Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 24 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận (i) Một trăm hai mươi bốn chủng vi khuẩn được phân lập từ 150 mẫu nước thải trại chăn nuôi heo sau biogas ở ĐBSCL, đã định danh được 18 chủng vi khuẩn đông tụ, phần lớn (94,4%) thuộc chi Bacillus (i) Tuyển chọn được 04 cặp chủng vi khuẩn đông tụ có hiệu suất đông tụ cao từ 71,2 – 88,1%. [(Bacillus cereus KG05 + Bacillus megaterium VL01), (Bacillus cereus KG05 + Bacillus sp. VL05), (Bacillus cereus KG05 + Bacillus aryabhattai) và (Bacillus megaterium VL01 + Bacillus sp. VL05)] (i) Cơ chế của quá trình đông tụ là sự kết dính các tế bào vi khuẩn nhờ vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào, cùng với sự tương tác của các yếu tố trong môi trường thích hợp là pH = 7, cation hóa trị II (Mg 2+ ) ở nồng độ 20 mM, cation hóa trị I (K + ) nồng độ 30 mM. (i) Ứng dụng cặp chủng vi khuẩn đông tụ vào xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas, hiệu suất đông tụ đạt từ 82,6 – 90,4%; các thông số pH, BOD 5 , TSS, TP, PO 4 3- đạt được loại A hoặc loại B của quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về môi trường QCVN40:2011/BTNMT; hàm lượng TN, N-NH 4 + giảm hơn 50% so với nghiệm thức đối chứng. Ứng dụng các cặp chủng vi khuẩn đông tụ vào xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas, được xem là một công nghệ sinh học tiền xử lý nước thải, bước đầu có những đóng góp vào quy trình cải thiện chất lượng nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở đồng bằng sông Cửu Long. 5.2 Đề xuất Trên cơ sở kết quả nghiên cứu, đề xuất 4 chủng vi khuẩn đông tụ (B.cereus KG05, B.megaterium VL01, Bacillus sp. VL05 và B.aryabhattai được kiểm tra các chỉ tiêu an toàn với môi trường, sau đó được ứng dụng vào xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở nhiều nông trại hơn và quy mô lớn hơn tại các trại chăn nuôi heo ở khu vực ĐBSCL. Áp dụng biện pháp khử đạm phù hợp vào xử lý lượng nước sau xử lý bằng vi khuẩn đông tụ, để hàm lượng TN, N-NH 4 + đạt chuẩn cho phép xả thải của quy chuẩn QCVN40:2011/BTNMT. Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 1 CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Cùng với sự phát triển của ngành trồng trọt, ngành chăn nuôi đặc biệt là chăn nuôi heo quy mô gia đình phát triển mạnh mẽ ở đồng bằng sông Cửu Long. Điều này đã dẫn đến sự ô nhiễm môi trường, do hệ thống thu nhận và xử lý chất thải, nhất là nước thải chưa được quan tâm đúng mức. Mặc dù đã có hệ thống tự hoại (biogas), nhưng nước thải sau biogas vẫn còn chứa nhiều độc chất cần được xử lý triệt để trước khi xả thải ra sông rạch. Có nhiều biện pháp được đề xuất xử lý nước thải này, trong đó có biện pháp sinh học là sử dụng vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học và vi khuẩn đông tụ, để gom những vật chất lơ lửng trong nước thải rồi lắng xuống đáy cùng với các nhóm vi sinh vật. Vì vậy, để áp dụng hiệu quả phương pháp sinh học, điều kiện tiên quyết là phải có một quần thể vi sinh vật phù hợp, để xử lý chất ô nhiễm trong nước. Chính vì thế, để có được nền sản xuất nông nghiệp bền vững nhất là ngành chăn nuôi heo thân thiện với môi trường thì đề tài “Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn đông tụ để xử lý nước thải chăn nuôi heo ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện nhằm góp phần ứng dụng công nghệ sinh học vào thực tiễn cuộc sống và đóng góp thiết thực trong việc xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn, định danh, phân tích mối tương quan trình tự 16S rRNA và ứng dụng chủng vi khuẩn đông tụ bản địa vào xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở đồng bằng sông Cửu Long, trong điều kiện phòng thí nghiệm và tại trại chăn nuôi heo, nhằm góp phần giảm các thông số: pH, tổng chất rắn lơ lửng, nhu cầu ôxy hóa sinh học, đạm, lân trong nước thải sau xử lý so với nước thải đầu vào và quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về môi trường (QCVN 40:2011/BTNMT). 1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án (i) Tuyển chọn, định danh và xây dựng được mối quan hệ trình tự 16S rRNA của 18 chủng vi khuẩn có khả năng tạo sự đông tụ trong nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở ĐBSCL, bằng phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử. Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 2 (ii) Tuyển chọn được 04 cặp chủng vi khuẩn đông tụ (Bacillus cereus KG05 + Bacillus megaterium VL01; Bacillus cereus KG05 + Bacillus sp. VL05; Bacillus cereus KG05 + Bacillus aryabhattai ST02 và Bacillus megaterium VL01 + Bacillus sp. VL05) đạt hiệu suất đông tụ cao trong quá trình xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas. (iii) Xác định được cơ chế tạo sự đông tụ là sự kết dính các tế bào vi khuẩn với nhau, nhờ vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào, cùng với sự tương tác của các yếu tố trong môi trường thích hợp là pH = 7, cation hóa trị II (Mg 2+ ) ở nồng độ 20 mM, cation hóa trị I (K + ) nồng độ 30 mM. Qua đó, các hạt lơ lửng trong môi trường được các tế bào vi khuẩn liên kết và gom tụ lại tạo thành khối rồi lắng xuống đáy cùng với tế bào vi khuẩn. (iv) Xây dựng được một quy trình xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas, bằng phương pháp sinh học có bổ sung vi khuẩn đông tụ. Kết quả cho hiệu suất đông tụ từ 80 – 90.4%, các thông số pH, tổng chất rắn lơ lửng, nhu cầu ôxy hóa sinh học, tổng lân và orthophosphate trong nước thải sau xử lý, đạt được loại A hoặc B QCVN 40:2011/BTNMT; hàm lượng ammonium và tổng đạm giảm hơn 50% so với nước thải ban đầu. (v) Đóng góp tư liệu giảng dạy, tham khảo và nghiên cứu về vi sinh vật môi trường trong xử lý nước thải bằng biện pháp sinh học. CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Phương pháp sinh học trong xử lý nước thải Phương pháp sinh học trong xử lý nước thải là sử dụng khả năng sống và hoạt động của vi sinh vật, để khoáng hóa các chất bẩn hữu cơ trong nước thải, thành các chất vô cơ, các chất khí đơn giản và nước. Quá trình sinh học xử lý nước thải vừa phân hủy, vừa oxy hóa các cơ chất, đồng thời đồng hóa các chất hữu cơ và NH 4 + , PO 4 3- để sinh trưởng. Sinh khối vi sinh vật tăng, sản sinh ra các enzym thủy phân và oxy hóa khử làm tăng hoạt tính của cộng đồng vi sinh vật, nhằm khử các chất bẩn hữu cơ (BOD hoặc COD), nitrat hóa, khử nitrat, khử phosphor và ổn định chất thải nhờ quá trình chuyển hóa hợp chất hữu cơ thành pha khí, vỏ của tế bào vi sinh vật tạo ra các bông bùn cặn sinh học rồi loại các bông bùn này ra khỏi nước thải. Quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học xuất phát từ các quá trình xảy ra trong tự nhiên thường gặp hai kiểu sinh trưởng: Sinh trưởng lơ lửng đồng nghĩa với bùn hoạt tính; Sinh trưởng dính bám đồng Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 23 Từ kết quả phân tích chất lượng nước sau xử lý cho thấy, hiệu quả hoạt động của cặp chủng vi khuẩn B. cereus KG05 + B. megaterium VL01 trong xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas quy mô 80lít ở cuối chu kỳ 2 hàm lượng TN, N-NH 4 + , PO 4 3- , BOD 5, TSS giảm lần lượt là 73,26%; 62,6% ; 87,1%; 71%; 84,2%. Trong đó hàm lượng TSS và PO 4 3- đạt quy chuẩn loại A và TP đạt quy chuẩn loại B. Đối với quy mô 800 lít các thông số BOD 5 , TN, TSS, TP, N-NH 4 + , PO 4 3- đều giảm lần lượt là 76,6%, 84,8%, 92,4%, 86,5%, 33,4%, 54,3% ở chu kỳ 2 so với đối chứng, trong đó hàm lượng TSS, TP và PO 4 3- đạt được quy chuẩn loại A ở chu kỳ 2. Tất cả các thông số đều giảm ở chu kỳ 1 và chu kỳ 2 vì đây là thời gian hoạt động tối ưu của vi khuẩn đông tụ. Từ kết quả trên có thể nhận định rằng vi khuẩn đông tụ trong xử lý nước thải sẽ làm giảm hàm lượng TSS, TP và PO 4 3- đạt loại A hoặc của QCVN 40:2011/BTNMT, còn các thông số khác vi khuẩn đông tụ có vai trò góp phần làm giảm hơn 50% hàm lượng chất nhiễm bẩn trong môi trường nước thải chăn nuôi heo sau biogas qua hai chu kỳ xử lý. Từ đó đề xuất quy trình xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas bằng vi khuẩn đông tụ qua 2 chu kỳ xử lý như sau: Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Hình 4.11: Quy trình xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas bằng vi khuẩn đông tụ Bổ sung 0.05% cặp chủng vi khuẩn đông tụ và 0.05% PAC, sục khí 6 giờ Để yên (lắng) 18 giờ Lấy ra 50% lượng nước trong ở phần trên bình Thêm 50% lượng nước thải m ới v ào bình, s ục khí 1 giờ Để yên (lắng) 6 giờ Lấy ra 50% lượng nước trong ở phần tr ên bình Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 22 Tương tự như thí nghiệm trên, cặp vi khuẩn B. cereus KG05 + B. megaterium VL01 được chọn đại diện để ứng dụng vào xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas với quy mô 80, 800 lít tại trại chăn nuôi. Kết quả cho thấy hiệu suất đông tụ được ghi nhận ở Hình 4.10. Hình 4.10: Hiệu suất đông tụ cặp chủng vi khuẩn Bacillus cereus KG05 + Bacillus megaterium VL01 quy mô 80 lít – (A) chu kỳ 1; (B) chu kỳ 2 Ghi chú: NT1: đối chứng; NT2: 500 µl/l cặp chủng KG05+VL01; NT3:PAC 0.05 %; NT4: kết hợp PAC 0.05 % và 500 µl/l cặp chủng KG05+VL01 Từ kết phân tích cho thấy hiệu quả hoạt động của cặp vi khuẩn đông tụ B. cereus KG05 + B. megaterium VL01 tương đương 50%, nếu như trong môi trường được bổ sung một lượng rất nhỏ (0,05% PAC) chất trợ lắng thì hiệu suất sẽ tăng lên đáng kể (90,4%) và góp phần giải quyết lượng lớn chất ô nhiễm trong nước thải. Từ kết quả ứng dụng cặp vi khuẩn đông tụ B. cereus KG05 + B. megaterium VL01 vào xử lý nước thải chăn nuôi heo với quy mô 800 lít. Kết quả cho thấy hiệu suất đông tụ của NT2 (có bổ sung vi khuẩn) cao nhất vẫn ở chu kỳ 2 (82,6%) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng, thời gian hoạt động là 31 giờ, đến chu kỳ 3 hiệu suất bắt đầu giảm xuống chỉ còn 44,2% (Hình 4.11). 65,3 82,6 44,2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Hiệu suất đông tụ (% ) CKI CKII CKIII Hình 4.11: Hiệu suất đông tụ cặp chủng vi khuẩn B. cereus KG05 + B. megaterium VL01 trong xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas quy mô 800 lít Ghi chú: CKI: chu kỳ 1; : CKI: chu kỳ 2 : CKIII: chu kỳ 3 B A ±1.7 ±1.0 ±2.2 ±1.5 ±0.8 ±5.3 ±2.6 ±1.2 A B ± 1,0 ±3 ,9 ±2,3 Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 3 nghĩa với màng sinh học. Nhờ các biện pháp nhân tạo hoạt tính của vi sinh vật được tăng cường thì hiệu quả làm sạch chất bẩn không ngừng được tăng lên (Nguyễn Đức Lượng, 2002). 2.2 Chất kết tụ sinh học và vi khuẩn kết tụ sinh học trong các hệ thống sinh học xử lý nước thải Chất kết tụ sinh học do vi khuẩn sản xuất ra từ hợp chất ngoại bào polysaccharid hoặc proein hay một thành phần khác trong tế bào vi khuẩn, chúng có khả năng kết dính các vật chất lơ lửng trong môi trường nước thành khối lớn hơn rồi lắng xuống. Tuy nhiên, vi khuẩn kết tụ sinh học vẫn chưa giải quyết triệt để các thành phần chất thải trong môi trường nước, đặc biệt là những thành phần có kích thước cực nhỏ lơ lửng, khó trong môi trường (Cao Ngọc Điệp và ctv, 2010). Theo Malik và Kakii (2003); Kimchhayarasy et al. (2009) trong bùn hoạt tính có nguồn gốc từ nước thải còn hiện diện phần lớn vi khuẩn có khả năng thực hiện gom tụ các vật chất lơ lửng trong môi trường nước, đặc biệt là những vật chất lơ lửng có kích thước cực nhỏ, khó lắng, các vật chất này vẫn được kết dính lại rồi lắng xuống tương tự như vi khuẩn kết tụ sinh học, nhưng cơ chế gom tụ của các chủng vi khuẩn này khác với vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học. 2.3 Vi khuẩn