ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN RHODOTORULA CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA-CAROTENE TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN LÀM THỨC ĂN BỔ SUNG CHO GÀ ĐẺ TRỨNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN RHODOTORULA CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA-CAROTENE TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN LÀM THỨC ĂN BỔ SUNG CHO GÀ ĐẺ TRỨNG CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH : 62.54.02.01 Phản biện độc lập 1 : PGS.TS NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM Phản biện độc lập 2 : PGS.TS LƯU HỮU MÃNH Phản biện 1 : PGS. TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Phản biện 2 : TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Phản biện 3 : PGS. TS NGUYỄN TIẾN THẮNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO 2. TS. NGUYỄN HỮU PHÚC LỜI CAM ĐOAN Nghiên cứu sinh NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng tri ân đến Cô PGS.TS. Đống Thị Anh Đào và Thầy TS. Nguyễn Hữu Phúc đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành Luận án này. Chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm - Khoa Công nghệ Hóa học và Dầu khí, quý Thầy Cô trong Hội đồng bảo vệ các chuyên đề NCS và đặc biệt là Thầy PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn đã có những đóng góp, những nhận xét chân thành cho kết quả đạt được của Luận án. Đồng cảm ơn Ban lãnh đạo cùng giảng viên, cán bộ nhân viên Viện Công nghệ Thực phẩm – Sinh học, Trường Đại học Công Nghiệp TP. HCM; Bộ môn chăn nuôi chuyên khoa, Khoa Chăn nuôi – Thú y trường Đại học Nông Lâm TP. HCM; Khoa Hóa học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Bà Rịa-Vũng Tàu đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu. Cảm ơn anh Trần Văn Nam, chủ cơ sở Mai Thủy, thành phố Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu đã tạo điều kiện cho tôi làm thực nghiệm trên đàn gia cầm chuyên trứng IsaBrown của cơ sở. Xin gửi lời cảm ơn đến học viên cao học Nguyễn Thị Tú Minh và cử nhân Nguyễn Minh Nhựt đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình tiến hành thực nghiệm. Xin cảm ơn Ba, Mẹ và các Anh Chị trong đại gia đình Đức Hải đã giúp con có được sự thành đạt ngày hôm nay. Lời cuối cùng tôi xin cảm ơn anh Phan Trung Viên đã luôn cận kề, động viên, chia sẻ, tạo mọi điều kiện về vật chất lẫn tinh thần cho tôi học tập và nghiên cứu. Cảm ơn hai con Phan Trung Thành Nhân và Phan Nguyễn Minh Tâm đã ngoan, khỏe mạnh và học giỏi trong những năm mẹ học tập. NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn MỤC LỤC Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các sơ đồ và hình MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NẤM MEN RHODOTORULA 1 1.1.1 Giới thiệu chung và đặc điểm phân loại 1 1.1.2 Đặc điểm sinh lý, hình thái 3 1.1.3 Đặc điểm sinh hóa 4 1.1.4 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula 4 1.1.5 Khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất khác của Rhodotorula . 