Đánh giá sự tương thich giữa phương pháp ́ kiể m tra vi sinh vâ ̣t truyề n thố ng và phương pháp đo ATP quang sinh học quá trình kiể m tra vê ̣ sinh của dây chuyề n sản xuấ t bia Viện Công nghiệp thực phẩm Trầ n Thi ̣Hảo Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Sinh học Chuyên ngành: Vi sinh vâ ̣t; Mã số: 604240 Người hướng dẫn: TS Phạm Văn Thành Năm bảo vệ: 2011 Abstract Tổng quan tình hình ngộ độc thực phẩm Việt Nam, thực trạng vệ sinh số sở sản xuất chế biến thực phẩm vi sinh vật gây ngộ độc thường gặp thực phẩm; công nghệ sản xuất bia, công đoạn cần thiết phải kiểm tra vệ sinh sản xuất Nghiên cứu các phương pháp kiểm tra vệ sinh sản xuất hiện nay; giới thiệu phương pháp ATP quang sinh Kiểm tra quá trình vệ sinh dây chuyền công nghệ sản xuất bia sở sản xuất Viện Công nghiệp thực phẩm; các vị trí kiểm tra các vị trí trọng yếu quá trình các tec lên men các tec sản phẩm, máy lọc sản phẩm Trình bày các phương pháp nghiên cứu: phương pháp kiểm tra vi sinh vật nuôi cấy truyền thống; phương pháp xác định độ ATP quang sinh Đưa kết thảo luận: phương pháp phân tích truyền thống; phương pháp ATP quang sinh học Đánh giá sự tương thích kiểm tra vi sinh vật phương pháp truyền thống đo ATP quang sinh Khảo sát ứng dụng phương pháp tạo màu xác định tổng số Coliforms máy quang phổ U-1900 ( UV-VIS spectrophotometre) Keywords Vi sinh vật; Sinh học; Vệ sinh; Công nghiệp thực phẩm; Ngộ độc thực phẩm Content Thực phẩm nhu cầu thiết yếu hàng ngày người An toàn thực phẩm trở thành vấn đề toàn cầu; trước hiểm họa rình rập, đe dọa đời sống người các thực phẩm khơng an tồn, địi hỏi quốc gia phải có quốc sách để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm Trên thực tế, thực trạng xúc ngành sản xuất chế biến thực phẩm nước ta chất lượng vệ sinh nhiều sở sản xuất Những yêu cầu nghiêm ngặt vệ sinh an toàn thực phẩm sản xuất chưa quan tâm đầu tư thích đáng Mặt khác lợi nhuận mà số nhà cung cấp sử dụng các hóa chất độc hại để chế biến, ni trồng sản xuất các sản phẩm thực phẩm; gây ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe người tiêu dùng Việc sử dụng các thực phẩm không đảm bảo chất lượng vệ sinh gây ngộ độc gây các bệnh tiêu hóa cấp tính cho người sử dụng, nghiêm trọng dẫn tới tử vong Về lâu dài, các độc tố tích lũy tới ngưỡng định phát sinh các bệnh nguy hiểm, làm biến đổi cấu trúc gen gây dị tật, dị dạng cho các hệ Trước thực trạng trên, ngồi việc khuyến khích các sở sản xuất thực hiện vệ sinh an tồn thực phẩm Nhà nước phủ cịn thị việc tăng cường công tác bảo đảm chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm để bước nâng cao chất lượng sản phẩm Tuy nhiên phương thức quản lý kiểm tra chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm dựa việc kiểm tra chất lượng sản phẩm cuối không đảm bảo chất lượng vệ sinh sản phẩm sản xuất Điều đảm bảo có sự kiểm soát chủ động hệ thống các yếu tố chất lượng điều kiện vệ sinh toàn quá trình sản xuất, chế biến, cung ứng có khả đảm bảo an toàn thực phẩm Để đáp ứng yêu cầu không gì khác phải áp dụng các phương