đông tụ trong các hệ thống sinh học xử lý nước thải Theo Chen, (2007) đông tụ là sự kết dính giữa các tế bào vi khuẩn với nhau (cell to cell) và dính với các hạt vô cơ, hữu cơ, các màu, vi khuẩn khác lơ lửng trong môi trường. Các vật chất lơ lửng được tế bào vi khuẩn đông tụ kết dính, bên ngoài là khối nhầy gồm nhiều tế bào vi khuẩn, bên trong là các vật chất lơ lửng. Các hạt lơ lửng cũng là nguồn dinh dưỡng giúp cho vi khuẩn phát triển và tăng sinh khối, cuối cùng khối nhầy lớn dần và lắng xuống đáy, nước được làm sạch. Cơ chế quá trình đông tụ chủ yếu phụ thuộc vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào tạo các liên kết giữa các tế bào vi khuẩn với nhau. Vi khuẩn đồng đông tụ được phân lập từ màng sinh học trong bùn hoạt tính, cơ chế hoạt động nhờ các phân tử trên bề mặt của các tế bào vi khuẩn kết dính hỗn hợp với nhau, được hình thành màng sinh học (Kolenbrander, 1988). Quá trình hình thành màng sinh học bằng cơ chế đông tụ của vi khuẩn là sự phát triển, tích luỹ sinh khối vi khuẩn, thông qua sự kết hợp của các tế bào vi khuẩn với nhau, cùng với sự kết dính của các vật chất lơ lửng trong môi trường nhờ vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn (Kolenbrander et al., 1985). Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 4 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nguyên liệu Một trăm năm mươi mẫu nước thải chăn nuôi heo sau biogas (nước thải lẫn chất thải rắn) được thu tại 150 hầm hoặc ao chứa nước thải từ sau hệ thống biogas ở trại chăn nuôi heo của 52 huyện/thị thuộc 13 tỉnh/thành phố khu vực đồng bằng sông Cửu Long (Bảng 3.1). Bảng 3.1: Thông số ban đầu mẫu nước thải chăn nuôi heo sau biogas STT Đ ịa điểm thu mẫu (tỉnh/ TP ) TS m ẫu Ký hi ệu pH 1 An Giang 11 AG01  AG11 6 , 5 – 8 , 3 2 B ạc Li êu 06 BL01  BL06 6 , 0 – 7 , 6 3 B ến Tre 14 BT01  BT14 6 , 1 – 7 , 8 4 C à Mau 14 CM01  CM14 6 , 5 – 7 , 4 5 C ần Th ơ 11 CT01  CT11 6 , 1 – 7,2 6 Đ ồng Tháp 7 DT01  DT07 6 , 2 – 7 , 1 7 H ậu Giang 11 HG01  HG11 6 , 8 – 8 , 0 8 K iê n Giang 21 KG01  KG21 6 , 5 – 8 , 7 9 Long An 06 LA01  LA06 6 , 4 – 7 , 1 10 S ó c Trăng 14 ST01  ST14 6 , 6 – 8 , 0 11 Ti ề n Giang 20 TG01  TG20 6 , 2 – 7 , 3 12 Tr à Vinh 07 TV01  TV07 6 , 6 – 7 , 6 13 V ĩ nh Long 08 VL01  VL08 6 , 0 – 8 , 5 Total 150 Hai trăm hai mươi tám lít nước thải ứng dụng tại phòng thí nghiệm và 3.840 lít nước thải ứng dụng tại trại chăn nuôi 2000 con heo thịt của chủ trại Lê Hoàng Minh, ấp Đông Hưng 2 - Đông Thành - Bình Minh - Vĩnh Long. 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phân lập, quan sát hình thái và sinh hóa Môi trường Polypepton phân lập vi khuẩn đông tụ (Kimchhayarasy et al., 2009) Polypepton: 10 g; (NH 4 ) 2 SO 4 : 1 g; NaNO 3 : 0.5 g; NaCl: 0.1 g; MgSO 4 .7H 2 O: 0.2 g; CaCl 2 .2H 2 O: 0.05 g; FeCl 3 .6H 2 O: 0.01 g; K 2 HPO 4 :1 g; nước: 1 lít; pH: 7. Quy trình phân lập, quan sát hình thái, đo kích thước vi khuẩn, quan sát khuẩn lạc và trữ mẫu thuần, nhuộm gram, bào tử, thực hiện theo quy trình của; Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, (2000); Nguyễn Đức Lượng và ctv., (2006); Trần Linh Thước, (2007). Kiểm tra khả năng sinh catalase của vi khuẩn theo quy trình của Andretta et al. (2004). Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 21 giảm đáng kể hàm lượng BOD 5 , TSS, mà còn có khả năng xử lý phần lớn (>70%) đạm và lân trong nước thải, qua đó nước thải sau chu kỳ xử lý các thông số BOD 5 , TSS, TP, PO 4 3- đạt được tiêu chuẩn loại A hoặc loại B của QCVN40:2011/BTNMT, hiệu quả nhất ở cuối chu kỳ 2, tổng thời gian vận hành của 2 chu kỳ là 31 giờ đã xử lý được lượng nước thải bằng với tổng thể tích của một chu kỳ xử lý. Đối với hàm lượng đạm tổng, ammomnium cuối chu kỳ 1 và chu kỳ 2 vẫn giảm nhưng không đạt được tiêu chuẩn cho phép xả thải của Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về môi trường. Bảng 4.5: Thông số nước thải chăn nuôi heo sau biogas, qua xử lý quy mô 08 lít Sau xử lý Tên mẫu pH BOD 5 mg/l TN mg/l TSS mg/l TP mg/l NH 4 + mg/l PO 4 3 - mg/l QCVN40:2011/BTNMT lo ại A 6 - 9 30 20 50 4 5 6 QCVN40:2011/BTNMT lo ại B 5,5 - 9 50 40 100 6 10 10 Chu kỳ 1 NT1: ĐC 8 . 2 3861 527 9 63 29 . 0 1 1 29 13 . 8 NT2: PAC (0,05%) 7 . 6 1 634 305 545 9. 46 990 4 . 65 NT3: PAC+VK KG05+VL05 7 . 6 59 . 4 197 4 2 . 6 4. 97 525 0 . 99 NT4: PAC+VK KG05+VL01 7 . 5 26. 7 177 2 3. 8 2. 13 4 85 0 . 69 NT5: PAC+VK KG05+ST02 7. 5 57 . 4 183 4 4. 6 9. 56 4 85 1 . 09 NT6: PAC+VK VL01 +VL05 7. 5 28. 7 177 3 1. 7 1 . 8 9 5 05 1 . 09 Chu kỳ 2 NT2: PAC (0,05%) 7 . 8 24 3 301 1 49 10, 8 9 7 72 5. 84 NT3: PAC+VK KG05+VL05 7 . 8 8 3 . 2 146 3 5. 6 3. 6 4 3 76 0. 69 NT4: PAC+VK KG05+VL01 7. 9 65 . 3 168 31. 7 4. 1 2 297 0. 8 9 NT5: PAC+VK KG05+ST02 7. 9 7 5 . 2 134 2 67 4. 19 3 07 0. 4 0 NT6: PAC+VK VL01+VL05 7. 8 69 . 3 166 2 7. 7 4. 05 2 87 0. 69 Chu kỳ 3 NT2: PAC (0,05%) 7. 8 213 189 239 5 . 80 7 62 10 . 0 NT3: PAC+VK KG05+VL05 7. 7 188 161 200 3 . 67 4 06 5 . 35 NT4: PAC+VK KG05+VL01 7. 7 139 199 52 . 5 4 . 17 4 36 5 . 0 5 NT5: PAC+VK KG05+ST02 7. 8 168 185 153 4 . 68 396 4 . 65 NT6: PAC+VK VL01+VL05 7. 8 163 171 259 4 . 10 4 36 5 . 