỗ là cây sinh trưởng nhanh, song cây tứ bội nhân tạo lại thường có sinh trưởng chậm hơn cây nhị bội, nên nghiên cứu tạo đa bội ít được chú ý trong lâm nghiệp. Gần đây, với sự phát triển của kỹ thuật lai giống, cho phép tạo ra các giống tam bội mới từ cây tứ bội và cây nhị bội, một số nước đã tạo ra các dạng tứ bội làm vật liệu khởi đầu cho lai giống nhằm tạo giống lai tam bội sinh trưởng nhanh và không có hạt. Dự án nghiên cứu tạo giống Keo tai tượng tam bội (3n) từ các dạng tứ bội (4n) đã được Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng (Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam) và Ðại học tổng hợp Tasmania (Australia) thực hiện từ năm 2001 với sự tài trợ của ACIAR. Những cây đã được xử lý colchicine ở Australia và đã được xác định là cây tứ bội ở Ausutralia đã được nhân giống bằng nuôi cây mô và gây trồng ở vườn ươm ở Việt Nam đã thể hiện tính đa dạng hết sức rõ về hình thái. Vì thế đánh giá mức độ đa bội và nghiên cứu so sánh sinh trưởng của chúng với cây nhị bội được chọn lọc ở Việt Nam là một việc làm hết sức cần thiết. 2. VÂT LIÊU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu là các dòng Keo tai tượng (Acacia mangium) đã xử lý colchicine tại Australia và được coi là cây tứ bội khi gửi đến Việt Nam. Đối chứng là các dòng vô tính Keo tai trượng nhị bội đã được Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng chọn lọc từ các vườn giống FORIP (được ký hiệu là 2n VN chọn), đã qua khảo nghiệm đánh giá tại ở Ba Vì và Bầu Bàng. Trong đó các dòng ĐC20 và ĐC113 là những dòng đã được xác định kích thước tế bào khí khổng và kích thước hạt phấn. Khảo nghiệm được trồng trồng theo hàng 10 cây, lặp lại 4 lần vào năm 2003 tại Ba Vì (Hà Nội), Ðông Hà (Quảng Trị) và Bầu Bàng (Bình Dương). Xác định số lượng thể nhiễm sắc dưới kính hiển vi ánh sáng Olympus. Mẫu rễ non của cây hom được cố định trong dung dịch cồn-acetic, sau đó nhuộm màu bằng acetocarmin (Pauseva, 1981). Xác định mức độ đa bội bằng chỉ số đa bội được đo bằng Flow Cytometry (máy phân tích mức bội thể của Hãng Partec: Partec Ploidy Analyser), chuyên dụng để xác định mức bội thể của tế bào thông qua chỉ số về hàm lượng DNA trong nhân tế bào. Đo đạc được thực hiện tại Viện Di truyền nông nghiệp. Chỉ số đa bội lớn hơn thể hiện mức bội thể lớn hơn. Xác định các chỉ số hình thái có liên quan đến mức bội thể gồm: Chỉ số lá I l (leaf index, tỷ lệ chiều dài/chiều rộng của lá đã định hình), kích thước tế bào khí khổng, kích thước hạt phấn. Kích thước tế bào khí khổng được xác định bằng cách chọn lá bánh tẻ, lau sạch, quét một lớp mỏng sơn móng tay bóng lên mặt trên của lá (khoảng 1 - 2cm 2 ), để khô trong khoảng 10 phút, dùng panh nhọn bóc lớp sơn, đặt nhẹ nhàng lên lam kính, nhanh chóng đậy la men, dán kín rồi quan sát dưới kính hiển vi. Kích thước tế bào khí khổng được xác định theo trị số đo tương đối dưới kính hiển vi Olympus, nghĩa là theo số vạch được thể hiện trên trắc vi thị kính và là trị số trung bình của mẫu lấy từ 3 lá đã phát triển định hình ở 3 cành trên cây. Diện tích 3 được tính là diện tích tương đối (chiều dài x chiều rộng). Nghiên cứu hạt phấn theo phương pháp nhuộm màu bằng acetocarmin và quan sát dưới kính hiển vi (Pauseva, 1981), kích thước khối phấn được xác định theo số vạch dưới kính hiển vi. Thể tích tương đối của khối phân được tính theo thể tích hình cầu V= R 3 3 4  . Thu thập số liệu sinh trưởng ở giai đoạn 4 năm tuổi (năm 2007). Đường kính thân cây được tính theo centimet (cm) đo ở độ cao ngang ngực (D 1,3 ), chiều cao cây (H) được đo từ gốc đến đỉnh ngọn và tính theo mét (m) . Thể tích thân cây được tính theo dm 3 và theo công thức V = fH D . 