pháp kiểm tra nhanh mức độ vệ sinh các dây chuyền sản xuất, chế biến thực phẩm Góp phần vào sự kiểm soát vệ sinh an toàn sản xuất đồ uống nói chung sản xuất bia nói riêng, chúng tơi tiến hành thực hiện kiểm tra vệ sinh dây chuyền sản xuất bia, với đề tài: “ Đánh giá sự tương thích phương pháp kiểm tra vi sinh vật truyền thống phương pháp đo ATP quang sinh học quá trình kiểm tra vệ sinh dây chuyền sản xuất bia Viện công nghiệp thực phẩm” I ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Kiểm tra quá trình vệ sinh dây chuyền công nghệ sản xuất bia sở sản xuất Viện Công nghiệp thực phẩm Các vị trí kiểm tra các vị trí trọng yếu quá trình các tec lên men các tec sản phẩm, máy lọc sản phẩm Chỉ tiêu lựa chọn kiểm tra là: tổng nấm men, nấm mốc, tổng Coliform E.coli, tổng vi sinh vật hiếu khí 2.2 Trang thiết bị, dụng cụ phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Dụng cụ thiết bị, hóa chất a Dụng cụ thiết bị + Máy đo ATP HY_LITE + Máy quang phổ UV-VIS U-1900 + Nồi khử trùng + Tủ ấm + Tủ cấy + Máy đo pH + Pipet tự động, đầu hút + Đĩa petri, giấy nhôm, đèn cồn, bình xịt cồn, đũa thủy tinh,… b Hóa chất + Plate count agar ( Peptone từ Carein 5,0g; cao nấm men 2,5g; D+ gluco 1,0g; agar 14,0g) Cách pha: Hòa tan 22,5 g PCA 1000 mL nước cất Hấp khử trùng 121oC, 15phút Sau khử trùng pH: 7,0 ± 0,2 25 oC + Lactose broth ( Peptone 10g; lactose 10g; beef extract 6g; nước cất 1000 mL) Cách pha: Môi trường đơn: hòa tan 13g lactose broth 1000mL nước cất Mơi trường kép: hịa tan 26g lactose broth 1000 mL nước cất Hịa tan mơi trường, sau đem hấp khử trùng 121oC, 15phút Sau khử trùng pH: 6,9 ± 0,2 25 oC + Brilliant-green lactose (bile) broth ( Peptone 10g; lactose 10g; OX bile 20g; Brilliant – green 13 mL; nước cất 1000 mL) Cách pha: Mơi trường đơn: hịa tan 40g 1000 mL nước cất Mơi trường kép: hịa tan 80g 1000 mL nước cất Hịa tan mơi trường, sau đem hấp khử trùng 121oC, 15phút Sau khử trùng pH: 7,2 ± 0,2 25 oC Tryptone Tryptone ( Peptone từ casein ): 20g NaCl: 5g Nước cất 1000 mL Cách pha: Hịa tan mơi trường, sau hấp khử trùng 121oC, 15phút Sau khử trùng pH: 7,5 ± 0.2 25 oC + R2A agar (Yeast extract 0,5; proteose peptone 0,5; casein hydrolysat 0,5; glucose 0,5; starch soluble 0,5; natri pyruvat 0,3; K2HPO4 0,3; MgSO4 0,05; agar 12,0) Cách pha: Hòa tan 15.2 g 1000 mL nước cất Đem hấp khử trùng 121oC vòng 15 phút Sau khử trùng pH 7,2 ± 0,2 25 oC + Kovacs + Oxidase + Fluoro cult (Tryptone 5,0; NaCl 5,0; Sorbit 1,0; Tryptophan 1,0; 4brom-4chlor-3 indoly –B-D- glactogyranoside (X-gal) 0,08; 4metylumbelliferyl –β-D-glucuronide (MGG) 0.05; 1-isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside 0.1 ) Cách pha: Môi trường đơn: cân 17g/1000mL nước cất Môi trường kép: cân 34g/1000mL nước cất Hịa tan mơi trường, sau hấp khử trùng 121oC, 15phút Sau khử trùng pH: 6,8 ± 0,2 25 oC 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.2.1.Phương pháp kiểm tra vi sinh vật nuôi cấy truyền thống Phương pháp truyền thống phương pháp phổ biến các nghiên cứu vi sinh vật học Trên môi trường