54 Phân tích mẫu tại: Trung tâm kỹ thuật và ứng dụng công nghệ Cần Thơ Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 20 4.5 Ứng dụng vi khuẩn vào xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas Kết quả ứng dụng cặp vi khuẩn đông tụ (B. cereus KG05 + B. megaterium VL01), (B. cereus KG05 + Bacillus sp. VL05), (B. cereus KG05 + B. aryabhattai ST02) và (B. megaterium VL01 + Bacillus sp. VL05) qua 3 chu kỳ xử lý cho thấy, hiệu suất đông tụ trong 3 chu kỳ xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở các nghiệm thức 2, 3, 4, 5, 6 đạt từ 84 – 86% cao hơn nghiệm thức 1 (ĐC) và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1%. Cuối chu kỳ 1, nghiệm thức đối chứng chỉ đạt hiệu suất 9%, NT2 đạt 33% còn NT3, NT4, NT5, NT6 hiệu suất đạt từ 80 – 83% và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với NT1 và NT2. Đến cuối chu kỳ 2 hiệu suất đông tụ ở tất cả nghiệm thức đều tăng và cao nhất ở thời gian lắng tụ 6 giờ. Trong đó NT2 đạt được 37%, còn NT3, NT4, NT5, NT6 hiệu suất đông tụ đạt từ 84 – 86%. Đến cuối chu kỳ 3 thì hiệu suất đông tụ ở 4 nghiệm thức có chủng vi khuẩn đông tụ đều giảm xuống còn từ 74 – 77% thấp hơn so với chu kỳ 1 và chu kỳ 2, trong khi NT2 vẫn tăng lên nhưng không đáng kể đạt 42% (Hình 4.9). Hình 4.9: Hiệu suất đông tụ của vi khuẩn xử lý nước thải quy mô 08 lít * Ghi chú: NT1: đối chứng, NT2: PAC, NT3: PAC+VK KG05+VL05 , NT4: PAC+VK KG05+VL01 , NT5: PAC+VK KG05+ST02 , NT6: PAC+VK VL01+VL05 Chu kỳ I: Thời gian từ 0 – 18 giờ; Chu kỳ II, III: Thời gian từ 0 – 6 giờ Kết quả Hình 4.9 cho thấy quá trình xử lý nước thải đạt hiệu suất đông tụ từ 80 − 86% của các nghiệm thức có chủng vi khuẩn đông tụ, hiệu quả nhất ở cuối chu kỳ 1 và chu kỳ 2, từ đó tạo điều kiện cho các thông số BOD 5 , TN, TSS, TP, N-NH 4 + , PO 4 3- trong các nghiệm thức giảm nhiều so với NT1, NT2 và so với QCVN40:2011/BTNMT (Bảng 4.5). Vậy, vi khuẩn đông tụ trong xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas không những làm 8,8±2,1 36,7±1,2 Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 5 3.2.2 Tuyển chọn vi khuẩn đông tụ bằng phương pháp sinh hóa a. Mục tiêu: chọn được những chủng vi khuẩn có bề mặt tế bào kỵ nước cao thông qua hiệu suất hấp thụ của p-xylen với vi khuẩn. b. Bố trí thí nghiệm: các chủng vi khuẩn phân lập thuần ở thí nghiệm trước (124 chủng) được thực hiện theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm 124 x 3 = 372. c. Thực hiện: kiểm tra sinh hóa 124 chủng vi khuẩn đông tụ với dung môi p-xylen. Tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn đông tụ được xác định dựa trên hiệu suất hấp thụ của p-xylen với tế bào vi khuẩn theo phương pháp của Rosenberg et al. (1980). Tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn được tính thông qua chỉ số OD 660 bằng công thức tính hiệu suất đông tụ: HS (%) = 100 0 0   OD ODOD m (Kimchhayarasy et al., 2009) * Ghi chú: HS: Hiệu suất đông tụ (%); OD 0 : OD dịch huyền phù vi khuẩn không có p-xylen; OD m : OD dịch huyền phù vi khuẩn có thêm p-xylen. 3.2.3 Xác định hiệu suất đông tụ từ cơ chế tự đông tụ của vi khuẩn a. Mục tiêu: chọn được những chủng vi khuẩn có khả năng tự đông tụ (không dùng dung môi p-xylen) cho hiệu suất cao (>50%), và thời gian tạo sự đông tụ phù hợp nhất. b. Bố trí thí nghiệm: các chủng vi khuẩn có hiệu suất cao với dung môi p-xylen được tuyển chọn (32 chủng) thực hiện theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm 32 x 3 = 96. c. Thực hiện: theo phương pháp của Kimchhayarasy et al. (2009). 3.2.4 Xác định hiệu suất đông tụ từ cơ chế đông tụ của từng cặp vi khuẩn a. Mục tiêu: chọn được ít nhất 04 cặp chủng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao (>70%) và xác định được thời gian phù hợp để cặp chủng vi khuẩn hoạt động cho hiệu suất đông tụ cao nhất. b. Bố trí thí nghiệm: chọn 08 chủng vi khuẩn có hiệu suất tự đông tụ cao được bố trí theo cặp đối đầu xoay vòng. 28 cặp vi khuẩn được thực hiện theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm 28 x 3 = 84. c. Thực hiện: theo phương pháp của Kimchhayarasy et al. (2009). Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 6 3.2.5 Khảo sát các yếu tố trong môi trường (pH, cation Ca 2+ , Mg 2+ , Na + , K + ) ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ của vi khuẩn a. Mục đích: xác định giá trị pH, loại cation và nồng độ cation trong môi trường thích hợp để vi khuẩn đông tụ hoạt động cho hiệu suất cao nhất. b. Bố trí thí nghiệm: theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 04 cặp chủng vi khuẩn được chọn ở thí nghiệm trên. Nhân tố pH (ở các mức 3.0; 4.0; 5.0; 6.0; 7.0; 8.0 9.0); cation Ca 2+ , Mg 2+ , Na + , K + ) 3 lần lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm: (4 x 7 x 3) + (4 x 4 x 7 x 3) = 1428 c. Thực hiện: theo phương pháp của Kimchhayarasy et al. (2009). 3.2.6 Phối hợp cặp cation (hóa trị 1 + hóa trị 2) phù hợp có trong môi trường để vi khuẩn hoạt động cho hiệu suất đông tụ cao nhất a. Mục đích: chọn được cặp cation (hóa trị 1 + hóa trị 2) phù hợp nhất để vi khuẩn đông tụ hoạt động với hiệu suất cao nhất. b. Bố trí thí nghiệm: theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 04 cặp chủng vi khuẩn riêng biệt, 04 cặp cation ở mức nồng độ phù hợp nhất ở thí nghiệm 3.4.5, thực hiện 3 lần lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm: 4 x 4 x 3 = 48 c. Thực hiện: theo phương pháp của Kimchhayarasy et al. (2009). 3.2.7 Xác định yếu tố tương quan pH và cặp cation trong môi trường có giá trị phù hợp để vi khuẩn hoạt động cho hiệu suất đông tụ tốt nhất a. Mục đích: Xác định tính tương quan giá trị pH và nồng độ cation hóa trị 1 và hóa trị 2 trong môi trường phù hợp nhất để vi khuẩn động tụ hoạt động cho hiệu suất cao nhất. b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 04 cặp chủng vi khuẩn riêng biệt được khảo sát với 2 nhân tố [pH, cặp cation (Mg 2+ +K + )], với 3 lần lặp lại. + Nhân tố 1: pH môi trường thực hiện ở các giá trị 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0 + Nhân tố 2: Cặp cation được chọn ở thí nghiệm 3.2.5 (A 1 +A 2 ) với các mức nồng độ của từng loại cation hóa trị 2 là:10 mM, 20 mM, 30 mM; cation hóa trị 1 là: 20 mM, 30 mM, 40 mM được xác định ở thí nghiệm 3.2.6 Tổng số đơn vị thí nghiệm là: 4 x 9 x 5 x 3 = 540 c. Thực hiện: Chuẩn bị dịch vi khuẩn theo phương pháp (Kimchhayarasy et al., 2009), giai đoạn thu sinh khối, rửa và hòa