ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆTHÀNH ĐOÀN TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU - -1 ThS. NGUYỄN XUÂN HẢI CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 09/2014 SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP. HỒ CHÍ MINH TP. HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH VƢỜN ƢƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ  *  BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã được chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 27/09/2014) PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT CÓ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TẾ - -1 TỪ KEO ONG DÚ (TRIGONA MINOR Thủ trƣởng Cơ quan chủ trì đề tài (Họ tên, chữ ký, đóng dấu) Chủ nhiệm đề tài (Họ tên và chữ ký) Giám đốc Sở Khoa học và Công nghệ Chủ tịch Hội đồng nghiệm thu Phân lập 10 hợp chất tinh khiết từ keo ong Trigona minor . Phân lập 10 hợp chất tinh khiế . 2-5 Hợp chất có khả tế bào ung thư - PSN-1 50 < 100 µM. 6 Hợp chất có khả tế bào ung thư -1 50 < 100 µM. . . 1 B . 1 B , ĐHQG-HCM. i MỤC LỤC MỤC LỤC i iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi TỔNG QUAN 1. TỔNG QUAN VỀ LOÀI ONG KHÔNG NGÕI ĐỐT 1 1.1. Giới thiệu về loài ong mật 1 1.2. Các chi chính của loài ong không ngòi đốt 1 1.2.1. Chi Trigona 1 1.2.2. Chi Melipona 2 1.3. Sản phẩm của loài ong không ngòi đốt 2 1.4. Thành phần hóa học của keo ong một số loài ong không ngòi đốt 3 1.4.1. Thành phần hóa học của keo ong loài Trigona spinipes ở Brazil 3 1.4.2. Thành phần hóa học của keo ong loài Tetragonula carbonaria ở Öc 4 1.4.3. Thành phần hóa học của keo ong loài Melipona subnitida ở Brazil 6 1.4.4. Thành phần hóa học của keo ong loài Melipona interrupta ở Brazil 6 1.4.5. Thành phần hóa học của keo ong loài Melipona beecheii ở Mexico 7 1.5. Hoạt tính sinh học của keo ong của một số loài ong không ngòi đốt 7 1.5.1. Hoạt tính kháng ung thư của keo ong loài Trigona laeviceps ở Thái Lan 7 1.5.2. Hoạt tính kháng khuẩn của keo ong của loài Trigona sp. ở Ấn Độ 8 1.5.3. Hoạt tính kháng khuẩn của keo ong của một số loài thuộc chi Melipona 8 1.5.4. Hoạt tính kháng tăng trưởng các dòng tế bào ung thư của keo ong không ngòi đốt loài Melipona scutellaris ở Brazil 9 1.5.5. Một số hoạt tính sinh học của keo ong loài Melipona orbignyi ở Brazil 9 2. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ TUYẾN TỤY 9 2.1. Giới thiệu về ung thư tuyến tụy 9 2.1.1. Tụy và ung thư tuyến tụy 9 2.1.2. Phân loại ung thư tuyến tụy 10 2.1.3. Các phương pháp điều trị ung thư tuyến tụy 11 2.1.3.1. Hóa trị 11 ii 2.1.3.2. Xạ trị 11 2.1.3.3. Phẫu thuật 11 2.1.3.4. Phương pháp hỗ trợ điều trị 12 2.1.4. Một số dòng tế bào ung thư tuyến tụy 12 2.2. Một số hợp chất phân lập từ tự nhiên có khả năng kháng ung thư tuyến tụy trên dòng tế bào PANC-1 -1 13 2.2.1. 13 2.2.2. 14 2.2.3. 15 2.3. Phương pháp thử hoạt tính kháng ung thư tuyến tụy 17 2.3.1. Nguyên tắc 17 2.3.2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư 18 2.3.2.1. Khả năng gây độc tế bào ung thư 18 2.3.2.2. Giá trị PC 50 và cách xác định giá trị PC 50 18 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI THỰC NGHIỆM 3. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 19 3.1. Hóa chất 19 3.2. Dụng cụ 19 3.3. Thiết bị 20 4. QUY TRÌNH THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ TUYẾN TỤY 20 4.1. Chuẩn bị hóa chất 20 4.2. Nuôi cấy tế bào 21 4.3. Quy trình thử hoạt tính 21 5. PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÖC CÁC HOẠT CHẤT TỪ CAO HEXANE CỦA KEO ONG LOÀI TRIGONA MINOR 21 5.1. Nguyên liệu 21 5.2. Ly trích và điều chế cao thô 21 5.3. Phân lập các hoạt chất từ phân đoạn cao hexane 22 5.3.1. Phân đoạn B 24 5.3.2. Phân đoạn D 24 iii 5.3.3. Phân đoạn H 24 5.3.4. Phân đoạn I 28 5.3.5. Phân đoạn J 30 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 6. BIỆN LUẬN CẤU TRÖC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 33 6.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập được 33 6.2. Hợp chất 1 34 6.3. Hợp chất 2 36 6.4. Hợp chất 3 39 6.5. Hợp chất 4 41 6.6. Hợp chất 5 43 6.7. Hợp chất 6 47 6.8. Hợp chất 7 49 6.9. Hợp chất 8 53 6.10. Hợp chất 9 55 6.11. Hợp chất 10 59 7. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ TUYẾN TỤY 61 7.1. Kết quả thử hoạt tính của các mẫu cao 61 7.2. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập được 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 8. KẾT LUẬN 63 9. KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 70 iv ốt loài Trigona minor , trong đó có ba hợp chất mớ trigonol A (5), trigonone A (7) và trigonol B (9 , cùng với 7 hợp chấ (1), mangiferolicacid (2), 23-hydroxymangiferonicacid(3), 23-hydroxymangiferolicacid(4), 27-hydroxymangiferonicacid(6), 27- hydroxymangiferolicacid (8), và 27-hydroxyisomangiferolicacid (10 h . Các hợp chất này được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy trên dòng PANC-1 3, 5, 7-10 hoạt tính mạnh, với giá trị PC 50 lần lượt là 32.3, 52.8, 25.3, 52.1, 31.8 và 31.0 µM. 1, 2, 4 6 100µM - -1. Từ khóa: Trigona minor, keo ong, triterpene khung cycloartane, PANC-1, PSN-1 v ABSTRACT From the ethanolic extract of the propolis of Trigona minor, three new cycloartane-type triterpenes named trigonol A (5),trigonone A (7), and trigonol B (9), together with seven known cycloartane-type triterpenes, including mangiferonic acid (1), mangiferolicacid (2), 23-hydroxymangiferonicacid(3), 23- hydroxymangiferolicacid(4), 27-hydroxymangiferonicacid(6), 27- hydroxymangiferolicacid (8), and 27-hydroxyisomangiferolicacid (10) have been isolated. Their chemical structures were determined by extensive NMR spectroscopic analysis. All compounds were tested for preferential cytotoxicity against PANC-1 human pancreatic cell line in the nutrient starvation condition (NDM). Among them, compounds 3, 5, 7-10 showed potent preferentially cytotoxic candidates with PC 50 values of 32.3, 52.8, 25.3, 52.1, 31.8 and 31.0 µM, respectively. However, compounds 1, 2, 4 and 6displayed weak cytotoxicityagainst both PANC-1 and PSN-1 cells at a concentration of 100 µM. Keywords: Trigona minor, propolis, cycloartane-type triterpenes, PANC-1, PSN- 1 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT MeOH : methanol EtOH : ethanol EtOAc : ethyl acetate MeCN : acetonitrile CDCl 3 : deuterated chloroform DMSO-d 6 : deuterated dimetylsufoside NMR : Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (phổ cộng hưởng từ hạt nhân) 1 H-NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân của 1 H 13 C-NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân của 13 C DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer COSY : COrrelation SpectroscopY (phổ tương quan giữa 