đặc vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc sự sinh khí biểu hiện đục ống nghiệm Dựa kiểm tra số lượng vi sinh vật đơn vị thể tích dịch nghiên cứu Phương pháp đếm khuẩn lạc thường sử dụng để kiểm tra số lượng nấm men, nấm mốc 2.2.2.1.1 Phương pháp xác định tổng số Coliform E.coli Cấy vào ống đựng môi trường canh thang lỏng nồng độ kép với lượng 10 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), ống thả ống duham lộn ngược Tiếp theo, cấy vào ống đựng môi trường canh thang lỏng nồng độ đơn với lượng mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), ống thả ống duham lộn ngược Cấy vào ống đựng môi trường canh thang lỏng nồng độ đơn với lượng 0.1 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), ống thả ống duham lộn ngược Ủ các ống sau cho mẫu vào nhiệt độ 35oC 24 48 h quan sát Với ống có biểu hiện đục sinh khí, chuyển tiếp 10 mL , 1mL, 0.1mL vào ống môi trường brilliant kép 5; ống môi trường Brilliant đơn, nuôi tiếp 35oC sau 48 h sau quan sát đọc kết theo bảng kết ISO 9308-phần II Mẫu có coliform với biểu hiện đục sinh khí ống Chuyển tiếp 10 mL, 1mL, 0.1 mL vào ống môi trường tryptone kép 5; ống môi trường Tryptone đơn, nuôi tiếp 44oC sau 24 h Cho vào ống vài giot Kovacs, biểu hiện màu hồng ống, chứng tỏ sự có mặt E.coli 2.2.2.1.2 Tính tổng số nấm men, nấm mốc Chuẩn bị dịch pha lỗng mơi trường đĩa thạch Nấu loại mơi trường thích hợp cho nhóm vi sinh vật Hịa tan môi trường phân phối vào các lọ, khử trùng nồi hấp áp lực 121oC 15 phút Lấy 1mL mẫu với tỷ lệ pha loãng định cho vào các hộp đĩa thạch khử trùng, mức pha loãng dùng đĩa thạch Sau rót vào hộp đĩa khoảng 10 mL mơi trường thạch sau khử trùng để nguội 40-50oC Đậy nắp xoay tròn hộp mặt tủ cấy, để nguội đến mặt thạch đông lại, ghi số mẫu nồng độ pha loãng lên đáy hộp petri bọc giấy báo đem nuôi 35oC đọc kết sau 48h ± 2.2.2.1.3 Tổng vi sinh vật hiếu khí Sử dụng mơi trường R2A agar, hòa tan với lượng 15,2g/1000 mL, đem hấp khử trùng 121oC 15 phút Lấy mL mẫu mẫu pha loãng cho vào hộp petri khử trùng, rót vào khoảng 10 mL môi trường R2A agar khử trùng, đậy nắp xoay tròn hộp mặt tủ cấy, để nguội, đợi mặt thạch đơng lại hồn tồn sau ghi tên mẫu nồng độ pha loãng lên đáy hộp petri, bao giấy đem nuôi 35oC vòng 48h ± Khi đủ thời gian, đem đọc kết cách đếm các khuẩn lạc đĩa thạch Sau báo cáo số khuẩn lạc đơn vị thể tích mẫu tương ứng 2.2.2.2 Phương pháp xác định độ ATP quang sinh Để nghiên cứu ứng dụng phương pháp kiểm tra nhanh vệ sinh dây chuyền sản xuất bia đo ATP quang sinh, các bước cần phải tiến hành sau: - Nhận dạng các điểm kiểm tra: Các điểm kiểm tra coi các điểm kiểm soát tới hạn (CCP), đại diện cho hiệu quá trình vệ sinh Kết thu phản ánh thực tế hiệu quá trình vệ sinh Các điểm kiểm tra nói chung chia làm hai nhóm: Bề mặt tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm nhóm bề mặt tiếp xúc gián tiếp với sản phẩm - Lập kế hoạch lấy mẫu: Căn sơ đồ sản xuất, xây dựng kế hoạch lấy mẫu, tần suất lấy mẫu cho phù hợp vị trí kiểm tra Thu thập liệu xây dựng giới hạn thường