4 2  . Trong đó f là chỉ số hình dạng được ước tính là 0,5. Mẫu gỗ để xác định độ dài và đường sợi gỗ được lấy ở thân và ở cành của 4 cây 2n và 6 cây 4n đại diện có sinh trưởng trung bình tại Ba Vì, phân tích tại Phòng Tài nguyên thuộc Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam. Sợi gỗ được đo dưới kính hiển vi Olympius và tính theo micromet (  m). Hệ số tương quan r giữa thể tích khối phấn với diện tích tế bào khí khổng và so sánh giá trị bình quân của các mẫu gỗ tứ bội và nhị bội được tiến hành theo giả thuyết U (Nguyễn Hải Tuất, 1982), khi U>1,96 sai khác mới có ý nghĩa. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định mức độ đa bội ở giai đoạn vườn ươm Mức bội thể của một giống hoặc loài cây được xác định bằng số lượng nhiễm sắc thể của tế bào sinh dưỡng (sôma) hoặc tế bào sinh dục. Phương pháp xác định mức bội thể trực tiếp và chính xác nhất là đếm số lượng nhiễm sắc thể của tế bào. Phương pháp đo chỉ số đa bội bằng Flow Cytometry thông qua đo hàm lượng DNA trong tế bào và các phương pháp đo chỉ số lá (leaf index), kích thước khí khổng và kích thước hạt phấn đều là các phương pháp gián tiếp. Xác định chỉ số đa bội bằng Flow Cytometry được xem là phương phương pháp hữu hiệu, chính xác và nhanh nhất để xác định mức bội thể ở cây trồng. Tuy vậy, phương pháp này chỉ hiệu quả khi ta đã có một giống đối chứng với mức bội thể đã được xác định thông qua đếm số lượng nhiễm sắc thể. Kết quả đếm số lượng thể nhiễm sắc trong tế bào đầu chóp rễ non ở một số dòng cho thấy các dòng 27 và 64 là nhị bội có 26 nhiếm sắc thể, các dòng 10 và 28 đều có 52 nhiễm sắc thể là dòng tứ bội (4n). Những dòng này được coi là cây 2n và 4n điển hình làm chuẩn (hình 1). Tuy vậy đếm số lượng thể nhiễm sắc là phương pháp rất khó thực hiện đối với cây thân gỗ thuộc Lớp hai lá mầm, vì có thể nhiễm sắc quá nhỏ, hơn nữa việc làm sạch tế bào chất để quan sát dưới kính hiển vi cũng rất khó khăn. Kết quả (bảng 1) cho thấy có thể phân các dòng vô tính thành hai nhóm: (i). Nhóm có chỉ số đa bội bằng 68,7 - 96,1 (dưới 100) thường có hính thái lá là cây nhị bội, trong đó có dòng 27 và 64 đã được xác định là nhị bội bằng đếm số nhiễm sắc thể (ii) Nhóm có chỉ số đa bội lớn hơn 170 là cây tứ bội, trong đó có dòng 10 và 28 đã được xác định là tứ bội bằng đếm số nhiễm sắc thể . Một số dòng vô tính có thể được xem là khảm về mức bội thể, ví dụ, dòng số 14 có 2 chỉ số đa bội là 177,2 (tứ bội, 4n) và 91,3 (nhị bội, 2n), nhưng có thể là dòng 14 là nhị bội, nhưng khi đo mức bội thể có một số tế bào đang ở chu kỳ phân bào G2 (chưa xảy ra mitose), nên hàm lượng DNA 4 đã tăng gấp 2 (tương đương với 4n) . Đối với các Dòng 58 và 64, ta thấy Dòng 58 có 2 chỉ số đa bội là 189,2 (tứ bội, 4n) và 46,3 (chỉ số đa bội rất nhỏ, gần với mức đơn bội, 1n) và dòng 64 có chỉ số đa bội là 68,7 và 43,1 (vừa 2n, vừa 1n). Hai dòng vô tính này có thể là dạng khảm, nhưng cũng có thể trong quá trình thao tác hoặc khi đo hàm lượng DNA, nhân của một số tế bào bị vỡ làm giảm hàm lượng DNA và dẫn đến các chỉ số bội thể nhỏ. Việc không quan sát thấy hiện tượng khảm của các dòng về hình thái tại vườn ươm cho thấy cần phải kiểm tra lại mức bội thể của các dòng này bằng Flow Cytometry. Hình1. Lá Keo tai tượng nhị bội (64 và 27) và tứ bội (22, 10 và 28) cho thấy các dòng nhị bội (2n) có lá dài hơn, có chỉ số lá (dài/rộng) lớn hơn các dạng tứ bội (4n), song mỗi dòng vô tính (hay cây cá thể) của 2n và 4n đều có dạng lá và chỉ số lá riêng. Mặt khác, nghiên cứu thực tế tại vườn ươm còn cho thấy một số cây có chỉ số đa bội cao hơn 170 lại có hình thái lá và các chỉ tiêu khác giống hệt như cây nhị bội, trong khi dòng 40 có chỉ số đa bội là 94,7 lại có biểu hiện của mộ cây tứ bội (4n) điển hình. Dòng số 5 có chỉ số đa bội là 95,5 (nhi bôi), trong khi kích thước tế bào khí khổng ở giai đoạn 1 năm tuổi lại là 13037 (tứ bội), hình thái lá và các chỉ tiêu khác cũng giống cây tứ bội điển hình. Vì thế, chỉ số đa bội là một chỉ tiêu quan trọng nhất, song không thể coi là duy nhất đúng để xác định mức độ đa bội của cây rừng. Việc so sánh hình thái để xác định mức bội thể sẽ rất chính xác nếu các dòng, hoặc giống có chung một nguồn di truyền ( có cùng một genom). Khi đó, hình thái lá là chỉ tiêu đơn giản và dễ nhận biết khi quan sát trên hiện trường. Những cây tứ bội nhân tạo thường có lá rộng bản, lá dày, xanh thẫm và mặt lá không phẳng nhẵn, còn những cây nhị bội điển hình có lá to, dài và đặc biệt là lá mỏng hơn cây tứ bội, phiến lá nhẵn phẳng (hình 1). Có thể nói với người có kinh nghiệm thì quan sát hình thái lá là phương pháp giản đơn nhanh chóng xác định cây tứ bội và cây nhị bội tại hiện trường. Đánh giá hình thái lá bằng chỉ số lá (I l = chiều dài/chiều rộng) cho thấy phần lớn những cây có chỉ số lá lớn hơn 2,6 là những cây nhị bội, cây có I l <2,0 thường là cây tứ bội. Tuy vậy, do hình thái lá là một tính trạng có tính biến dị lớn cá thể, thay đổi theo từng cá thể trong một quần thể, trong khi nguồn giống tạo cây tứ bội lại đa dạng, nên chỉ số này cũng không ổn định (bảng 1), rất khó xác định cây nào thuộc nhóm nào, thấm chí, có trường hợp I l = 3,0 lại có biểu hiện hình thái của cây tứ bội. Nên chỉ số lá chỉ là một chỉ tiêu để xác định nhanh mức độ đa bội. Xác đinh mức độ đa bội bằng kích thước tế bào khí khổng ở giai đoạn vườn ươm (bảng 1) cho thấy theo kích thước tế bào khí khổng có thể chia các cây này thành 5 thành hai nhóm. Những dòng vô tính có chỉ số đa bội lớn hơn 170, có kích thước tế bào khí khổng lớn hơn 13.000 là những dòng tứ bội (4n) như các dòng số 22, 28, 61, v.v. Những dòng có kích thước tế bào khí khổng nhỏ hơn 10.000, có chỉ số đa bội nhỏ hơn 100 và có hình thái lá đặc trưng cho cây nhị nhị bội là dòng nhị bội như các dòng 27, 64. Tuy vậy, một số dòng vô tính khác lại không có sự thống nhất giữa chỉ số đa bội với kích thước tế bào khí khổng. Kết quả đo diện tích khí khổng ở dòng 14 cho thấy dòng này có thể là dòng 2n. Dòng 14 có 2 chỉ số đa bội như đã phân tích ở trên có thể là do khi đo mức bội thể trong quần thể tế bào có một số tế bào ở giai đoạn G2, 2n =4C tương đương hàm lượng DNA của tế bào cây tứ bội. Đặc biệt dòng 14 đã được xác định là nhị bội bằng đếm số lượng nhiễm sắc thể. Dòng số 40 có chỉ số đa bội đo bằng Flow Cytometry là 94,7 (nhi bôi), trong lúc kích thước tế bào khí khổng lại là 15.339 (tứ bội), đến giai đọan 4 tuổi vẫn thể hiện là dòng có hính thái lá và kích thước hạt phấn của tứ bội điển hình (bảng 2). Mức bội thể của dòng 40, theo chúng tôi, cần xác định lại. Bảng 1. Chỉ số đa bội, chỉ số lá và diện ích tế bào khí khổng của một số dòng Keo tai tƣợng xử lý colchisine ở giai đoạn vƣờn ƣơm (2002-2003) Dòng Đếm số lượng nhiễm sắc thể Chỉ số đa bội (1) Chỉ số lá I l (1) Diện tích khí khổng (tính theo vạch) Đặc điểm lá (2) 5 95,5 - 13037 4n 6 172,4 1,64 13559 4n 7 