i Tóm tắt Đặt vấn đề Phát hiện và định lượng HIV1RNA là một nhu cầu rất cần thiết để có thể chẩn đoán phát hiện sớm nhiễm HIV trong giai đoạn cửa sổ hay trẻ sơ sinh và nhũ nhi cũng như để theo dõi hiệu quả điều trị trên các bệnh nhân HIV/AIDS đang được điều trị đặc hiệu. Nhu cầu này có thể giải quyết được bằng các bộ xét nghiệm dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử như PCR và bDNA đã được chấp nhận IVD và có trên thị trường. Tuy nhiên giá thành của các bộ xét nghiệm này là khá cao, khó có thể đưa vào áp dụng tại các phòng thí nghiệm lâm sàng tại các quốc gia thu nhập thấp như Việt Nam chúng ta. Mục tiêu Có 2 mục tiêu chính: (1) Xây dựng được qui trình xét nghiệm phát hiện và định lượng HIV1RNA dựa trên kỹ thuật RT real-time PCR, đặt tên là HIV1 RT-TQPCR, sử dụng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng gene gag trên bộ gene HIV1; (2) Đánh giá qui trình xét nghiệm thông qua đánh giá giới hạn phát hiện, khoảng định lượng, độ chính xác qua độ lặp lại, độ bền trong lưu trữ, và độ nhạy cảm cùng độ lặp lại cũng như độ tương đồng khi thử trên mẫu thật so sánh với bộ HIV1 Amplicor làm chuẩn vàng. Vật liệu và phương pháp Qui trình xét nghiệm “HIV1 RT-TQPCR” được xây với mồi SK462 và SK431 đặc hiệu gene gag đã công bố và taqman probe được thiết kế từ sự biến đổi probe SK101 cũng đã được công bố. Các chứng dương HIV1RNA và các mẫu chuẩn định lượng là RNA phiên mã từ plasmid pGEM-T Easy đã chèn sản phẩm PCR đích nhân bản từ chính gene gag sử dụng mồi SK462 và SK431. Chứng nội sử dụng chung mồi là được phiên mã từ plasmid pGEM-T Easy đã chèn sản phẩm PCR khuếch đai từ các sợi Oligo có trình tự hai đầu bắt cặp bổ sung được với trình tự hai mồi SK462 và SK431 nhưng trình tự probe là khác biệt. Bộ tách chiết RNA sử dụng bộ NK RNAPREP của Nam Khoa và bộ tổng hợp cDNA sử dụng bộ NK cDNA synthesis của Nam Khoa. Giới hạn phát hiện, khoảng định lượng, độ lặp lại liên phản ứng cũng như trong phản ứng được thực hiện trên các dãy pha loãng của chứng dương HIV1RNA. Độ đặc hiệu được đánh giá trên các mẫu huyết thanh người bị nhiễm HBV, HCV, CMV và S. aureus xác định bằng PCR hay nuôi cấy. Khả năng chống ức chế được thử trên các chất có khả năng ức chế PCR như hemoglobin, lamivudine, BSA, và DNA bạch cầu người. Độ bền trong lưu trữ được thử trên các mẫu nhiễm HIV1RNA và theo dõi trong 12 tháng với thử nghiệm mỗi 4 tháng một lần. Thử nghiệm trên các mẫu thật được thực hiện có so sánh với thử nghiệm sử dụng bộ xét nghiệm Amplicor. Kết quả và bàn luận Đã hoàn thiện qui trình thử nghiệm HIV1 RT-TQPCR phát hiện và định lượng HIV1RNA bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng mồi và taqmanprobe đặc hiệu gene gag của HIV1 genome. Qui trình xét nghiệm này có cung cấp cả chứng [+] và các chuẩn định lượng dưới dạng RNA do vậy mà có thể đánh giá được độ nhạy của bộ xét nghiệm cũng như cho được đường chuẩn thật sự từ mẫu chuẩn là RNA. Qui trình xét nghiệm cũng cung cấp cả chứng nội tại dưới dạng RNA sử dụng chung mồi với trình tự đích nhưng dùng taqman probe để phát hiện có trình tự và màu huỳnh quang khác biệt taqman probe đích nhờ vậy mà đánh giá được nguy cơ mẫu bị ức chế khi kết quả phát hiện đích âm tính. Các kết quả đánh giá cho thấy qui trình xét nghiệm có giới hạn định lượng thấp nhất, còn gọi là độ nhạy, là 60 copies HIV1RNA trong 1ml huyết tương; khoảng định lượng là 10 2 -10 8 copies/ml; độ ổn định trong phản ứng và liên phản ứng cao đối với các mẫu có giá trị định lượng từ 100copies/ml trở lên; độ bền trong lưu trữ ít nhất là 12 tháng; không bị chéo với các tác nhân vi sinh khác; có khả năng chống ức chế; và so sánh với bộ xét nghiệm đã được FDA công nhận IVD là HIV1 