11 1.2 KỸ THUẬT NUÔI CẤY BÁN RẮN 12 1.2.1 Khái quát về lên men bán rắn 12 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bán rắn 14 1.2.3 Phương pháp định lượng sinh khối trong lên men bán rắn 15 1.2.4 Lên men bán rắn nấm men Rhodotorula 17 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula 18 1.3 VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ CHẤT DINH DƯỠNG ĐỐI VỚI GIA CẦM ĐẺ TRỨNG 22 1.3.1 Vai trò dinh dưỡng của protein và acid amin 23 1.3.2 Vai trò của sắc tố carotenoid đối với gà đẻ 24 1.3.3 Vai trò của enzym phytase 25 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NẤM MEN RHODOTORULA 28 2.1.1 Vật liệu phân lập 28 2.1.2 Môi trường phân lập 28 2.1.3 Các thí nghiệm định danh nấm men 29 2.2 THU NHẬN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM MEN RHODOTORULA THEO KỸ THUẬT NUÔI CẤY BÁN RẮN 29 2.2.1 Khảo sát phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men 29 2.2.2 Thành phần môi trường cơ bản cho quá trình LBR Rhodotorula 33 2.2.3 Tối ưu hàm lượng các chất dinh dưỡng bổ sung cho quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men Rhodotorula theo qui hoạch thực nghiệm Box-Hunter . 35 2.2.4 Tối ưu điều kiện nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula 37 2.2.5 Phương pháp khảo sát động học sinh tổng hợp sinh khối và các sản phẩm trao đổi chất khác 39 2.2.6 Khảo sát sự tự phân của nấm men Rhodotorula 40 2.2.7 Các phương pháp phân tích hóa lý 40 2.3 THỬ NGHIỆM TÍNH AN TOÀN CỦA CHẾ PHẨM TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 41 2.3.1 Đối tượng thí nghiệm 41 2.3.2 Thành phần thức ăn đối chứng 42 2.3.3 Bố trí thí nghiệm trên đàn chuột 43 2.3.4 Các chỉ tiêu và phương pháp khảo sát 43 2.4 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM TRÊN GÀ ĐẺ TRỨNG 45 2.4.1 Đối tượng và địa điểm thí nghiệm 45 2.4.2 Thành phần thức ăn đối chứng 46 2.4.3 Các nguyên liệu phối trộn thức ăn thí nghiệm 46 2.4.4 Bố trí thí nghiệm trên đàn gà 47 2.4.5 Các chỉ tiêu khảo sát năng suất và phẩm chất trứng 48 2.4.6 Quan sát sự tiêu huỷ của tế bào nấm men và phương pháp thu nhận chế phẩm 51 2.4.7 Xác định mối tương quan giữa tổng hàm lượng carotenoid trong thức ăn với năng suất cho trứng của gà 52 2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 52 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ CHỌN RHODOTORULA CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA-CAROTENE TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN 53 3.1.1 Phân lập các nấm men sinh sắc tố carotenoid 53 3.1.2 Tuyển chọn và định danh các nấm men thuộc giống Rhodotorula trên cơ sở thực hiện các thí nghiệm theo khoá phân loại của Kreger-van Rij 53 3.1.3 Chọn chủng nấm men nghiên cứu chính từ các chủng phân lập được trên cơ sở khả năng sinh tổng hợp beta-carotene 56 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM MEN RHODOTORULA THEO PHƯƠNG PHÁP BÁN RẮN 59 3.2.1 Khảo sát các phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men 59 3.2.2 Tối ưu hàm lượng các chất dinh dưỡng bổ sung cho quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula 62 3.2.3 Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men Rhodotorula 71 3.2.4 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp sinh khối, phytase, carotenoid tổng và beta-carotene của nấm men Rhodotorula theo thời gian 77 3.2.5 Khảo sát quá trình tự phân của nấm men 81 3.2.6 Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm 82 3.2.7 Phân tích thành phần dinh dưỡng của chế phẩm 83 3.3 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TÍNH AN TOÀN CỦA CHẾ PHẨM TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 87 3.