164,4 2,10 10129 4n 10 2n = 52 191,9 1,87 17426 4n 14 177,2; 91,3 2,27 8691 2n? 22 181,1 2,00 14958 4n 23 183,9 - 8861 4n? 27 2n = 26 96,1 2,61 8626 2n 28 2n = 52 184,2 1,76 15194 4n 40 94,7 1,97 15339 4n? 43 167,6 2,72 10408 2n 44 176,2 2,01 8167 4n 45 172,3 2,17 9190 4n 58 189,2; 46,3 1,79 14809 4n? 60 181,7 1,73 15543 4n 61 180,9 2,26 8535 4n? 63 177,9 3,00 8227 4n? 64 2n = 26 68,7; 43,1 2,44 8782 2n 66 180,9 1,73 15858 4n Ghi chú (1). Xác định khi cây 1 tuổi, (2). Hình dạng, mầu sắc và độ dày lá Như vậy kích thước tế bào khí khổng có quan hệ khá chặt chẽ với mức độ đa bội được xác định bằng Flow Cytometry, hơn nữa kích thước tế bào khí khổng cũng là một chỉ tiêu rất dễ xác định và ít tốn kém. Sử dụng tổng hợp 2 phương pháp để xác định mức độ đa bội sẽ mang lại kết quả chính xác hơn khi chỉ dùng một phương pháp. 3.2. Xác định mức độ đa bội ở giai đoạn rừng trồng 5-6 năm tuổi Các chỉ tiêu quan trọng và chính xác để xác định mức độ đa bội ở giai đoạn cây trưởng thành là kích thước hạt phấn. Song ở những cây chưa có hoa thì kích thước 6 tế bào khí khổng là một chỉ tiêu chắc chắn để đánh giá mức độ đa bội của thực vật (Radzhably, 1962; Petrovskaia-Baranova, 1962; Zaikina, 1962; Lê Đình Khả, 1974; Lavinia el al, 2009. Bảng 2. Kích thƣớc tế bào khí khổng và khối phấn của một số dòng Keo tai tƣợng đã qua xử lý colchicine ở giai đoạn 5 tuổi tại Ba Vì và Bầu Bàng Dòng Chỉ số đa bội Diện tích khi khổng (1) Thể tích khối phấn (1) Đặc điểm lá (2) Ba Vì Bầu Bàng ĐC20 8228 30.730 2n ĐC113 9420 32.674 2n 14 177,2; 91,3 8.064 7.684 30.419 2n 27 96,1 9.150 8.718 - 2n 35 - 8.938 8.517 31.107 2n 43 167,6 10.097 7.883 31.806 2n 57 - 8.906 8.487 31.443 2n 63 177,9 8.797 8.382 34.117 2n 64 68,7; 43,1 7.824 7.455 26.329 2n 5 95,5 14.479 14.479 - 4n? 6 172,4 14.952 15.062 - 4n 7 164,4 14.456 14.563 - 4n 10 191,9 14.439 14.546 60.850 4n 22 181,1 14.756 14.865 - 4n 23 183,9 9.381 9.078 64.863 4n 28 184,2 14.853 14.963 - 4n 38 - - 9.690 62.753 4n 40 94,7 9.515 9.067 61.923 4n 44 176,2 8.947 14.716 63.122 4n 45 172,3 14.134 14.238 - 4n 58 189,2; 46,3 14.474 14.580 55.726 4n 60 181,7 15.301 14.350 65.804 4n 61 180,9 13.317 13.415 58.138 4n 66 180,9 15.300 15.413 - 4n Ghi chú. (1). Số liệu đo tính theo vạch dưới kính hiển vi và được quy đổi thống nhất theo một lần. Tế bào khí khổng được đo năm 2007, hạt phấn được đo năm 2007-2009 (2). Hình dạng, mầu sắc và độ dày lá Các nghiên cứu đã công bố đều cho thấy hạt phấn của cây tứ bội nhân tạo bao giờ cũng to hơn hạt phấn cây nhị bội ban đầu. Hạt phấn được coi là một trong những chỉ tiêu giải phẫu quan trọng và chính xác để đánh giá các dạng tứ bội ở thực vật. Vì thế, bên cạnh việc xác định số lượng thể nhiễm sắc, đo mức bội thể bằng Flow Cytometry, thì đo kích thước hạt phấn là một phương pháp chắc chắn để xác định các dạng tứ bội và dạng nhị bội. Xác định kích thước hạt phấn cây nông nghiệp ngắn ngày là một việc rất dễ, vì chúng ra hoa kết hạt chỉ một thời gian ngắn sau khi trồng, song cây rừng có đời sống dài ngày, nhanh nhất cũng phải sau 4-5 năm mới ra hoa và cũng chỉ một số dòng có hoa để xác định kích thước hạt phấn. Điểm đặc biệt ở chi Acacia là các tế bào hạt phấn dính lại với nhau tạo thành khối gồm 4 hạt, 8 hạt hoặc 16 hạt mà Sedley và cộng sự (1992) gọi là polyad. Đây là 7 thực chất là khối phấn (pollen lump, hoặc pollinium) đã được các nhà thực vật phát hiện từ những năm 1970 ở họ Mimosaceae (Atabecova, Ustinova, 1980). Vì thế, quan sát hạt phấn dưới kính hiển vi sẽ thấy