tan trong dung dịch muối của cặp cation (A 1 + A 2 ) (tỷ lệ 1:1) với các nồng độ được Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 19 4.3. Tương quan nồng độ cation Mg 2+ , K + và chỉ số pH trong môi trường đến hiệu suất đông tụ của vi khuẩn Từ kết quả thống kê cho thấy tại giá trị pH = 7 và cặp cation trong hỗn hợp muối KCl.30 + MgCl 2 .20 của 4 cặp vi khuẩn đều cho hiệu suất đông tụ cao nhất đạt từ 68,3 – 73,2% và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với các mức còn lại. Do trong môi trường sống, các vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau cùng tác động, nên hiệu suất đông tụ của các cặp chủng vi khuẩn không chỉ đơn thuần dựa vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào hay chỉ dựa vào đặc tính liên kết của các thành phần ngoại bào, mà còn có các yếu tố môi trường ngoài tương tác nhau, tác động đến sự kết dính của các tế bào vi khuẩn. Như vậy, tùy vào đặc điểm của từng cặp vi khuẩn, sự tương tác của các yếu tố trong môi trường có pH=7 và nồng độ cation hóa trị 1 (K + ) là 30 mM và cation hóa trị 2 (Mg 2+ ) là 20 mM là phù hợp cho vi khuẩn hoạt động có hiệu suất cao nhất. Với quả này rất phù hợp với nồng độ cation và pH trong nước thải chăn nuôi heo sau biogas (Bảng 4.4). Do vậy khi thực hiện ứng dụng vi khuẩn đông tụ vào xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas không cần phải can thiệp pH và nồng độ cation trong môi trường. Bảng 4.4: Hàm lượng cation trong nước thải chăn nuôi heo sau biogas STT Cation Hàm lư ợng (mM/lít) 1 Ca 2+ 1 . 45 2 Mg 2+ 14 . 99 3 K + 26 . 41 4 Na + 0 . 88 Ghi chú: Thu mẫu ở hầm chứa nước thải chăn nuôi heo sau biogas, tại trại chăn nuôi heo Lê Hoàng Minh, ấp Đông Hưng 2 - Đông Thành - Bình Minh - Vĩnh Long; ngày: 20/02/2014); Phân tích tại: Trung tâm kỹ thuật và ứng dụng công nghệ Cần Thơ 4.4 Ảnh hưởng của liều lượng vi khuẩn được bổ sung vào môi trường xử lý nước thải đến hiệu suất đông tụ Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu suất đông tụ của 4 cặp vi khuẩn (B. cereus KG05 + B. megaterium VL01), (B. cereus KG05 + Bacillus sp. VL05), (B. cereus KG05 + B. aryabhattai ST02) và (B. megaterium VL01 + Bacillus sp. VL05) ở các nghiệm thức có liều lượng 0,05% cho hiệu suất cao nhất khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 1% với các liều lượng 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 và 2 nghiệm thức đối chứng; khác biệt không có ý nghĩa với các liều lượng 0,06; 0,07; 0,08; 0,09 và 0,1, khi mật độ vi khuẩn >= 10 9 cfu/ml cho hiệu suất đông tụ đạt cao nhất (86,6%). Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 18 thời cần có thời gian để chúng tăng sinh khối, khi mật độ vi khuẩn cực đại thì sự tương tác, gần gũi các tế bào với nhau diễn ra càng mạnh mẽ, khi đó các tế bào có tính kỵ nước cao bao gồm cả tế bào có cùng hoặc khác nhau về đặc tính di truyền đều kết dính với nhau để hình thành các liên kết tế bào qua đó các vật chất lơ lửng trong môi trường được gom lại tạo thành khối cùng với tế bào vi khuẩn và lắng xuống đáy. Hình 4.7: Hiệu suất đông tụ (%) của 4 cặp chủng vi khuẩn đông tụ Như vậy, các tế bào vi khuẩn làm cầu nối cho vật chất vô cơ, hữu cơ lơ lửng trong nước kết dính lại, các chất hữu cơ lơ lửng trong môi trường nước còn là nguồn cacbon cung cấp cho vi khuẩn tồn tại và tăng sinh khối, cuối cùng khối liên kết vi khuẩn và các vật chất lơ lửng được gom lại. Sự kết dính của cặp tế bào vi khuẩn đông tụ B. cereus KG05 + B. aryabhattai ST02 được kiểm tra dưới kính hiển vi điện tử quét (Hình 4.8). Hình 4.8: Sự kết dính của cặp vi khuẩn đông tụ Ghi chú: Cặp B. cereus KG05 + B. aryabhattai ST02 chụp dưới Kính hiển vi điện tử quét, độ phóng đại 2200 lần - Ngày chụp hình: 11/04/2013 KG05 ST02 Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 7 phối hợp ngẫu nhiên của hai loại muối lần lượt ở các nồng độ (A 2 .10 + A 1 .20; A 2 .10 + A 1 .30; A 2 .10 + A 1 .40; A 2 .20 + A 1 .20; A 2 .20 + A 1 .30; A 2 .20 + A 1 .40; A 2 .30 + A 1 .10; A 2 .20 + A 1 .20; A 2 .30 + A 1 .30 mM). pH được điều chỉnh lần lượt ở các mức 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0 cho mỗi lần thực hiện thí nghiệm ở mỗi cặp cation. Phối hợp từng cặp chủng vi khuẩn và tính hiệu suất đông tụ giống như thí nghiệm trên. 3.2.8 Xác định tỷ lệ giống vi khuẩn đông tụ ứng dụng xử lý nước thải Theo quy trình của Cao Ngọc Điệp và ctv.( 2010) 3.2.9 Ứng dụng vi khuẩn đông tụ vào xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas quy mô phòng thí nghiệm (08L) và trại chăn nuôi heo (80, 800L) a. Mục đích: nhằm xác định được hiệu suất đông tụ của vi khuẩn trong xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas, chất lượng nước sau quá trình xử lý so với nước thải ban đầu và QCVN 40:2011/BTNMT. b. Bố trí thí nghiệm quy mô 08 lít tại phòng thí nghiệm: bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 6 nghiệm thức (Bảng 3.2), lặp lại 3 lần, tổng số 18 đơn vị thí nghiệm, mỗi đơn vị thí nghiệm 08 lít, thực hiện trong bình nhựa 10 lít, để bảo đảm cho nước không bị tràng ra ngoài khi sục khí (Hình 3.2). Hình 3.2: Mô hình ứng dụng xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas quy mô 8 lít tại phòng thí nghiệm - Hình chụp ngày:21/02/2014 c. Thực hiện: thí nghiệm được tiến hành trong 3 chu kỳ. - Chu kỳ 1: bổ sung vi khuẩn và PAC (Bảng 3.2), sục khí liên tục 6 giờ sau đó để yên, tại thời điểm 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18 giờ, tiến hành lấy mẫu phân tích và tính hiệu suất đông tụ. Cuối chu kỳ 1 tổng thời gian vận hành là 24 giờ, lấy 50% nước trong ở phần trên bình ra, thêm lượng nước thải mới vào đầy bình. - Chu kỳ 2: các nghiệm thức sục khí liên tục 1 giờ, để yên 6 giờ (tại thời điểm 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 giờ, lấy mẫu phân tích và tính hiệu suất đông tụ). Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 8 Cuối chu kỳ 2 là 7 giờ, lấy 50% nước trong ở phần trên bình ra, thêm lượng nước thải mới vào đầy bình. - Chu kỳ 3: thực hiện giống như chu kỳ 2. Bảng 3.2: Thể thức bố trí ứng dụng xử lý nước thải quy mô 08 lít Nghiệm thức PAC (0,05%) C ặp chủng vi khuẩn (500 µl/lít), mật độ >10 9 tế bào/ml Ký hiệu NT1 - - ĐC NT2 + - PAC NT3 + C ặp vi khuẩn thứ nhất PAC+ C1 NT4 + C ặp vi khuẩn thứ hai PAC+ C2 NT5 + C ặp vi khuẩn thứ ba PAC+ C3 NT6 + C ặp vi khuẩn thứ t ư PAC + C4 Ghi chú: (+) có; (-) không; ĐC: đối chứng; C1, C2, C3, C4: là cặp vi khuẩn 1, 2, 3, 4 Các chủng vi khuẩn đông tụ được nhân nuôi sinh khối trước khi bố trí thí nghiệm 24 giờ và bổ sung theo tỉ lệ 1:1 trong các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn. Tại thời điểm cuối của mỗi chu kỳ xử lý đều được lấy mẫu ngẫu nhiên để phân tích các thông số (Bảng 3.3). Bảng 3.3: Các thông số và phương pháp phân tích mẫu nước thải sau xử lý Thông số phân tích (mg/l) Phương pháp So sánh kết quả pH Đo pH b ằng máy meter Cu ối m ỗi chu kỳ BOD 5 SMEWW 5210 D: 2012 QCVN 40:2011/BTNMT TP TCVN 6638: 2000 QCVN 40:2011/BTNMT TSS SMEWW 2540 D: 2012 QCVN 40:2011/BTNMT TP SMEWW 4500 E: 2012 QCVN 40:2011/BTNMT N - NH 4 + Phương pháp Kjedahl QCVN 40:2011/BTNMT PO 4 3 - Watanabe và Olsen QC VN 40:2011/BTNMT Hi ệu suất đông tụ Kimchhayarasy et al ., 2 009 So sánh k ết quả cuối mỗi chu kỳ với ban đầu d. Bố trí thí nghiệm quy mô 80, 800 lít thực hiện tại trại chăn nuôi heo: được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức, quy mô 80 lít/đơn vị nghiệm thức, thực hiện trong thùng nhựa 100 lít (Bảng 3.4, 3.5), lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được tiến hành tại trại chăn nuôi heo, chủ trại Lê Hoàng Minh - Đông Hưng 2 - Đông Thành - Bình Minh - Vĩnh Long, thực hiện qua 3 chu kỳ giống như thí nghiệm quy mô 08 lít. Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 17 Hình 4.6: Vi khuẩn tự đông tụ trong môi trường polypepton (24 giờ) Ghi chú: (a). Dịch vi khuẩn chủng Bacillus cereus KG05 nuôi 24 giờ trong môi trường Polypepton; (b). Chủng vi khuẩn Bacillus cereus KG05 chụp ảnh (SEM) độ phóng đại 13000 lần; c). Chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai ST02 độ phóng đại 4300 lần; (d). Chủng vi khuẩn Bacillus megaterium VL01 độ phóng đại 65000 lần. 4.2.2 Khảo sát sự đông tụ của các cặp vi khuẩn đông tụ Kết quả khảo sát hiệu suất đông tụ của 28 cặp tế bào vi khuẩn khác nhau về đặc tính di truyền, đồng thời xác định thời gian tối ưu khi các cặp vi khuẩn tiếp xúc với nhau cho hiệu suất đông tụ cao nhất. Kết quả đã chọn được 4 cặp chủng vi khuẩn cho hiệu suất đông tụ cao đạt 71,2 – 88,1% là B. cereus KG05 + B. megaterium VL01; B. cereus KG05 + Bacillus sp. VL05; B. cereus KG05 + B. aryabhattai ST02; B. megaterium VL01 + Bacillus sp. VL05, thuộc 3 tỉnh Kiên Giang, Vĩnh Long và Sóc Trăng, thời gian các tế bào vi khuẩn tiếp xúc kết dính nhau cho hiệu suất cao nhất là 6 giờ, khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 1% so với các mốc thời gian còn lại và khác biệt có ý nghĩa so với 24 cặp chủng vi khuẩn còn lại khi thực hiện thí nghiệm. (Hình 4.7). Từ kết quả Hình 4.7 cho thấy, khi cặp vi khuẩn tiếp xúc nhau 1 giờ, hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn đạt rất thấp (28,3 – 48,8%). Hiệu suất đông tụ được tăng lên ở thời gian 3 giờ đạt 52,9 – 65,4%. Tại thời gian tiếp xúc 6 giờ, sự đông tụ của vi khuẩn đạt được tối ưu từ 71,2 – 88,1%. Nguyên nhân là giai đoạn đầu khi mới tổ hợp cặp chủng vi khuẩn vào nhau, chúng cần có thời gian thích nghi với môi trường và nhận biết nhau đồng a b c d Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 16 tụ cao nhất từ 51,0 – 87,2%, khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 1% so với các mốc thời gian nuôi sinh khối 36, 48 và 60 giờ (Bảng 4.3). Sự liên kết giữa các tế bào vi khuẩn với nhau được thể hiện rõ dưới kính hiển vi điện tử quét (Hình 4.6). Kết quả cho thấy, tốc độ gom tụ và lắng của chủng vi khuẩn đông tụ trong dịch huyền phù rất nhanh (Hình 4.6a). Quan sát Hình 4.6b, 4.6c, 4.6d, cho thấy, các tế bào vi khuẩn đông tụ có cùng đặc tính di truyền liên kết lại với nhau bằng cầu nối tế bào với tế bào, thông qua cơ chế kết dính các vùng kỵ nước trên bề mặt của từng tế bào vi khuẩn tạo nên sự đông tụ. Bảng 4.3: Hiệu suất tự đông tụ 16 chủng vi khuẩn đông tụ được tuyển chọn Chủng vi khuẩn đông tụ Hi ệu suất tự đông tụ (% ±SD ) 24 gi ờ 36 gi ờ 48 gi ờ 60 gi ờ Bacillus cereus KG05 87,2 a ±6,41 73,0 b ±21,5 54,0 c ±18,3 44,2 d ±23,8 Bacillus megaterium VL01 82,1 a ±9,16 63,4 b ±19,2 49,3 c ±17,1 15,6 d ±17,9 Bacillus sp. VL05 5 8,9 a ±6,82 53,5 b ±17,3 36,8 c ±12,2 28,0 d ±15,7 Bacillus megaterium TV06 58,2 a ±5,83 46,9 b ±5,5 31,9 c ±10,3 27,8 d ±11,5 Bacillus aryabhattai ST02 56,7 a ±7,85 43,3 b ±18,9 46,4 b ±22,7 19,7 c ±11,2 Bacillus megaterium CT03 55,8 a ±0,61 49,4 b ±7,49 27,5 c ±7,30 25,1 c ±7,29 Bacillus thuringiensis BL01 55,4 a ±0,94 43,3 b ±6,74 34,5 c ±12,1 33,9 c ±8,84 Enterobacter DT07 54,5 a ±0,92 43,6 b ±8,15 30,6 c ±5,77 29,0 c ±6,92 Bacillus aryabhattai TG02 53,4 a ± 3,55 8,3 c ±13,1 18,0 b ±13,8 7,9 c ±11,8 Bacillus megaterium HG04 53 ,2 a ±4,21 31,7 b ±7,38 28,6 b,c ±5,32 24,8 c ±3,0 Bacillus sp. AG08 53,2 a ±1,69 42,7 b ±15,8 17,6 d ±0,98 33,9 c ±39,2 Bacillus sp. TG09 53,2 a ±5,0 35,0 b ±7,68 20,3 c ±7,32 11,9 d ±3,13 Bacillus megaterium LA04 52,9 a ±1,70 42,6 b ±5,49 39,4 b ±4,68 17,8 c ±7,42 Bacillus megaterium CT02 52,5 a ±0,35 18,7 b ±21,6 14,6 b,c ±14,6 9,0 c ±10,8 Bacillus cereus CM03 52,3 a ± 3,28 25,8 b ±12,7 28,2 b ±17,6 12,2 c ±6,87 Bacillus sp. BT05 51,0 a ±1,39 22,2 b ±19,7 10,0 c ±1,31 7,6 c ±6,5 Các giá trị trên cùng một hàng mang ký tự mũ khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 1% Sinh khối vi khuẩn phát triển cực đại thì các tế bào vi khuẩn chiếm ưu thế trong môi trường, từ đó khoảng cách các tế bào càng gần nhau, khi ấy các tế bào có tính kỵ nước cao càng dễ tiếp xúc và chúng kết dính lại với nhau cùng với các vật chất lơ lửng trong môi trường, tạo thành khối rồi lắng xuống đáy làm cho phần nước ở trên được giảm bẩn, hiệu suất đông tụ tăng lên. Từ kết quả thu được nhận thấy rằng, hiệu suất tự đông tụ của vi khuẩn phụ thuộc vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn. Đối với chủng vi khuẩn Bacillus cereus KG05 có hiệu suất tự đông tụ cao nhất (87,2%) và kết quả kiểm tra sinh hóa với p-xylen lại có hiệu suất hấp thụ với p-xylen cao nhất. Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 9 Bảng 3.4: Ứng dụng xử lý nước thải quy mô 80L tại trại chăn nuôi heo Nghi ệm thức S ục khí PAC (0,05%) C ặp chủng vi khuẩn (500 µl/lít), mật độ >10 9 tế bào/ml Ký hiệu NT1 + - - ĐC NT2 + - Tối ưu ở thí nghiệm 08 lít VK NT3 + - - PAC NT4 + + Tối ưu ở thí nghiệm 08 lít VK+PAC Ghi chú: (+) có; (-) không; ĐC: đối chứng Các chủng vi khuẩn đông tụ được nhân nuôi sinh khối trước khi bố trí thí nghiệm 24 giờ và bổ sung theo tỉ lệ 1:1 trong các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn. Tại thời điểm cuối của mỗi chu kỳ xử lý đều được lấy mẫu ngẫu nhiên để phân tích các thông số (Bảng 3.3). Bảng 3.5: Ứng dụng xử lý nước thải quy mô 800L tại trại chăn nuôi heo Nghiệm thức Sục khí PAC (0,05%) Cặp chủng vi khuẩn (500 µl/lít), mật số >10 9 tế bào/ml Ký hiệu NT 1 + - - ĐC NT 2 + + T ối ưu ở thí nghiệm 08 lít VK+PAC Ghi chú: (+) có; (-) không; ĐC: đối chứng 3.3 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thí nghiệm chuyển sang dạng arcsin, xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab.16 và SPSS.16, so sánh sự khác biệt có ý nghĩa bằng phép thử DUNCAN độ tin cậy 99%, sử dụng Excel để vẽ đồ thị, phần mềm Mega 5.2 để xây dựng mối tương quan di truyền giữa các chủng vi khuẩn đông tụ dựa trên trình tự 16S rRNA. CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập, nhận diện và tuyển chọn vi khuẩn đông tụ 4.1.1 Kết quả phân lập và nhận diện hình thái vi khuẩn đông tụ Một trăm hai mươi bốn chủng vi khuẩn được phân lập từ 150 mẫu nước thải trại chăn nuôi heo sau biogas, ở 52 huyện/thị tại 13 tỉnh/thành phố, khu vực đồng bằng sông Cửu Long, chỉ số pH trong nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở khu vực ĐBSCL dao động từ 6.0 – 8.7. Mật độ vi khuẩn ở mỗi địa điểm thu mẫu không giống nhau (Bảng 4.1). Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 10 Bảng 4.1: Vi khuẩn trong nước thải trại chăn nuôi heo sau biogas ở ĐBSCL ST T Đ ịa điểm thu mẫu (tỉnh/TP) T ổng số chủng/mẫu Ký hiệu pH M ật số (tế bào/ml) 1 An Giang 9/11 AG01  AG09 6 , 5 – 8 , 3 10 5 – 10 7 2 B ạc Li êu 6/6 BL01  BL06 6 , 0 – 7 , 6 10 6 – 10 7 3 B ến Tre 11/14 BT01  BT11 6 , 1 – 7 , 8 10 6 – 10 8 4 C à Mau 9/14 CM01  CM09 6 , 5 – 7 , 4 10 6 – 10 8 5 C ần Th ơ 8/11 CT01  CT08 6 , 1 – 7,2 10 6 – 10 7 6 Đ ồng Tháp 7/7 DT01  DT07 6 , 2 – 7 , 1 10 6 – 10 7 7 H ậu Giang 10/11 HG01  HG10 6 , 8 – 8 , 0 10 6 – 10 8 8 K iê n Giang 16/21 KG01  KG16 6, 5 – 8 , 7 10 6 – 10 9 9 Long An 6/6 LA01  LA06 6 , 4 – 7 , 1 10 6 – 10 6 10 S ó c Trăng 12/14 ST01  ST12 6 , 6 – 8 , 0 10 6 – 10 9 11 Ti ề n Giang 15/20 TG01  TG15 6 , 2 – 7 , 3 10 6 – 10 8 12 Tr à Vinh 7/7 TV01  TV07 6 , 6 – 7 , 6 10 6 – 10 8 13 V ĩ nh Long 8/8 VL01  VL08 6 , 0 – 8 , 5 10 6 – 10 9 Total 124/150 Kết quả cho thấy, các chủng vi khuẩn phân lập có thể tồn tại trong môi trường nước thải trại chăn nuôi heo sau biogas ở nhiều nơi trong khu vực ĐBSCL và có tương quan thuận với pH (Hình 4.1A). Kết quả kiểm tra hình thái vi khuẩn cho thấy, màu sắc khuẩn lạc trên môi trường thạch polypepton phần lớn có màu trắng đục (64,5%), một số ít khuẩn lạc có màu trắng trong (14,5%) hay trắng sữa (12,1%) hoặc trắng vàng (8,9%). Khi khảo sát về hình dạng khuẩn lạc, có 84,7% khuẩn lạc có dạng bìa không đều hoặc răng cưa, thậm chí chia thùy, một số ít khuẩn lạc (15,3%) có bìa nguyên, kích thước khuẩn lạc sau 24 giờ cấy chuyền dao động từ 0,68 – 1,69 mm, độ nổi khuẩn lạc có hai dạng nhô hoặc lài, mặt ngoài khuẩn lạc luôn ẩm ướt và có chất nhầy. Khi kiểm tra vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần, cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập đều có khả năng chuyển động (nhanh/chậm), tất cả đều có dạng hình que (ngắn/dài). Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn cho thấy có 75,8% chủng vi khuẩn phân lập thuộc Gram dương, còn lại 24,2% là vi khuẩn Gram âm. (Hình 4.1B, C, D) Từ kết quả về đặc điểm hình thái của khuẩn lạc, hình thái và sinh lý của vi khuẩn, cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập có nhiều đặc điểm tương đồng với các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Luận án Tiến sĩ, khóa 2012 - 2015 Trường Đại học Cần Thơ Hồ Thanh Tâm Viện NC & PT CNSH 15 được kiểm tra khả năng sản sinh catalase, kết quả cho thấy 17/18 chủng vi khuẩn đông tụ dương tính với catalase biểu hiện sủi bọt khí với H 2 O 2 ở nồng độ 3% (Bảng 4.2 và Hình 4.5B). Kết quả này tương đồng với kết quả của Banwart (2000), đặc trưng của vi khuẩn chi Bacillus ngoài những đặc điểm cơ bản biểu hiện ở khóa phân loại của Bergey là hình que, Gram dương, hiếu khí và tạo bào tử, vi khuẩn Bacillus còn biểu hiện dương tính với catalase. Hình 4.5: Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn đông tụ KG05 (A) nhuộm bào tử; (B) phản ứng dương tính với catalase Từ kết quả nghiên cứu về hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử (Hình 4.4, Bảng 4.2) làm cơ sở để phân loại định danh được 18 chủng chủng vi khuẩn đông tụ trong nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở vùng ĐBSCL phần lớn (94,4%) thuộc chi Bacillus là: Bacillus cereus KG05, Bacillus cereus CM03, Bacillus thuringiensis BL01, Bacillus megaterium BT02, Bacillus megaterium VL01, Bacillus megaterium CT03, Bacillus megaterium AG07, Bacillus megaterium LA04, Bacillus megaterium TV06, Bacillus megaterium HG10, Bacillus subtilis CM01, Bacillus aryabhattai TG02, Bacillus aryabhattai ST02, Bacillus sp. VL05, Bacillus sp. TG09, Bacillus sp. AG08, Bacillus sp. BT05, Enterobacter DT07. 