THÀNH ĐOÀN TP.HCM SỞ KH & CN TP.HCM CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ Báo cáo nghiệm thu đề tài : NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ GEN 5'-UTR VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN SỚM CSFV (CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS) GÂY BỆNH DỊCH TẢ HEO (Bản chỉnh sửa theo ý kiến Hội đồng nghiệm thu) CNÑT : CN Huỳnh Ngọc Vi Ca Cơ quan chủ trì : TT Phát triển KH&CN Trẻ Năm 2006 LỜI CẢM ƠN Chúng xin chân thành cám ơn Sở Khoa Học Công Nghệ Trung Tâm Phát Triển Khoa Học Công Nghệ Trẻ TĐ, Trung Tâm Khoa Học Công Nghệ Sinh học Trường ĐHKHTN, Tp.HCM giúp đỡ kinh phí tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Trần Linh Thước cho chúng em nhiều lời khuyên q báu suốt trình thực đề tài Xin cảm ơn anh Đinh Minh Hiệp, anh chị bạn đồng nghiệp giúp đỡ, động viên hoàn tất đề tài LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam nước nông nghiệp phát triển, nông dân có truyền thống chăn nuôi Gần đây, với nhu cầu phát triển xã hội, ngành chăn nuôi ngày phát triển, đặc biệt nuôi heo Do đó, việc kiểm soát bệnh chăn nuôi nhu cầu thiết Việt Nam có đầu heo khoảng 16 triệu con, chủ yếu dùng để tiêu thụ nước, chưa xuất chưa kiểm soát bệnh dịch tả heo số bệnh khác Vì vậy, vấn đề kiểm soát bệnh thú y nói chung, bệnh dịch tả heo nói riêng vấn đề cần giải nhằm thúc đẩy phát triển ngành chăn nuôi nước ta Bệnh dịch tả heo tồn 100 năm Hiện coi bệnh nguy hiểm cho ngành chăn nuôi heo Việc dùng kháng sinh để trị bệnh tác dụng, phòng ngừa vắc-xin biện pháp vệ sinh chuồng trại Bệnh gây chết hàng loạt, gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi heo năm, chiếm 50-60% thiệt hại chăn nuôi heo Một đặc điểm đáng lưu ý bệnh xảy âm ỉ, lẻ tẻ, triệu chứng bệnh tích không điển hình Diễn biến bệnh ngày phức tạp Những biểu lâm sàng bệnh tích không rõ ràng kết xét nghiệm bệnh dương tính (Nguyễn Lương Hiền, Ngô Thanh Long, 1999) Bệnh dịch tả heo Classical swine fever virus (CSFV), thuộc chi Pestivirus, gây Pestivirus xếp vào họ Flaviviridae (Mulphy et al., 1995), gồm loài virus gây bệnh cho heo động vật nhai lại, CSFV gây bệnh dịch tả heo, Bovine viral diarrhoea virus (BVDV) gây bệnh dịch tả bò Border disease virus (BDV) gây bệnh cho cừu Mặc dù việc phân loại Pestivirus chủ yếu dựa vào loài vật chủ bị nhiễm bệnh, có nhiều nghiên cứu cho thấy Pestivirus tính chuyên biệt vật chủ cao Cụ thể BVDV gây nhiễm không cho trâu bò mà gây nhiễm cho cừu; BDV gây nhiễm cho heo; CSFV chủ yếu gây bệnh cho heo thấy trâu bò dê Cũng có trường hợp người ta phát Pestivirus trâu hươu Để phát CSFV gây bệnh dịch tả heo sử dụng nhiều phương pháp khác dựa bệnh tích, tiêm truyền qua heo… Các phương pháp có nhược điểm phát bệnh có xuất triệu chứng lâm sàng Khi bệnh có nguy lây lan cao không đáp ứng yêu cầu kiểm soá t dịch bệnh Vì nhu cầu có phương pháp chẩn đoán, phát bệnh gây CSFV cách