hạt phấn tạo thành khối phấn (pollen lump) như hình 2. Hình 2. Khối phấn (trái) và tế bào khí khổng (phải) của Keo tai tượng tứ bội (4n) Tiếp tục xác đinh kích thước tế bào khí khổng ở giai đoạn này (hình 2) và kích thước khối phấn (hình 2) có kết hợp xem xét chỉ số đa bội được xác đinh ở giai đoạn vườn ươm đến giai đoạn 5-6 năm tuổi (bảng 2) cho thấy kích thước khí khổng ở giai đoạn sau lớn hơn ở giai vườn ườm. Số liệu ở bảng 2 cho thấy diện tích tương đối trung bình của bế bào khí khổng ở cây 2n là 8.480- 9.030, của cây 4n là 14.413 - 14.421, thể tích tương đối trung bình của khối phấn cây 4n giao động từ 55,726 đến 65,804 đơn vị, ở cây 2n là từ 30,730 đến 32,764 đơn vị (ở cây 4n gấp đôi ở cây 2n). Trong các dòng đã qua xử lý colchicine, đã xác định được một số dòng là tứ bội, một số dòng là nhị bội. Các dòng có mức độ đa bội được xác định chắc chắn là các dòng đã được đếm số lượng nhiễm sắc thể hoặc có sự thống nhất giữa chỉ số đa bội, kích thước tế bào khí khổng và kích thước khối phấn. Mức độ đa bội của một số dòng khác vẫn chưa thể khảng định chắc chắn được vì thiếu sự thống nhất giữa các chỉ số thể hiện mức bội thể. Những cây này nên được nghiên cứu thêm để xác định chính xác mức độ đa bội hay độ thuần nhất về mức độ đa bội (không bị khảm). Đó là một số dòng vô tính như 43, 63 có chỉ số đa bội ở giai đoạn vườn ươm tương ứng là 167,6 (chỉ số 4n) và 177,9 (4n), nhưng các chỉ tiêu còn lại thể hiện là cây 2n: diện tích tương đối của tế bào khí khổng tương ứng ở giai đoạn 5 năm tuổi là 10.097 và 8.769 ở Ba vì, 7.883 và 8.832 ở Bầu Bàng; thể tích tương đối của khối phấn tương ứng là 31.806 và 34.117. Ngược lại các dòng số 5 có chỉ số đa bội đo bằng Flow Cytometry là 95,5 (đặc trưng cho 2n) lại có kich thước khí khổng ở cả hai nơi khảo nghiệm là 14.479 và các chỉ tiêu hình thái khác đều là cây 4n điển hính (mặc dầu chưa có hoa). Dòng 40 là một hiện tượng đặc biệt, chỉ số đa bội (94,7) và kích thước tế bào khí khổng (9.515 và 7.669) cũng thể hiện là cây nhị bội, song kích thước hạt phấn (61.923) và đặc điểm của lá lại là của cây tứ bội. Do vậy, cần nghiên cứu xác minh lại mức bội thể của các dòng. Kích thước hạt phấn của cây đa bội lớn hơn của cây nhị bội cũng là kết quả nghiên cứu cho nhiều loài cây ở các họ thực vật Gramineae, Ranunculaceae và 8 Saxifragaceae (Sokovskaia, 1962). Các nghiên cứu khác ở chi Morus (Radzhably, 1962), chi Triticum (Petrovskaia-Baranova, 1962), cũng như các loài Panicum milliaceum (Zaikina, 1962), Fragaria vesca (Lê Đình Khả, 1974) và Vetiveria zinanioides (Lavinia el al, 2009) còn thấy rằng hạt phấn và tế bào khí khổng của cây tứ bội đều lớn hơn của cây nhị bội tương ứng. Có thể nói đến nay hầu hết các nghiên cứu đều thấy cây tứ bội (4n) có kích thước tế bào khí khổng và kích thước hạt phấn lớn hơn của cây nhị bội (2n) tương ứng. Điều thú vị là từ số liệu ở bảng 2 ở Bầu Bàng (nơi cây có hoa và hạt phấn) đã tính được hệ số tương quan giữa thể tích khối phấn với diện tích tế bào khí khổng là r = 0,64, Chứng tỏ kích thước khối phấn có tương quan khá cao với kích thước tế bào khí khổng. Như vậy, từ các số liệu ở bảng 1 và 2 có thể nhận định rằng quan sát đặc điểm lá (hình thái, mầu sắc và độ dày) là phương pháp đơn giản để đánh giá một cách định tính cây tứ bội và cây nhị bội ở Keo tai tượng. Kích thước khối phấn cũng là chỉ tiêu quan trọng thể hiện mức độ đa bội. Kích thước tế bào khí khổng là một chỉ tiêu quan trọng và dễ áp dụng khi đánh giá mức độ đa bội của cây rừng, đặc biệt là những cây chưa hoặc không có hoa. Chỉ số đa bội là một chỉ tiêu quan trọng song, trong một số trường hợp khi xem xét mức độ đa bội của Keo tai tượng nên xem xét các chỉ tiêu giải phẫu khác, đặc biệt là kích thước khối phấn, sau đó là kích thước tế bào khí khổng. 