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM TRÊN GÀ ĐẺ TRỨNG 90 3.4.1 Công thức thức ăn cho gà đẻ trứng sử dụng trong thí nghiệm 90 3.4.2 Năng suất trứng 92 3.4.3 Mối tương quan giữa hàm lượng carotenoid tổng và năng suất trứng gà 93 3.4.4 Tỷ lệ gà sống 94 3.4.5 Các chỉ tiêu phẩm chất trứng 94 3.4.6 Hàm lượng beta – carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng 97 Chương 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 99 4.2 ĐỀ NGHỊ 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ GIẤY KHEN, GIẤY CHỨNG NHẬN CỦA BAN TỔ CHỨC HỘI THI SÁNG TẠO KỸ THUẬT TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU NĂM 2008 – 2009 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CB : cân bằng CFU : đơn vị hình thành khuẩn lạc CK : chất khô DM : dung môi ĐC : đối chứng HSPL : hệ số pha loãng KL : khuẩn lạc Klg : khối lượng LBR : lên men bán rắn % Klg : phần trăm khối lượng MT : môi trường ME : năng lượng trao đổi NT : nghiệm thức OD : mật độ quang TB : trung bình TYT : tối ưu các yếu tố toàn phần TN : thí nghiệm Sac. : đường saccharose UI : đơn vị hoạt độ DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các sắc tố chính do nấm men Rhodotorula tổng hợp 8 Bảng 1.2 Các nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp carotenoid và beta- carotene của nấm men Rhodotorula theo phương pháp nuôi cấy chìm 10 Bảng 1.3 Sắc tố carotenoid do Rh. glutinis DBVPG 3853 tổng hợp được sau 120 giờ trên môi trường nước ép nho ở các nhiệt độ khác nhau 21 Bảng 2.1 Các nguồn phân lập nấm men sinh sắc tố carotenoid 28 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát phương pháp phá vỡ thành tế bào 31 Bảng 2.3 Thành phần nguyên liệu sử dụng 33 Bảng 2.4 Mức khảo sát của hàm lượng saccharose, nitơ, phosphor và lưu huỳnh để tìm thí nghiệm tại tâm 35 Bảng 2.5 Ma trận qui hoạch thực nghiệm 4 yếu tố theo phương án quay bậc 2 36 Bảng 2.6 Mức biến thiên hàm lượng saccharose, nitơ, phosphor và lưu huỳnh (mg/Kg MT) 37 Bảng 2.7 Các mức khảo sát độ ẩm, độ dày lớp môi trường và tỷ lệ giống để tìm thí nghiệm tại tâm 37 Bảng 2.8 Ma trận qui hoạch thực nghiệm tối ưu 3 yếu tố theo phương án toàn phần 38 Bảng 2.9 Mức biến thiên của các yếu tố điều kiện nuôi 38 Bảng 2.10 Thành phần dinh dưỡng của thức ăn đối chứng cho chuột 42 Bảng 2.11 Thành phần dinh dưỡng thức ăn đậm đặc GD 26 Star Feed 46 Bảng 2.12 Công thức thức ăn cho gà mái đẻ đối chứng 47 Bảng 3.1 Đặc điểm tế bào và tốc độ phát triển của 8 chủng Rhodotorula phân lập được 54 [...]... Rhodotorula có khả năng sinh tổng hợp beta-carotene trên môi trường bán rắn làm thức ăn bổ sung cho gà đẻ trứng” được thực hiện nhằm phân lập, tuyển chọn, tối ưu môi trường nuôi cấy dòng vi sinh vật để sản xuất nguồn thức ăn giàu beta-carotene và sản phẩm này sử dụng có hiệu quả cho chăn nuôi gia cầm đẻ trứng Ngoài ra, các loại thực phẩm tự nhiên dùng cho người hiện tại đang rất thiếu và cần bổ sung vitamin... diễn sự tương quan giữa hàm lượng carotenoid tổng với năng suất cho trứng 93 Hình 3.16 Quan sát hệ vi sinh vật trong phân gà 96 TÓM TẮT LUẬN ÁN Luận án được thực hiện nhằm tìm ra nấm men Rhodotorula có khả năng sinh tổng hợp beta-carotene cao trên môi trường nuôi cấy bán rắn để sản xuất ra chế phẩm sinh học làm thức ăn bổ sung cho gà đẻ, góp phần tạo ra nguồn trứng chất lượng cao... chọn từ tự nhiên các nấm men sinh sắc tố carotenoid thuộc giống Rhodotorula có khả năng tổng hợp sinh khối giàu beta-carotene trên môi trường bán rắn Xác định các thông số kỹ thuật của quá trình nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula trên cơ chất gạo tấm và bã đậu nành có bổ sung dinh dưỡng Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm sinh học đến năng suất và chất lượng cho trứng của gà đẻ, trong đó xác định được... lượng carotenoid tổng trong