nhanh chóng, xác, độ tin cậy cao cấp bách cần thiết Hiện nay, phương pháp RT-PCR phương pháp chẩn đoán tổ chức Thú y giới (OIE) khuyến khích sử dụng có ưu điểm như: độ nhạy cao, cho kết nhanh, độ chuyên biệt cao, phát bệnh sớm chưa có biểu triệu chứng bệnh tích … Do vậy, phương pháp RT-PCR xem phương pháp chẩn đoán có nhiều tiềm ứng dụng việc thiết lập quy trình phát bệnh dịch tả heo phương pháp RT-PCR Việt Nam cần thiết Đồng thời, chẩn đoán phát CSFV, việc phân biệt xác bệnh CSFV hay loài khác chi Pestivirus gây thường gặp nhiều khó khăn Các phương pháp phát CSFV dựa nguyên tắc kháng nguyên – kháng thể không cho phép phân biệt CSFV BDV hay BVDV Thực tế, việc chẩn đoán, phát xác CSFV có ý nghóa quan trọng nhằm định hướng biện pháp xử lý tránh lây nhiễm, tiêu diệt ổ bệnh vắc-xin phòng chống Đáp ứng nhu cầu thực tiễn này, kỹ thuật RT-PCR ứng dụng nhằm phát nhanh chuyên biệt CSFV dựa trình tự 5’UTR Trong RNA gen virus CSFV, vùng 5’UTR vùng đặc trưng chuyên biệt cho CSFV Dựa vào trình tự 5’UTR người ta phân biệt CSFV với loài khác chi Pestivirus BDV, BVDV Vì vậy, phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu cho vùng 5'UTR CSFV cho phép chẩn đoán xác bệnh dịch tả heo Ngoài ra, khảo sát xác định trình tự vùng 5’UTR CSFV có ý nghóa lớn nghiên cứu phân loại CSFV Hiện nay, số trình tự 5’UTR số chủng CSFV chủng Alfort/187 (Switzerland), chủng C (Trung Quốc), … xác định công bố lưu trữ ngân hàng gen Tuy vậy, chưa có công bố trình tự 5’UTR CSFV phân lập Việt Nam Vì vậy, mục tiêu đề xác định trình tự 5’UTR chủng CSFV phân lập Việt Nam nhằm phục vụ cho nghiên cứu phân loại hỗ trợ cho phương pháp phát CSFV RT-PCR So sánh trình tự đoạn 5’UTR số chủng CSFV khác Ngân hàng gen Để thực mục tiêu này, tiến hành nội dung nghiên cứu bao gồm: - Thu nhận đoạn gen 5'UTR từ virus CSFV - Tạo dòng gen 5'UTR E coli - Giải trình tự gen 5'UTR, so sánh với trình tự công bố giới - Thiết kế mồi để phát CSFV RT-PCR - Xây dựng quy trình chẩn đoán sớm, nhanh, nhạy CSFV RT-PCR MỤC LỤC Danh mục chữ viết tắt Danh mục hình & bảng Phần I: Tóm tắt nội dung đề tài - 1.1 Mở đầu - 1.2 Tóm tắt tình hình nghiên cứu nước có liên quan - 1.3 Tóm tắt tình hình nghiên cứu nước có liên quan - 1.4 Mục tiêu đề tài - 1.5 Nội dung nghiên cứu - Phaàn II: Tổng quan tài liệu - 2.1 Tình hình bệnh dịch tả heo - 2.2 Sự lây nhiễm - 2.3 Triệu chứng lâm sàng - 2.4 Bệnh tích - 2.5 Đặc điểm virus dịch tả heo, Classical Swine Fever Virus – CSFV - 2.6 Các phương pháp chẩn đoán bệnh dịch tả heo - 11 2.7 Phương pháp RT-PCR - 14 2.8 Kó thuật tạo dòng - 20 Phaàn III: Vật liệu – Phương pháp - 26 3.1 Hoùa chất Môi trường - 26 3.2 Vật liệu Phương phaùp - 28 Phần IV: Kết – Biện luận - 42 4.1 Tạo dòng đoạn gen mã hóa vùng 5'UTR CSFV - 42 4.2 Giải trình tự đoạn gen 5’UTR - 45 4.3 Xây dựng quy trình phát CSFV RT-PCR - 49 4.4 Kiểm chứng quy trình phát CSFV phương pháp RT-PCR - 54 Phần V: Kết luận – Đề nghị - 60 5.1 Kết luận - 60 5.2 Đề nghị - 60 Phần VI: So sánh nội dung đăng ký kết đạt - 61 Phần VII: Các thành viên tham gia thực đề tài - 62 Phần VIII: Các công trình khoa học có liên quan đến đề tài - 63 Tài liệu tham khảo - 64 - DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp : Ampicillin BDV : Border disease virus bp : base pair, caëp base BVDV : Bovine viral diarrhoea virus cDNA : complementary DNA CSFV : Classical Swine Fever Virus ddNTP : dideoxyribonucleotide triphosphate dH2O : nước cất DNA : Deoxyribonucleic cid dNTP : Deoxynucleotide triphosphate DTT : Dithiothreitol EDTA : Ethylene diamin tetraacetic Acid ELISA : Enzyme linked immuno sorbent assay HCV : Hog cholera virus IPTG : Isopropylthio- - D- Galactosidase kDa : kilo Dalton Mab : Monoclonal antibody MCS : Multi cloning site MMLV : Moloney Murine Leukemia Virus, enzyme phiên mã ngược OD : Opical density pB : pBluescript II SK (+) PCR : Polymerase Chain Reaction RE : Restriction enzyme, enzyme cắt giới hạn RNA : Ribonucleic Acid RNase : Ribonuclease, enzyme thuỷ phân RNA RNasine : RNase inhibitor RT-buffer : Reverse transcript buffer RT-PCR : Reverse transcription- polymerase chain reaction SDS : Sodium dodecyl sulfate UTR : Untranslated region X-gal : 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactopyranoside DANH MỤC CÁC HÌNH & BẢNG Hình 1: Thận heo nhiễm bệnh dịch tả heo với điểm xuất huyết vỏ thận Hình 2: Tụ huyết xuất huyết màng não tủy heo bệnh Hình 3: Cấu tạo gen RNA Pestivirus 10 Hình 4: Sơ đồ tổng quát quy trình RT-PCR 15 Hình 5: Sơ đồ plasmid pBluescript II SK (+) 28 Hình 6: Sơ đồ dòng hoá gen 5’UTR 33 Hình 7: Sơ đồ vị trí mồi để giải trình tự gen 5’UTR 36 Hình 8: Sơ đồ quy trình RT-PCR phát virus CSFV 39 Hình 9: Kết phản ứng RT-PCR 42 Hình 10: Kết phản ứng mở vòng pBlue EcoRV 43 Hình 11: Kiểm tra khuẩn lạc dự tuyển mang gen 5’UTR phương pháp PCR khuẩn lạc 44 Hình 12: Kiểm tra thể biến nạp cặp mồi T3/T7 45 Hình 13: Kết so sánh trình tự 5’UTR virus dịch tả heo chủng Việt Nam với số chủng ngân hàng gen 46-48 Hình 14: RNA tổng số thu nhận phương pháp phương pháp 49 Hình 15: Thiết lập phản ứng RT-PCR 50 Hình 16: Khảo sát nồng độ MMLV 50 Hình 17: Khảo sát nồng độ mồi CSR 51 Hình 18: Khảo sát nồng độ dNTP 51 Hình 19: Khảo sát nồng độ mẫu 52 Hình 20: Khảo sát nồng độ dNTP phản ứng PCR 52 Hình 21: Khảo sát nồng độ mồi 53 Hình 22: Khảo sát nồng độ Mg2+ 53 Hình 23: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp 53 Hình 24: Khảo sát thời gian bắt cặp 54 Hình 25: Khảo sát thời gian kéo dài 54 Hình 26: Kiểm chứng quy trình phát CSFV 55 Hình 27: Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR thực mẫu bệnh nhiễm Salmonella 57 Hình 28: Kết sản phẩm PCR mẫu lấy từ thực địa 57 -/ Bảng 1: Thành phần phản ứng RT 38 Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR 28 Bảng 3: Kết kiểm tra nồng độ độ tinh plasmid