3.3. Sinh trưởng và sợi gỗ của cây tứ bội và cây nhị bội 3.3.1. Sinh trưởng của cây tứ bội và cây nhị bội Sinh trưởng là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá ý nghĩa của cây tứ bội nhân tạo. Cây khảo nghiệm bắt đầu trồng năm 2003 tại Ba Vì (Hà Nội), Đông Hà (Quảng Trị) và Bầu Bàng (Dình Dương). Số liệu đo đếm sau 4 năm tuổi (bảng 3) cho thấy tại các nơi khảo nghiệm cây tứ bội đều sinh trưởng kém hơn rõ rệt so với cây nhị bội (dòng 2n được tuyển chọn và 2n đã qua xử lý colchicine). Trong khi thể tích thân cây của cây 4n là 7,03 - 67,22 dm 3 /cây, thì của cây 2n tương ứng là 20,20 - 99,99 dm 3 /cây; còn của cây 2n được chọn của Việt Nam là 43 dm 3 /cây (ở Đông Hà) và 141,84 dm 3 /cây (ở Bầu Bàng). Chứng tỏ cây tứ bội nhân tạo sinh trưởng kém hơn rõ rệt so với cây nhị bôi cùng nguồn giống (2n qua xử lý colchicine), đặc biệt là kém hơn cây nhị bội được chọn lọc. Đó cũng là lý do tại sao cây tứ bội nhân tạo ít được sử dung trực tiếp trong sản xuất. Mặt khác, số liệu ở bảng 3 cũng cho thấy ở Bầu Bàng và Đông Hà, nơi có điều kiện đất đai và khí hậu thuận lợi, Keo tai tượng đã có sinh trưởng nhanh hơn rõ rệt so với cây cùng tuổi trồng ở Ba Vì. Bảng 3. Sinh trƣởng Keo tai tƣợng 2n và 4n tại Ba Vì, Đông Hà và Bầu Bàng (2003-2007) Công thức D 1.3 (cm) H (m) V (dm 3 /cây) X Sd V% X Sd V% X Sd V% Ba Vi (5.2003-5.2007) - 2n VN chọn 7,39 2,18 29,60 6,91 1,51 21,90 18,82 12,51 66,48 - 2n có xử lý 7,40 2,30 31,50 7,00 1,80 25,90 20,20 12,70 63,00 - 4n 4,93 1,43 28,91 4,60 1,26 27,43 7,03 4,79 68,20 Đông Hà (11.2003-5.2007) - 2n VN chọn 10.09 0.57 5.63 9.74 0.64 6.53 43.73 6.95 15.89 - 2n có xử lý 8.57 1.84 21.49 8.53 2.36 27.63 30.60 6.95 15.89 - 4n 8.65 1.14 13.19 8.12 1.28 15.81 27.55 8.87 32.18 9 Bầu Bàng (5.2003-5.2007) - 2n VN chọn 16,37 1,50 9,18 12,97 1,27 9,77 141,84 35,60 25,10 - 2n có xử lý 14,38 2,75 19,10 11,73 1,88 16,04 99,99 41,45 41,45 - 4n 11,74 2,03 17,23 11,18 1,26 11,30 67,22 27,50 40,91 Một số nghiên cứu cho thấy cây tứ bội thường có kích thước tế bào lớn hơn dạng nhị bội tương đồng, kích thước một số cơ quan cũng lớn hơn, trong một số trường hợp thậm chí hạt cũng to hơn, song sinh trưởng lại chậm hơn cây nhị bội 2n (Levan, 1939, Breslavets, 1963). 3.3.2.Chiều dài và đường kính sợi gỗ của cây tứ bội và cây nhị bội Nghiên cứu xác định chiều dài và đường kính sợi gỗ của Keo tai tượng tứ bội và nhị bội tương ứng (bảng 4) cho thấy sợi gỗ của Keo tai tượng tứ bội có chiều dài (666,5 - 695,5  m), và đường kính (16,91 - 19,52  m) lớn hơn sợi gỗ của Keo lai tượng nhị bội (tương ứng là 600,8 - 626,6  m và 13,8 - 15,96  m), trong đó sai khác vê đường kính là hết sức rõ rệt (U=3,18 - 18,21). Mặt khác, số liệu ở bảng 4 cũng cho thấy cây tứ bội (4n) có sợi gỗ ở thân dài hơn đáng kể so với sợi gỗ ở cành (U = 2,07 - 2,23), thì ở cây nhị bội (2n) sai khác này lại không đáng kể (U = 0,61 - 1,04). Như vậy Keo tai tượng tứ bội (4n) không những có kích thước tế bào khí khổng, kích thước hạt phấn lớn hơn mà kích thước sợi gỗ cũng lớn hơn của cây nhị bội (2n) tương ứng. Bảng 4. Chiều dài và đƣờng kinh sợi gỗ ở Keo tai tƣợng tứ bội và nhị bội tại Ba Vì (4 năm tuổi) Chỉ tiêu Tứ bội (4n) Nhị bội (2n) U (4n/2n) X (  m) Sd V% X (  