Amplicor khi thử trên các mẫu thật cho kết quả lương tương đương và nếu lấy kết quả xét nghiệm từ bộ xét nghiệm Amplicor làm chuẩn vàng thì độ nhạy và độ đặc hiệu của qui trình xét nghiệm đạt 100%. Kết luận Dựa vào kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đã xây dựng hoàn thiện qui trình phát hiện và định lượng HIV1 trong huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR với các thành phần cần thiết cho một xét nghiệm real-time PCR như bộ tách chiết RNA sử dụng bộ NK RNAPREP của Nam Khoa và bộ tổng hợp cDNA sử dụng bộ NK cDNA synthesis của Nam Khoa, bộ khuếch đại và định lượng, các bộ chứng và chuẩn định lượng. Đồng thời từ việc đánh giá qui trình xét nghiệm HIV1 RT-TQPCR phát hiện và định lượng HIV1RNA chúng tôi thu được các thông số như sau: (1) độ nhạy là 100% (2) độ đặc hiệu: 100% (3) ngưỡng phát hiện: 60 copies/ml huyết tương (4) khoảng định lượng là 10 2 -10 8 copies/ml (5) độ bền trong lưu trữ ít nhất là 12 tháng (6) có khả năng chống ức chế. Tuy nhiên để có thể đăng ký được chấp nhận IVD thì cần phải có thêm kinh phí để thử trên các trung tâm đạt chuẩn ISO 15189 làm xét nghiệm phát hiện và định lượng HIV1RNA trong chẩn đoán. ii Abstract Background Detection and quantification of HIV1RNA is the necessary requirement from the clinical to detect HIV infection during the window phase or to confirm the HIV infection in the baby, as well as to follow up the efficacy of the specific treatment. These requirements could be solved by the using of the IVD approved kits using PCR or bDNA technologies. However the price of these commercialized kits are very expensive, it could not be easily applied at the clinical laboratory in the existing conditions of the low-income countries like Vietnam. Main aims There are two main aims: (1) Prepare the molecular biology kit named HIV1 RT-TQPCR kit, to detect and quantify of the HIV1RNA based on the RT real-time PCR technology using the primers and taqman probe specific the gag gene on the HIV1 genome; (2) Evaluate the process via the limit of detection, the range of quantification, the accuracy, the specificity, the elimination of the inhibitors, and the stability of the kits as well as the sensitivity-specificity and the similarity when testing on the real samples using HIV1 Amplicors as gold standards. Materials and methods The “HIV1 RT-TQPCR” was prepared using the published SK462 and SK431 specific to gag gene, and the taqman probe was designed from the modification of the published probe SK102. The positive control HIV1RNA and the standards for quantification was prepared from the transcription of the plasmid pGEM-T Easy inserted with the PCR product amplified from the gag gene using primers SK462 and SK431. The internal control RNA using the same primers of the target was also prepared from the transcription of the plasmid pGEM-T Easy inserted with the PCR product amplified from the two constructed oligo with SK462 and SK431 sequence at the 5’end and the middle sequence complementary with the internal control probe. The RNA extraction kit is the NK RNAPREP of Nam Khoa and the cDNA synthesis kit is the NK cDNA synthesis kit of Nam Khoa. The limit of detection, the range of quantification, the in testing and the trans-testing reproductibility were tested on the serial dilution of HIV1RNA. The risk of the cross reaction were tested on the sera taken from HCV, HBV, CMV infection patients confirmed by PCR, and the sera taken from the S. aureus septicemia patient. The elimination of the inhibitors were tested of the hemoglobin, BSA, leukocyte DNA and the lamuvidine. The stability of the kit was tested during 12 months with interval 4 months