thức ăn và năng suất cho trứng của gà chuyên trứng Kết quả của quá trình nghiên cứu cho thấy tính ưu việt và hiệu quả kinh tế rõ nét của nguồn thức ăn được tạo ra theo phương cách sử dụng chế phẩm sinh học trên NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Phân lập và chọn được Rhodotorula có khả năng tổng hợp carotenoid giàu betacarotene, sinh khối và phytase trên môi trường bán rắn Tối ưu... sinh bệnh tật, giảm tỷ lệ đẻ và chất lượng trứng kém [9] Trong số các vi sinh vật có khả năng tổng hợp carotenoid thì giống nấm men Rhodotorula có khả năng sản xuất carotenoid [14, 37-39, 55-59] trong đó có betacarotene [91, 116] đang được nghiên cứu sản xuất ở quy mô công nghiệp để làm chất màu thực phẩm [51] và đã được dùng làm thức ăn chăn nuôi [80, 110] Đề tài luận án: Nghiên cứu tuyển chọn Rhodotorula. .. năng sinh tổng hợp sinh khối của Rhodotorula theo thời gian 77 Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh tổng hợp phytase theo thời gian 78 Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh tổng hợp beta-carotene và carotenoid tổng theo thời gian 80 Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của thời gian tự phân đến hàm lượng beta-carotene giữa hai nghiệm thức có bổ sung và không bổ sung. .. Kết quả khảo sát đặc điểm sinh lý và sinh hóa của 8 nấm men Rhodotorula phân lập được 55 Bảng 3.3 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của các chủng nấm men Rhodotorula trên môi trường cơ bản ……… 57 Bảng 3.4 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm lượng saccharose khác nhau 63 Bảng 3.5 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm lượng... ưu cho quá trình lên men bán rắn nấm men Rhodotorula sp.3 nhằm thu beta-carotene cao trên cơ chất gạo tấm đã qua hồ hoá có bổ sung bã đậu nành và đã xây dựng được quy trình thu nhận chế phẩm sinh học từ Rhodotorula sp.3 (gọi tắt là βCR) - Qua khảo sát tính an toàn của chế phẩm βCR, chúng tôi đã thử nghiệm dùng βCR để làm thức ăn nuôi gà đẻ trứng công nghiệp Isa Brown Kết thu được cho thấy năng suất đẻ. .. môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ nuôi cấy Đường kính khuẩn lạc Rhodotorula có thể từ 1 ÷ 10 mm [109] Trên bề mặt dịch chúng tạo thành các vòng có màu từ vàng đến đỏ [10] 1.1.2.2 Đặc điểm sinh lý Đa số loài thuộc giống Rhodotorula sinh sản bằng cách nẩy chồi đa cực, một số loài sinh sản theo kiểu nẩy chồi có cực Ngoài ra, Rhodotorula còn sinh sản theo kiểu phân 4 đôi nhưng giống Rhodotorula không có. .. 1.1.5 Khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất khác của Rhodotorula 1.1.5.1 Sinh tổng hợp phytase Theo Bindu S và cộng sự (1998) [30], nấm men Rhodotorula gracilis có khả năng sinh tổng hợp phytase Enzyme này rất cần thiết cho dinh dưỡng của gà [101, 156] Phần cơ sở lý thuyết và vai trò của phytase sẽ được trình bày ở mục 1.3.3 1.1.5.2 Sinh tổng hợp chất béo Ngoài các đặc điểm sinh hóa như trình . hai con Phan Trung Thành Nhân và Phan Nguyễn Minh Tâm đã ngoan, khỏe mạnh và học giỏi trong những năm mẹ học tập. NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn MỤC LỤC Danh mục. (1971), Kreger -van Rij (1984) và hiện nay là khóa 2 phân loại của Barnett và cộng sự (1990) hay Kurtzman và Fell (1998). Trong luận án này, chúng tôi sử dụng khóa phân loại của Kreger -van Rij (1984) Theo thời gian, đã hình thành và tồn tại nhiều khoá phân loại và định danh nấm men. Đầu tiên là khóa phân loại của Hensen (đầu thế kỷ 20) sau đó là khóa của Lodder và Kreger -van Rij (1952),