m) Sd V% Mẫu ở thân - Chiều dài 644,5 38,2 5,9 626,6 78,3 12,5 0,01 - Đường kính 19,52 4,00 20,48 15,96 0,13 0,13 3,18 Mẫu ở cành - Chiều dài 695,4 81,1 11,7 600,8 34,5 5,7 0,16 - Đường kính 16,91 1,17 6,91 13,80 0,70 5,10 18,.21 Ghi chú. Cây 4n sai khác chiều dài sợi gỗ thân và cành U =2,23, đường kính sợi gỗ U =2,07. Cây 2n sai khác chiều dài sợi gỗ thân và cành U =0,61, đường kính sợi gỗ U =1,04. KẾT LUẬN Tạo cây tứ bội là bước đầu tiên để tạo giống tam bội sinh trưởng nhanh ở Keo tai tượng. Các dòng đã qua xử lý colchicine tại Australia đã được nhân bằng mô hom và được xác định mức bội thể bằng các phương pháp khác nhau như đếm số lượng nhiễm sắc thể ở tế bào đầu rễ, đo chỉ số đa bội bằng Flow Cytometry ( máy Partec Ploidy Analysser),diện tích tương đối trung bình của tế bào khí khổng và thể tích tương đối của khối phấn. Kết quả cho thấy chỉ số đa bội được xác định bằng Flow Cytomtry của cây 4n lớn hơn 180, của cây 2n là 75 - 95, diện tích tương đối trung bình của tế bào khí khổng ở cây 4n là 14.413 - 14.421 đơn vị , ở cây 2n là 8.480-9.030 đơn vị, thể tích tương đối của khối phấn của cây 4n là 61.647 đơn vị, của cây 2n là 31.078 đơn vị. Trong các dòng đã qua xử lý colchicine, đã được xác định là tứ bội tại Australia có một số dòng là tứ bội, một số dòng chỉ là nhị bội. Các dòng có mức bội thể được xác định chắc chắn là các dòng đã được đếm số lượng nhiễm sắc thể hoặc có sự thống 10 nhất giữa chỉ số đa bội, kích thước tế bào khí khổng và kích thước khối phấn.Mức độ bội thể của một số dòng khác vẫn chưa thể khảng định chắc chắn được vì thiếu sự thống nhất giữa các chỉ số thể hiện mức bội thể. Những cây này nên được nghiên cứu thêm để xác định chính xác mức bội thể hay độ thuần nhất về mức bội thể thuần (không bị khảm). Kết quả nghiên cứu cho thấy đối với cây lâm nghiệp để xác định chính xác cây 4n và cây 2n cần kết hợp các phương pháp và các chỉ tiêu hình thái khác nhau như kích thước tế bào khí khổng, kích thước khối phấn, chỉ số lá. Chiều dài sợi gỗ của cây 4n (644,5 - 695,4  m) sai khác không đáng kể so với cây 2n (600,8-626,6  m), trong khi đường kính sợi gỗ của cây 4n và 2n tương ứng là 1,17 - 4,00 và 0,70 - 0,17  m (sai khác rất rõ rệt). Ở giai đoạn 4 tuổi cây tứ bội (4n) nhân tạo có thể tích thân cây 7,03 - 67,22 dm 3 /cây, trong khi thể tích thân cây của 2n tương ứng là 20,20 - 99,99 dm 3 /cây, còn các dòng nhị bội được chọn lọc ở Việt Nam có thể đạt 43,73 - 141,83 dm 3 /cây ở lập địa thích hợp. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Atabecova A.I., Ustinova E.I. (1980). Cytologia rastenii (Tế bào học thực vật). Nhà xuất bản Коlos, Moskva, 326 trang (tiếng Nga). 2. Bolkhovskikh Z., V. Grif, T. Matvejeva, O. Zakharyeva (1969). Chromosome Numbers of Flowering Plants. Academy of Sciences of the USSR. 926 trang (tiếng Nga) 3. Breslavets L.P. (1963). Polylpoidy in nature and experiments. Science Academia USSR publish., Moscva, 362 trang (tiếng Nga) 4. Gill B.S. and V.K. Singhal (1998). Chromosome, Chromosomnal Technique and Chromosomnal Evolution in Trees. Forest Genetic and Tree Breeding. Ed. by A.K. Manpp 168-193. 5. Lavan A. (1939). Tetraploidy and octoploidy induced by colchicine in diploid Petunia. Hereditas. Vol 25, 109-131. 6. Lavania U.C., Surochita Basu and Seshu Lavania (2009). Towards bio-efficient and non-invasive vetiver: Lessons from genomic manipulation and chromosomal characterisation. http://vetiver.com/ICV.pdfs/EB02.pdf. 7. Le Dinh Kha (1974). Obtaintment and comparative studies on tetraploid and diploid forms of Fragaria vesca (tiếng Nga). PhD. Dissertation. 