on the plasma samples pooled HIVRNA.The clinical trial was done on real plasma sample collected fron HIV infected and non infected patients and the results were analyzed versus the results get from HIV1 amplicor. Results and discussions The process named HIV1 RT-TQPCR to detect and quantify of the HIV1RNA based on the RT real-time PCR technology using the primers and taqman probe specific the gag gene on the HIV1 genome was prepared. Since the process supplied the control [+] and the standards under the RNA, the users could analyzed the real sensitivity of the testing and the test kit as well as the real quantification graph coming from the RNA not the cDNA. The internal control was also supplied under the RNA using the sample primers of the target but the detection probe was difference by the sequence and the fluorophore and this design can help to user monitor the inhibitors in the sample with HIV1RNA detection negative. The evaluation results demonstrated that the limit of detection of the process is 60 copies/ml;, the range of the quantification was 10 2 -10 8 copies/ml; the reproductivity was high with the quantification from 100 copies/ml; the stability of the kit was at least 12 months; no cross reaction with HBV, HCV, CMV, and S.aureus; the inhibitors was eliminated by testing with the kit; and the process gave the same results as the FDA approved for IVD kit, HIV1 Amplicor, when testing on the real samples HIV [+] and HIV [-] with sensitivity and specificity 100% if the Amplicor was considered as gold standards. Conclusion Based on the results of the research we have complete the process with the necessary ingredients for a real-time PCR tests as the RNA extraction kit and the cDNA synthesis kit, amplification, positive control and internal control. At the time of the evaluation of HIV1 RT-TQPCR tests, we obtained the following parameters: (1) sensitivity: 100% (2) specificity: 100% (3) threshold detection: 60 copies/ml plasma (4) the amount is about 10 2 - 10 8 copies/ml (5) durability in storage for at least 12 months (6) is resistant to inhibition. However, in order to be approved as the IVD kit,the more funding will be needed to try the kit in the laboratories ISO 15189 certified for testing of HIV1RNA detection and quantification for clinical apliucations. iii STT MỤC LỤC Trang PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1 PHẦN 2 ĐẶT VẤN ĐỀ 2 PHẦN 3 TỔNG QUAN 3 1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giớ và tại Việt Nam 3 1.1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới 3 1.2 Tình hình nhiễm HIV tại Việt Nam 3 2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA HIV 4 2.1 Một số đặc điểm sinh học của HIV 4 2.2 Các type di truyền của HIV 4 2.3 Cấu trúc HIV 6 2.3.1 Hình thể và cấu tạo virus 6 2.3.2 Cấu trúc gene HIV 7 2.4 Sức đề kháng của virus HIV 7 3 TIẾN TRÌNH TỪ LÚC NHIỄM HIV TỚI AIDS 7 3.1 Nồng độ HIV-1 tự do và kháng nguyên p24 trong huyết tương 8 3.2 Sự xuất hiện của các kháng thể kháng HIV-1 trong huyết thanh của bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS 8 3.3 Lượng tế bào miễn dịch T CD4 8 3.4 Các xét nghiệm được sử dụng để phát hiện và theo dõi nhiễmHIV/AIDS 9 4 PHƯƠNG PHÁP REALTIME – PCR 9 4.1 Khái niệm real-time PCR 9 4.2 Real-time PCR ứng dụng định lượng tác nhân vi sinh vật trong mẫu thử 14 5 CHỨNG DƯƠNG, ÂM VÀ CHỨNG NỘI TẠI 15 5.1 Chứng dương 15 5.2 Chứng âm 16 5.3 Chứng nội tại 16 6 PHƯƠNG PHÁP TẠO DÒNG 17 6.1 Mục đích của sự tạo dòng 17 6.2 Các bước cơ bản của phương pháp tạo dòng 17 PHẦN 4 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ĐƯỢC SỬ DỤNG 20 2.1 Tách chiết RNA với bộ thuốc thử “ NK RNAPREP” của