1 H- 1 H) HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation spectroscopy (phổ tương quan giữa 1 H- 13 C qua 1 nối) HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation spectroscopy (phổ tương quan giữa 1 H- 13 C qua 2, 3 nối) NOESY : Nuclear Overhause Effect Spectroscopy (phổ tương quan giữa 1 H- 1 H trong bán kính 5Å) HR-MS : High Resolution Mass Spectroscopy (phổ khối lượ ) δ H , δ C : độ dịch chuyển hóa học của 1 H, 13 C s : singlet (mũi đơn) d : doublet (mũi đôi) dd : doublet of doublets (mũi đôi - đôi) vii t : triplet (mũi ba) m : multiplet (mũi đa) br : broad (mũi bầu) J : hằng số ghép Hz, MHz : hertz, megahertz ppm : part per million EC 50 : Effective Concentration (nồng độ ức chế 50 % vi khuẩn) IC 50 : Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế 50 % enzyme) PC 50 : Preferential Cytotoxicity (nồng độ gây độc 50 % tế bào ung thư) PC 100 : Preferential Cytotoxicity (nồng độ gây độc 100 % tế bào ung thư) PTLC : Preparative Thin Layer Chromatography (sắc ký bản mỏng điều chế) CCNP : Column Chromatography Normal Phase (sắc ký cột pha thường) DNA : DeoxyriboNucleic Acid MTT : 3-(4,5-diMethyl-2-Thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-Tetrazolium bromide DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (môi trường nuôi cấy tế bào có dinh dưỡng) NDM : Nutrient Deprived Medium (môi trường nuôi cấy thiếu dinh dưỡng) FBS : Fetal Bovine Serum (huyết thanh bào thai bò) PBS : Phophates Buffer Saline (đệm phosphate) HEPES : 4-(2-HydroxyEthyl)-1-PiperazinEthanSulfonic acid MEM : MinimumEssentialMedium (môi trường cần thiết tối thiểu) MIC : Minimum Inhibitory Concentration (nồng độ chất ứcchế tối thiểu) MBC : Minimum Bactericidal Concentration (nồng độ diệt khuẩntốithiểu) MFC : Minimum Fungicidal Concentration (nồng độ diệt nấm tối thiểu) TGI : Total Growth Inhibition(tổng nồng độ ức chế tăng trưởng) [...]... tụy thư ng gặp: PANC- 1: ung thư biểu mô tuyến trên ống tụy PSN- 1: ung thư biểu mô tuyến trên tụy BxPC- 3: ung thư biểu mô tuyến trên tụy Capan- 1: di căn gan của ung thư biểu mô tuyến trên tụy PL4 5: chủ yếu ở ung thư biểu mô tuyến trên gốc ống tụy AsPC- 1: do sự ghép mô giữa chuột không lông v i tế bào cổ trướng ở ngư i bị ung thư tuyến tụy 12 Trong đó, dòng tế bào PANC- 1 được tách ra và nu i dưỡng từ biểu... hoạt tính sinh học thu được hợp chất arctigenin rất mạnh trên các dòng tế bào PANC- 1, PSN- 1, AsPC -1 , BxPC-3 cho giá trị PC100 chỉ ở khoảng 0. 01 g mL -1 30 15 Hình 13 Cấu trúc của arctigenin Garcinia huillensis Công Gô:Dịch trích CHCl3 từ cây Garcinia huillensis (một lo i cây thuốc ở Công Gô) có khả năng dòng tế bào tuyến tụy PANC- 1 v i PC50 là 1. 8 g mL -1 trong i u kiện NDM Kết quả phân lập cao CHCl3... cả các lo i ong Phân họ ong mật có bốn tông đáng chú ý l : tông Apini (ong mật), tông Meliponini (ong không ng i đốt), tông Bombini (ong nghệ) và tông Euglossini (ong phong lan) .1 1.2 Các chi chính của lo i ong không ng i đốt Tông Meliponini có khoảng 23 chi và 18 phân chi, bao gồm 374 lo i (2000).Trong đó có hai chi lớn là TrigonavàMelipona, ngo i ra còn có các chi và phân chi ít phổ biến hơn nh :. .. μg mL -1 , 1 μg mL -1 đ i v i mẫu cao và 10 0 μM, 10 μM, 1 μM đ i v i mẫu chất 20 Thuốc thử MTT v i nồng độ 1 mg mL -1 được pha trong m i trường DMEM 4.2 Nu i cấy tế bào Các tế bào ung thư tuyến tụy PANC- 1 -1 được cấy trong đĩa nu i 96 giếng (có khoảng 10 4 tế bào trong một giếng, một số giếng sẽ không cho tế bào ung thư để làm mẫu trắngcho các mẫu thử) và ủ trong m i trường có dinh dưỡng (DMEM) v i 10 %... cùng các cộng sự đã phân lập được 43 hợp chất, trong đó có 3 hợp chất m i lần đầu tiên được công bố .Các hợp chất phân lập từ keo ong đỏ Brazil được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy trên dòng PANC- 1, kết quả cho thấy có 7 hợp chất có giá trị PC100< 10 0 µM, đặc biệt hợp chất (6aR ,11 aR )-3 ,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan có giá trị PC100 thấp nhất là 12 .5 µM (hình 8), cùng v i chất đ i chứng... là hai hợp chất phenylpropanoid acid: 6-O-p-coumaroyl-D-galactopyranose (17 ), 6-Ocinnamoyl -1 - O-p-coumaroyl-β-D-glucopyranose (18 ) và các hợp chất flavonoid: 7methoxynaringenin (19 ), 7-methoxyaromadendrin (20), 7,4'-dimethoxyaromadendrin ( 21) , 4'-methoxykaempferol (22), 3-methoxyquercetin (23), 5-methoxyaromadendrin (24), 5'-methoxykaempferol (25), trong đó hợp chất 17 là hợp chất m i lần đầu tiên được... Freitas cùng các cộng sự, mẫu keo ong của lo i T spinipesđược lấy ở miền Bắc Brazil vào năm2008 đã phân lập được 7 hợp chất (hình 1) Đặc trưng là các hợp chất triterpene khung cycloartane, trong đó hai hợp chất 3 mangiferolic acid (1) và 3β-hydroxy-24-methylencyloartan-26-oic acid (2) lần đầu tiên được tìm thấy trong trong keo ong lo i này(hình 1) Hình 1 Cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ keo ong. .. kháng ung thƣ tuyến 2.2 tụy trên dòng tế bào PANC- 1 -1 2.2 .1 Keo ong Mexico: Mẫu keo ong được lấy ở Caborca, bang Sonora, Mexico vào tháng 5 năm 19 99 Feng Li và các cộng sự đã phân lập được 46 hợp chất, trong đó có 5 hợp chất m i thuộc khung flavonoid lần đầu tiên được công bố Tất cả 46 hợp chất được phân lập từ keo ong Mexicođã được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy trên dòng PANC- 1, kết... mô của tuyến tụy (ung thư ngo i tiết), ngo i ra còn có ung thư n i tiết ít phổ biến hơn Ung thƣ ngo i tiết (exocrine cancer ): các tế bào bị ung thư là những tế bào ở mặt trong ống tụy giúp sản xuất các dịch tiêu hóa còn được g i là ung thư biểu mô của tuyến tụy Đây là một lo i kh i u biểu mô ác tính, lo i ung thư có khả năng di căn nhiều nhất Vào th i i m chẩn đoán, hầu hết các trường hợp ung thư đều... gi i (hình 4).9 1. 4.4 Thành phần hóa học của keo ong lo i Melipona interrupta ở Brazil Mẫu keo ong được Ellen Cristina Costa da Silva và cộng sự lấy t i Manaus – AM, Brazil vào năm 2 011 Từ mẫu keo ong của lo i M interruptađ phân lập được 4 hợp chất flavonoid: 5,7,4'-trihydroxyflavone (26), 3,5,6,7,4'-pentahydroxyflavone(27), naringenin-4'-O-β-D-glucopyranoside (28), myricetin-3-O-β-D-glucopyranoside . Phân lập 10 hợp chất tinh khiết từ keo ong Trigona minor . Phân lập 10 hợp chất tinh khiế . 2-5 Hợp chất có khả tế bào ung thư - PSN -1 50 < 10 0 µM. 6 Hợp chất có khả tế bào ung thư -1 50 <. tụy 9 2 .1. 1. Tụy và ung thư tuyến tụy 9 2 .1. 2. Phân lo i ung thư tuyến tụy 10 2 .1. 3. Các phương pháp i u trị ung thư tuyến tụy 11 2 .1. 3 .1. Hóa trị 11 ii 2 .1. 3.2. Xạ trị 11 2 .1. 3.3. Phẫu. 6-O-p-coumaroyl-D-galactopyranose (17 ), 6-O- cinnamoyl -1 - O-p-coumaroyl-β-D-glucopyranose (18 ) và các hợp chất flavonoid: 7- methoxynaringenin (19 ), 7-methoxyaromadendrin (20), 7,4'-dimethoxyaromadendrin