quy: Nội dung giúp nhận diện tình trạng vệ sinh hiện các vị trí kiểm tra Những liệu bao gồm các vị trí kiểm tra trạng thái bẩn trạng thái vệ sinh - Xác định các giá trị giới hạn: Sau có đủ các số liệu tình hình vệ sinh vị trí kiểm soát, kết hợp với theo dõi quá trình sản xuất kết kiểm tra vệ sinh thông thường tiến hành xây dựng mức kiểm soát vệ sinh ATP quang sinh - Đo ATP quang sinh thiết bị đo HY_LITE Đặc tính kỹ thuật máy: + Khoảng tuyến tính 0-99000 RLU + Có thể lưu 2000 kết đo + Tín hiệu < 10 RLU + Các dạng kiểm tra: HACCP, Test and store, Test only + Đầu dò: photomultiplier (PMT) loại cực nhạy có chức bảo vệ quá tải Trong phương pháp xác định ATP quang sinh có hai dạng dụng cụ lấy mẫu sử dụng + Que lấy mẫu bề mặt: Bôi lấy mẫu: Rút que lấy mẫu khỏi dụng cụ Clean-trace, bôi lên bề mặt kiểm tra với diện tích khoảng 10cm2 Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận đặt que lấy mẫu vào dụng cụ Clean-trace, ấn xuống lắc để hoạt hóa mẫu vịng 10 giây Đọc kết quả: Đặt dụng cụ Clean-trace vào phận nhận mẫu máy đợi đọc kết khoảng 10 giây sau + Que lấy mẫu nước: Bôi que lấy mẫu: Rút que lấy mẫu khỏi dụng cụ Aqua- trace, nhúng que lấy mẫu vào dung dịch kiểm tra Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận đặt que lấy mẫu vào dụng cụ Aqua-trace, lắc để hoạt hóa mẫu vòng 10 giây Đọc kết quả: Đặt dụng cụ Aqua-trace vào phận nhận mẫu máy đợi đọc kết vòng 10 giây sau 2.2.2.3 Ứng dụng máy đo quang UV-VIS U-1900 Đặc tính kỹ thuật Hệ quang: Ratio beam Bươc sóng: 190-1100nm Độ rộng dải quang phổ: nm Stray light: 0.5 % (220 nm NaI; 340 nm NaNO2) Độ xác bước sóng: ± 0.5 nm Độ tái lặp bước sóng: ± 0.3 nm Dạng đo: Photometry, Wavelength scan, Time scan, Multiple, Wavelength measurement Photometric range: Abs (-3.000 tới 3.000) % T (0 tới 300%T) Nồng độ (0.000 tới 9999) Photometric Accuracy : ± 0.002 Abs ( tới 0.5 Abs) ± 0.004 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs) % 0.3 T Photometric repeatability : ± 0.001 Abs ( tới 0.5 Abs) ± 0.002 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs) % 0.15 T Tốc độ scan bước sóng: 10, 100, 200, 400, 800, 1200, 2400, 3600 nm/phút Baseline stability (độ trôi ): 0.0004 Abs/h (500nm, tiếng sau bật máy) Baseline flatness: ± 0.002 Abs (200 tới 950 nm) Baseline level: ± 0.00015 Abs (500nm) Nguồn sáng: WI đèn D2 Detector: Silicon photodiode Tiến hành: Các mẫu môi trường phát quang chuẩn bị Sử dụng cuvet 20 mm cho phép đo Chọn dải quét bước sóng tà 190 nm - 1100 nm II KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chúng thực hiện kiểm tra vệ sinh số điểm trọng yếu dây chuyền sản xuất bia như: + Các tec lên men + Máy lọc sản phẩm + Các tec sản phẩm 3.1 Phƣơng pháp phân tích truyền thống 3.1.1 Kiểm tra tec lên men  Tec lên men Bảng 2: Kết kiểm tra vệ sinh tec lên men Chỉ tiêu phân tích Rửa lần Rửa lần Rửa lần Rửa lần Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.4 x106 5.8 x106 5.2 x104 1.5 x103 Tổng nấm men, nấm mốc 4.2 x 103 3.7 x103 3.2 x103 1.0 x 102 Tổng E.coli (MPN) 0 0 Tổng Coliform (MPN) 2,0 2,0