Nam Khoa 20 iv 2.1.1 Nguyên tắc 20 2.1.2 Phương pháp 20 2.2 Tổng hợp cDNA từ tách chiết RNA với bộ thuốc thử “ NK cDNA synthesis” của Nam Khoa 20 2.2.1 Nguyên tắc 20 2.2.2 Phương pháp 21 2.3 Tinh sạch sản phẩm PCR với bộ thuốc thử “Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System” của Promega 21 2.3.1 Nguyên tắc 21 2.3.2 Phương pháp 21 2.4 Tạo vi khuẩn E. coli khả biến 22 2.4.1 Nguyên tắc 22 2.4.2 Phương pháp 22 2.5 Tạo dòng với hệ thống “pGEM®-T Easy” của Promega 23 2.5.1 Nguyên tắc 23 2.5.2 Phương pháp 23 2.6 Tách chiết plasmid với bộ thuốc thử “Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification system” của Promega 25 2.6.1 Nguyên tắc 25 2.6.2 Phương pháp 25 2.7 Phiên mã DNA thành RNA 26 2.7.1 Nguyên tắc 26 2.7.2 Phương pháp 27 3 PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HIV1 28 3.1 Mồi và Taqman probe 28 3.1.1 Mồi 28 3.1.2 Taqman probe 28 3.2 Thiết kế các thành phần của qui trình thử nghiệm real-time PCR phát hiện và định lượng HIV1RNA 28 3.3 Phương pháp pha chế HIV1-TQPCR master mix 29 3.4 Phương pháp pha chế các chứng và chuẩn 30 3.4.1 Chế tạo chứng dương HIV1RNA-C[+] và chuẩn định lượng HIV1-RNA 30 3.4.2 Chế tạo chứng nội HIV1RNA-IC 31 3.4.3 Mẫu huyết tương người bình thường 33 4 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR 33 v TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 4.1 Các chỉ tiêu phải đánh giá 33 4.2 Phương pháp đánh giá 34 4.2.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 34 4.2.2 Độ lặp lại trong phản ứng 34 4.2.3 Độ lặp lại liên phản ứng 35 4.2.4 Độ đặc hiệu 35 4.2.5 Khả năng chống ức chế 36 4.2.6 Độ ổn định trong điều kiện bảo quản 36 5 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR THỰC HIỆN TRÊN MẪU THẬT 37 5.1 Đối tượng được sử dụng để đánh giá 37 5.2 Phương pháp đánh giá 37 PHẦN 5 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39 1 KẾT QUẢ PHA CHẾ CÁC THÀNH PHẦN CỦA QUI TRÌNH THỬ NGHIỆM REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HIV1RNA 39 1.1 Kết quả đánh giá khả năng sử dụng mồi và probe đặc hiệu gene gag của HIV1 qua kết quả pha chế HIV1-TQPCR master mix 39 1.2 Kết quả chế tạo chứng dương HIV1RNA-C[+] 39 1.3 Kết quả chế tạo chứng nội HIV1RNA-C[+] 40 1.4 Kết quả chứng minh chứng nội HIV1RNA-C[+] pha ở nồng độ 100 copies/10µl là không cạnh tranh hệ thống đích 40 2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH THỬ NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 41 2.1 Kết quả đánh giá giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 41 2.2 Kết quả đánh giá độ lặp lại trong phản ứng 41 2.3 Kết quả đánh giá độ lặp lại liên phản ứng 42 2.4 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu 44 2.5 Kết quả đánh giá khả năng chống ức chế 44 2.6 Kết quả đánh giá độ ổn định trong bảo quản 45 3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR THỰC HIỆN TRÊN MẪU THẬT 46 4 QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1RNA RT-TQPCR VỚI CÁC THÀNH PHẦN VÀ HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG 47 vi 4.1 Tên qui trình thử nghiệm và thành phần 47 4.2 Lưu trữ 48 4.3 Phạm vi áp dụng 48 4.4 Nguyên tắc hoạt động của qui trình thử nghiệm 48 4.5 Trang bị cần thiết 49 4.6 Phương pháp 50 4.6.1 Mẫu thử 50 4.6.2 Phương pháp 50 PHẦN 6 KẾT LUẬN 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 57 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT AIDS Acquired Immuno Deficiency Virus ARV Anti-retrovirus bp Base pair CDC Centers for Diseases & Prevention Ct Threshold Cycle cDNA complementary deoxyribonucleic acid DNA Deoxyribonucleic acid dATP 2’-deoxyadenosine 5’- triphosphate dTTP 2’-deoxythymidine 5’- triphosphate dCTP 2’-deoxycytidine 