196 pp (tiếng Nga). 8. Matskevish N.V. (1962). The role of polyploidy in selection of forest trees. Plant Polyploidy. Science Academia USSR Publish., Moscva. trang 322-332 (tiếng Nga). 9. Nguyễn Hải Tuất (1982). Thống kê toán học trong nông nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 289 trang. 10. Petrovskaia-Baranova T.P. (1962). The correlations of pollen grains in the representatives of the Triticum genus polyploid series. In Plant Polyploidy. Science Acadamia of SSR. Moskva, pp. 111-112 (tiếng Nga) 11. Pauseva, 1981. Thực hành tế bào thực vật. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nôi, 350 trang (dịch từ tiếng Nga, người dịch Lê Đình Khả, Nguyễn Thị Thuận). [...]... International Research, Canberra, 11 pp 15 Sill B.S and V.K Singhal (1998) Chromosomes, Chromosomal Techniques and Chromosomal Evoluation in Trees Forest Genetics and Tree Breeding Edied by A.K Mandal and G.L Gibson CBS Publishers New Delhi pp 168193 16 Sokovskaia A.P (1962) On the problem of correlation between the chromosome number and the size of the pollen grain in wild plant species In Plant Polyploidy... OF ACACIA MANGIUM TETRAPLOIDS IN COMPARISON WITH DIPLOID CLONES IN VIETNAM Le Dinh Kha, R Griffin, Ha Huy Thinh, J Harbard, Le Son, Duong Thanh Hoa, Nghiem Quynh Chi Sciennce and Technology Journal of Agriculture & Rural Developmmet ISSN 08887209 2009, No 9 pp 114-120 Research on ploidy identification and characterization of Acacia manguium tetraploids in comparison with diploid clones introduced from... 08887209 2009, No 9 pp 114-120 Research on ploidy identification and characterization of Acacia manguium tetraploids in comparison with diploid clones introduced from Australia and selected diploids from Vietnam have been conducted in laboratory and field trials at Ba Vi (Ha Noi), Dong Ha (Quang Tri) and Bau Bang (Binh Duong) The specific characteristics of diploid and tetraploid clones as ploidy index, stomatal... cell’s relative area and relative pollen lump have been identified The most of in vitro propagated clones derived from colchicine treated Acacia manguium have been identified as tetraploids (4n), but some clones are diploid (2n) The ploidy identification by Flow Cytometry showed that the polyploid index of 4n forms is more than 180 while ploidy index of 2n is varied between 75 and 95 The stomatal cell’s... units The relative pollen lump volume of 4n is varied from 55,726 to 65,804 while of 2n is 30,730 to 32,764 units The clones with exactly identified ploidy levels are that ones that have identified chromosome numbers or possessed all characteristics 11 as ploidy index, stomatal cell’s relative area and relative pollen lump volume, specially characterized for each ploidy level as above - mentioned The stem . 1 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH VÀ SO SÁNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC DÒNG KEO TAI TUỢNG TỨ BỘI VÀ NHỊ BỘI Ở VIỆT NAM Lê Đình Khả 1 , R. Griffin 2 , Hà Huy. Trong các dòng đã qua xử lý colchicine đã xác định được một số dòng là tứ bội, một số dòng khác là nhị bội. Các dòng có mức độ đa bội được xác định chắc chắn là các dòng đã được đếm số lượng. vị (ở cây 4n gấp đôi ở cây 2n). Trong các dòng đã qua xử lý colchicine, đã xác định được một số dòng là tứ bội, một số dòng là nhị bội. Các dòng có mức độ đa bội được xác định chắc chắn là các