4.2 Tuyển chọn vi khuẩn đông tụ trong nước thải chăn nuôi heo sau biogas 4.2.1 Khảo sát sự tự đông tụ của mỗi chủng vi khuẩn Kết quả khảo sát hiệu suất tự đông tụ của các tế bào vi khuẩn có cùng đặc tính di truyền không dùng dung môi p-xylen cho thấy, trong thời gian 24 giờ nhân nuôi vi khuẩn và sau 10 phút để yên, các tế bào vi khuẩn tự kết dính với nhau tạo thành khối lớn dần và lắng xuống đáy cho hiệu suất đông Bacillus cereus KG05 A B Bào tử Thành tế bào dinh dưỡng [...]... tương đồng với kết quả nghiên cứu của Kimchachyarasy et al (2009); Malik và Kakii, (2003), cho rằng đặc tính sinh hóa của vi khuẩn đông tụ là tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn và tùy theo chủng vi khuẩn có các vùng kỵ nước ở bề mặt tế bào nhiều hay ít sẽ cho hiệu suất đông tụ cao hay thấp Vậy, cơ chế của quá trình đông tụ là sự kết dính giữa các tế bào vi khuẩn với nhau nhờ vào tính kỵ nước của... chủng vi khuẩn đông tụ cho thấy, 17/18 chủng có tạo bào tử, được biểu hiện bắt màu xanh của thuốc nhuộm Malachite Green và thành tế bào vi khuẩn bắt màu hồng của Safranin (Bảng 4.2 và Hình 4.5A) Kết quả phân tích còn cho thấy thời gian nuôi vi khuẩn càng lâu thì bào tử hình thành càng nhiều Các chủng vi khuẩn đông tụ cũng Hồ Thanh Tâm 14 Vi n NC & PT CNSH Hình 4.1: Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn phân. .. tổng số chủng vi khuẩn phân lập trong nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở ĐBSCL Dung môi p-xylen là chất lỏng dạng este không tan trong nước (tính kỵ nước cao) Trong môi trường lỏng các vật chất có cùng tính chất chúng có khuynh hướng hướng vào nhau (kết dính), đặc biệt là những vật chất có tính kỵ nước cùng tồn tại trong môi trường nước thì chúng sẽ kết cụm lại để che dấu phần kỵ nước Kết quả cho thấy,... độ vi khuẩn và pH môi trường; (B) Khuẩn lạc chủng ST02; (C) Nhuộm gram chủng VL01; (D) Chủng KG05 chụp dưới KHV điện tử quét độ phóng đại 6.500 lần, tại phòng thí nghiệm vi sinh vật chuyên sâu, trường Đại học Cần Thơ 4.1.2 Khảo sát tính kỵ nước của tế bào vi khuẩn đông tụ Kết quả chọn được 32 chủng vi khuẩn có hiệu suất hấp thụ của dung môi p-xylen từ 50,1 – 81,8%, chiếm 25,8% trên tổng số chủng vi khuẩn. .. DNA, chọn được 18 trình tự chuỗi nucleotide có tầng số bit ổn định lớn hơn 1.000 nucleotide Kết quả BLAST N trình tự chuỗi 16S rRNA của 18 chủng vi khuẩn đông tụ với các trình tự chuỗi 16S rRNA của vi khuẩn có trong Genbank, đã chọn được 36 trình tự chuỗi nuclotide của vi khuẩn trong Genbank có tỷ lệ tương đồng >97%, tiến hành xây dựng cây phát sinh loài (Hình 4.4) Kết quả cho thấy 54 chủng vi khuẩn. .. 4.1.3 Xây dựng mối tương quan di truyền giữa các chủng vi khuẩn đông tụ dựa trên trình tự 16S rRNA và định danh vi khuẩn đông tụ 9 TG.09 BT.05 99 AG.08 52 JQ599065_Bacillus_sp._385 18 JX501679_Bacillus_cereus_strain_C1E4 20 98 Sản phẩm PCR được điện di trên agarose nồng độ 0,8%, kết quả chọn được 32 chủng phân lập đều có band tại vị trí 1.500 bp ở cặp mồi 8F và 1492R, khi so sánh với thang chuẩn DNA 100... thấy, khi dung dịch huyền phù vi khuẩn được phối trộn với dung môi p-xylen, thành phần có tính kỵ nước trong dung dịch sẽ gom tụ lại Lúc này những tế bào vi khuẩn có tính kỵ nước sẽ được p-xylen hấp thụ gom lại rồi tách ra khỏi nước, nổi lên phía trên bề mặt của dung dịch (Hình 4.2) Như vậy, hiệu suất hấp thụ với p-xylen càng cao là do tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn càng lớn, tạo cho lực hút... là sự kết dính giữa các tế bào vi khuẩn với nhau nhờ vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào, qua đó các vật chất lơ lửng trong môi trường được kết lại và lắng xuống cùng với khối vi khuẩn Tính kỵ nước của bề mặt tế bào càng cao thì hiệu suất đông tụ càng lớn, đây cũng là đặc tính sinh hóa của vi khuẩn đông tụ KC527057_Bacillus_megaterium_strain_ASNF3 99 2 97 JF894162_Bacillus_megaterium_strain_OsR-3 TG.02... (15) BT05, (ĐC) đối chứng âm, (16) DT07, (17) BT02, (18) TG02 98 JQ956520_Bacillus_megaterium_strain_PXL-1 99 JQ086378_Bacillus_subtilis_strain_(CHINA) GU113079_Stenotrophomonas_sp._P9 65 JQ308611_Stenotrophomonas_maltophilia_strain_YPA_1-1 11 6 CM.01 LA.04 Ba mươi hai chủng vi khuẩn có tính kỵ nước cao được xem là vi khuẩn có đặc tính đông tụ trong môi trường nước, nhờ vào tính kỵ nước của bề mặt tế... 987047_Bacillus_megaterium_strain_SigaKolBm1 13 100 JX 987050_Bacillus_megaterium_strain_SigaKolBm7 5 Hình 4.4: Cây phát sinh loài của 18 chủng vi khuẩn đông tụ với 36 chủng vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu NCBI Hồ Thanh Tâm 12 Vi n NC & PT CNSH Hồ Thanh Tâm 13 Vi n NC & PT CNSH . lại rồi lắng xuống tương tự như vi khuẩn kết tụ sinh học, nhưng cơ chế gom tụ của các chủng vi khuẩn này khác với vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học. 2.3 Vi khuẩn đông tụ trong các hệ thống. phù vi khuẩn không có p-xylen; OD m : OD dịch huyền phù vi khuẩn có thêm p-xylen. 3.2.3 Xác định hiệu suất đông tụ từ cơ chế tự đông tụ của vi khuẩn a. Mục tiêu: chọn được những chủng vi khuẩn. + C ặp vi khuẩn thứ ba PAC+ C3 NT6 + C ặp vi khuẩn thứ t ư PAC + C4 Ghi chú: (+) có; (-) không; ĐC: đối chứng; C1, C2, C3, C4: là cặp vi khuẩn 1, 2, 3, 4 Các chủng vi khuẩn đông