5’- triphosphate dGTP 2’deoxyguanosine 5’- triphosphate dNTP 2’-deoxynuclosid 5’- triphosphat ELISA Enzyme – Linked Immunosorbent Assay HIV-1 Human Immunodeficiency Virus type 1 IC Internal Control OD Optical Density PCR Polymerase chain reaction Realtime PCR Realtime Polymerase chain reaction RNA ribonucleic acide RT-PCR reverse transcriptase- polymerase chain reaction UNIADS Joint Unitied Nations Programme on HIV/AIDS Taq Thermus aquaticus SIV Simian Immunodeficiency Virus WHO World Heath Organization CV Coeficient of variation SOC Super Optimal Catabolite Repression Broth IPTG isopropyl-β-D-thiogalactoside X- gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- galactoside viii DANH SÁCH BẢNG Số TÊN BẢNG SỐ LIỆU Trang 1 Thể tích của các thành phần được lấy từ các nồng độ hay hàm lượng gốc để pha được các HIV1-TQPCR mastermix cho 10 mix – 50 mix hay 100 mix 29 2 Giá trị định lượng HIV1RNA trong 3 dãy pha loãng và giá trị CV 42 3 Giá trị định lượng HIV1RNA trong 3 dãy pha loãng thực hiện trong 3 ngày liên tiếp và giá trị CV 44 4 Giá trị định lượng HIV1RNA trong từng cặp mẫu co và không có thêm chất ức chế 45 5 Giá trị định lượng HIV1RNA trong 2 mẫu 10 3 và 10 7 thực hiện trong 4 lần cách nhau 4 tháng và giá trị CV 46 6 Giá trị định lượng HIV1RNA trong 44 mẫu HIV1-RNA dương tính và định lượng được với kit Amplicor và giá trị CV khi so với HIV1 RT- qPCR 47 ix DANH SÁCH HÌNH Số TÊN HÌNH ẢNH Trang 1 HIV mô tả từ máy tính 4 2 Hình chi tiết của virus HIV 7 3 Hình ảnh cấu trúc của virus HIV 7 4 Vị trí của các gene trong bộ gene HIV 7 5 Cơ chế hoạt động của SYBR I (1) Khi chưa có sản phẩm khuếch đại thì ống thứ nghiệm không phát được hùynh quang khi nhận được ánh sáng kích thích, (2) Nhưng khi có hiện diện của sản phẩm khuếch đại thì SYBR I chèn vào và tập trung trên phân tử DNA , làm cho ống phản ứng bị phát huỳnh quang khi nhân được ánh sáng kích thích 9 6 Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong real-time PCR 10 7 Tóm tắt cơ chế họat động của Beacon probe trong real-time PCR 11 8 Tóm tắt cơ chế hoạt động của probe lai trong real-time PCR 12 9 Biển đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận ánh sánh kích thích ở mỗi chu kỳ nhiệt 12 10 Biểu đồ khuếch đại vẽ lên các đường biểu diễn khuếch đại của các mẫu thử và các mẫu chuẩn 13 11 Biển đồ chuẩn vẽ lên đường biểu diễn chuẩn về mối quan hệ giữa số lượng bản DNA đích có trong các mẫu chuẩn và chu kỳ ngưỡng tương ứng. Trong biểu đồ ở trên này, chúng ta E2-E4-E7 là các ống phản ứng chứa các mẫu chuẩn còn B4 là ống phản ứng chứa mẫu thử 14 12 Nguyên tắc tổng hợp cDNA từ RNA 20 13 Bản đồ gene của plasmid pGEM-T Easy với vị trí chèn DNA ngay bên trong gene lacZ 23 14 Plasmid pGEM-T Easy được chèn trình tự DNA sẽ được enzyme cắt giới hạn NdeI cắt ở đầu SP6 NdeI được sử dụng vì enzyme này chỉ cắt được một điểm ở đầu SP6 và không cắt được đoạn DNA đã được chèn vào pGEM-T Easy 27 15 Nhờ men T7 RNA polymerase mà DNA được chèn vào plasmid pGEM-T Esay sau khi duỗi thẳng được phiên mã thành chứng nội tại RNA 28 16 Biểu đồ khuếch đại các pha loãng “HIV1DNA đích” cho vào các HIV1- TQPCR mix. Kết quả cho thấy các đường khuếch đại có Ct cách đều nhau khoảng 3-4 chu kỳ. Sơ bộ cho phép kết luận là HIV1-TQPCR mix hoạt động được mà không cần phải thiết kế lại primers và taqman probe 39 17 (A) Hình bên trái là kết quả điện di chip cho thấy lane 1 là sản phẩm PCR đích của HIV1 kích thước 140bps khuếch đại từ gene gag của HIV1 genome trích từ huyết thanh người nhiễm HIV có HIV1RNA [+], và lane 2 là sản phẩm chứng dương HIV1RNA-C[+] kích thước 240 bases phiên mã từ 40 x plasmid pGEM-T Eseay chèn sản phẩm PCR. (B) Hình bên phải là kết quả điện di chip sản phẩm HIV1DNA-IC kích thước 200bps (lane 1) và sản phẩm HIV1RNA-IC kích thước 300bps (lane 2) phiên mã từ plasmid pGEM-T Eseay chèn sản phẩm PCR 18 (A) Biểu đồ khuếch đại dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có (màu đỏ) và không có (màu xanh) cho thêm 10µl chứa 100 copies chứng nội HIV1RNA-IC trước khi tách chiết RNA để tổng hợp cDNA rồi chạy real-time PCR. Kết quả cho thấy cả hai dãy pha loãng ở nồng độ cuối đều cho tín hiệu khuếch đại, chứng tỏ chứng nội HIV1RNA-IC ở nồng độ 100 copies cho vào thể tích mẫu tách chiết đã không cạnh tranh với đích. (B) Biểu đồ khuếch đại của chứng nội HIV1RNA-IC trong các 5 mẫu HIV1RNA-C[+] có cho 10µl chứng nội vào mẫu, kết quả này chứng minh chứng nội thật sự được khuếch đại khi cho vào HIV1-TQPCR mix 41 19 Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm lượng copies 1 đến 10 10 copies trong 150µl huyết tương 41 20 Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn 3 dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm lượng copies 1 đến 10 8 copies trong 150µl huyết tương 42 21 Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm lượng copies 1 đến 10 8 copies trong 150µl huyết tương được làm xét nghiệm trong ngày 1 43 22 Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm lượng copies 1 đến 10 8 copies trong 150µl huyết tương được làm xét nghiệm trong ngày 2 43 23 Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm lượng copies 1 đến 10 8 copies trong 150µl huyết tương được làm xét nghiệm trong ngày 3 43 24 Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn 4 mẫu huyết tương dương tính HBV, HCV, CMV và S. aureus cho thấy không có tín hiêu khuếch đại dương tính cho HIV1RNA mà chỉ có tín hiệu khuếch đại dương tính cho chứng nội (HIV1RNA-IC) chứng tỏ các mẫu thất sự âm tính HIV1RNA. Các chuẩn định lượng cho đường khuếch đại màu đỏ 44 25 Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn 4 cặp mẫu huyết tương có pha loãng HIVRNA-C[+] và trong mỗi cặp có 1 mẫu thêm chất ức chế (đường màu đen) và 1 mẫu không thêm chất ức chế (đường màu xanh lá) 45 26 Kết quả biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn của xét nghiệm phát hiện HIV1RNA trong 2 mẫu 10 3 và 10 7 copies HIV1RNA có trong 150µl, thực hiện ngay sau khi pha. 45 27 Kết quả biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn của xét nghiệm phát hiện HIV1RNA trong 2 mẫu 10 3 và 10 7 copies HIV1RNA có trong 150µl, thực 45 [...]... phát hiện và định lượng HIV1 bằng kỹ thuật real-time PCR với giá thành phù hợp với người có thu nhập thấp như ở Việt Nam chúng ta Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và định lượng Human Immunodeficiency virus – 1 trong huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR Mục tiêu nghiên cứu tổng quát của đề tài là: Xây dựng quy trình phát hiện và định. .. định lượng Human Immunodeficiency Virus – 1 trong huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR Nội dung Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện Thu nhận mẫu huyết tương dương tính và âm 50 mẫu huyết tương dương tính và 20 tính với HIV bằng thử nghiệm ELISA mẫu huyết tương âm tính Thực hiện thử nghiệm với kits Qiagen với Xác định mẫu huyết tương dương tính huyết tương thu nhận được và âm tính với HIV1RNA... Khoa học – Công nghệ trẻ đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi thực hiện đề tài Xin chân thành cảm ơn quý cơ quan chủ quản đề tài: Sở khoa học và Công nghệ Tp Hồ Chí Minh đã đồng ý và cấp kinh phí cho tôi nghiên cứu đề tài này xii PHẦN 1 MỞ ĐẦU Tên đề tài Nghiên cứu xây dựng qui trình phát hiện và định lượng Human Immunodeficiency Virus – 1 trong huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR Chủ nhiệm... với HIV1RNA Nghiên cứu thiết kế các thành phần của quy Xây dựng được các thành phần của quy trình thử nghiệm trình thử nghiệm Xây dựng chứng dương và chứng nội tại Xây dựng được chứng dương và chứng nội tại Thực hiện thử nghiệm so sánh quy trình nghiên Thông số chất lượng của quy trình thử cứu với bộ Amplicor HIV1 Monitor nghiệm Hoàn thiện sản phẩm và nghiệm thu đề tài Qui trình hoàn thiện 1 PHẦN 2 ĐẶT... định lượng Human Immunodeficiency virus – 1 trong huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR 2 PHẦN 3 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU TÌNH HÌNH NHIỄM HIV TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM 1. 1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, vào thời điểm tháng 6 /19 94 trên thế giới có 985 .19 9 ca AIDS thì đến tháng 12 /19 96 có 22,5 triệu người nhiễm HIV và đến tháng 10 /19 99 có 33,4 triệu người. ..28 29 hiện sau 4 tháng bảo quản Kết quả biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn của xét HIV1RNA trong 2 mẫu 10 3 và 10 7 copies HIV1RNA có hiện sau 8 tháng bảo quản Kết quả biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn của xét HIV1RNA trong 2 mẫu 10 3 và 10 7 copies HIV1RNA có hiện sau 12 tháng bảo quản xi nghiệm phát hiện trong 15 0µl, thực 46 nghiệm phát hiện trong 15 0µl, thực 46 LỜI CẢM ƠN Xin... sớm và giúp ích cho quá trình theo dõi điều trị[35] Có nhiều công trình nghiên cứu và sáng chế liên quan đến các kỹ thuật phát hiện và địnhlượng HIV1 và cũng từ đó đã có những sản phẩm thương mại có liên quan như các bộ kit phát hiện và định lượng HIV1-RNA của Roche, của Abbott 1. 2 Tình hình nhiễm HIV tại Việt Nam Trường hơp nhiễm HIV đầu tiên ở nước ta phát hiện vào tháng 12 năm 19 90 tại thành phố Hồ... một lượng lớn bản sao Tùy thuộc vào tế bào chủ, người ta sử dụng một kỹ thuật chuyển thích hợp (5) Phát hiện dòng cần tìm trong thư viện gen: Để phát hiện đoạn cần tìm, người ta sử dụng một mẫu dò, mẫu dò có thể là một kháng thể đặc trưng cho protein mã hóa bởi gen cần tìm hoặc một trình tự DNA bổ sung cho gen cần tìm 18 PHẦN 4 1 1 .1 1.2 1. 3 1. 4 1. 5 1. 6 1. 7 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NỘI DUNG NGHIÊN CỨU... thước và trình tự khác biệt so với sản phẩm khuếch đại Chèn sản phẩm khuếch đại vào plasmid và ứng dụng kỹ thuật tạo dòng để tạo chứng nội tại HIV1RNA Sau khi xây dựng thành công kỹ thuật RT -PCR, chứng dương và chứng nội tại tối ưu các thành phần của Realtime PCR dùng TaqMan probe để phát hiện HIV -1 RNA thông qua việc đánh giá các chỉ tiêu sau: (1) Đánh giá giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. .. thì nên làm phương pháp định lượng tương đối Ví dụ định lượng HIV, HBV hay HCV trong các mẫu mô sinh thiết Định lượng tương đối cũng được sử dụng trong các nghiên cứu về ung thư để định lượng một biển hiện gene nào đó, hay cũng được sử dụng trong định lượng sản phẩm biến đổi gene 5 CHỨNG DƯƠNG, ÂM VÀ CHỨNG NỘI TẠI 5 .1 Chứng dương Chứng dương là trình tự DNA đích được cho vào PCR mix để cho sản phẩm . Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và định lượng Human Immunodeficiency virus – 1 trong huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR . Mục tiêu nghiên cứu tổng quát của đề tài là: Xây dựng. ĐẦU Tên đề tài Nghiên cứu xây dựng qui trình phát hiện và định lượng Human Immunodeficiency Virus – 1 trong huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR Chủ nhiệm đề tài Họ và tên: Nguyễn. tài là: Xây dựng quy trình phát hiện và định lượng Human Immunodeficiency virus – 1 trong huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR 3 PHẦN 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 TÌNH HÌNH NHIỄM