sau tách chieát 42 Bảng 4: Phân tích độ tinh RNA quang phổ hấp thu 49 Bảng 5: Kiểm chứng quy trình phát CSFV RT-PCR 55 Bảng 6: Kết phản ứng RT-PCR với cặp mồi chuyên biệt CSFV thực 21 mẫu bệnh phẩm nhiễm Salmonella 56 PHẦN I: TÓM TẮT CÁC NỘI DUNG CHÍNH CỦA ĐỀ TÀI 1.1 MỞ ĐẦU Việt Nam nước nông nghiệp phát triển, nông dân có truyền thống chăn nuôi Gần đây, với nhu cầu phát triển xã hội, ngành chăn nuôi ngày phát triển, đặc biệt nuôi heo Do đó, việc kiểm soát bệnh chăn nuôi nhu cầu thiết Việt Nam có đầu heo khoảng 16 triệu con, chủ yếu dùng để tiêu thụ nước, chưa xuất chưa kiểm soát bệnh dịch tả heo số bệnh khác Vì vậy, vấn đề kiểm soát bệnh thú y nói chung, bệnh dịch tả heo nói riêng vấn đề cần giải nhằm thúc đẩy phát triển ngành chăn nuôi nước ta Bệnh dịch tả heo tồn 100 năm Hiện coi bệnh nguy hiểm cho ngành chăn nuôi heo Việc dùng kháng sinh để trị bệnh tác dụng, phòng ngừa vắc-xin biện pháp vệ sinh chuồng trại Bệnh gây chết hàng loạt, gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi heo năm, chiếm 50-60% thiệt hại chăn nuôi heo Một đặc điểm đáng lưu ý bệnh xảy â m ỉ, lẻ tẻ, triệu chứng bệnh tích không điển hình Diễn biến bệnh ngày phức tạp Những biểu lâm sàng bệnh tích không rõ ràng kết xét nghiệm bệnh dương tính (Nguyễn Lương Hiền, Ngô Thanh Long, 1999) Bệnh dịch tả heo Classical swine fever virus (CSFV), thuộc chi Pestivirus, gây Pestivirus xếp vào họ Flaviviridae (Mulphy et al., 1995), gồm loài virus gây bệnh cho heo động vật nhai lại, CSFV gây bệnh dịch tả heo, Bovine viral diarrhoea virus (BVDV) gây bệnh dịch tả bò Border disease virus (BDV) gây bệnh cho cừu Mặc dù việc phân loại Pestivirus chủ yếu dựa vào loài vật chủ bị nhiễm bệnh, có nhiều nghiên cứu cho thấy Pestivirus tính chuyên biệt vật chủ cao Cụ thể BVDV gây nhiễm không cho trâu bò mà gây nhiễm cho cừu; BDV gây nhiễm cho heo; CSFV chủ yếu gây bệnh cho heo thấy trâu bò dê Cũng có trường hợp người ta phát Pestivirus trâu hươu Để phát CSFV gây bệnh dịch tả heo sử dụng nhiều phương pháp khác dựa bệnh tích, tiêm truyền qua heo… Các phương pháp có nhược điểm phát bệnh có xuất triệu chứng lâm sàng Khi bệnh có nguy lây lan cao không đáp ứng yêu cầu kiểm soát dịch bệnh Vì nhu cầu có phương pháp chẩn đoán, phát bệnh gây CSFV cách nhanh chóng, xác, độ tin cậy cao cấp bách cần thiết Hiện nay, phương pháp RTPCR phương pháp chẩn đoán tổ chức Thú y giới (OIE) khuyến khích sử dụng có ưu điểm như: độ nhạy cao, cho kết nhanh, độ chuyên biệt cao, phát bệnh sớm chưa có biểu triệu chứng bệnh tích … Do vậy, phương pháp RT-PCR xem phương pháp chẩn đoán có nhiều tiềm ứng dụng việc thiết lập quy trình phát bệnh dịch tả heo phương pháp RT-PCR Việt Nam cần thiết Đồng thời, chẩn đoán phát CSFV, việc phân biệt xác bệnh CSFV hay loài khác chi Pestivirus gây thường gặp nhiều khó khăn Các -1- phương pháp phát CSFV dựa nguyên tắc kháng nguyên – kháng thể không cho phép phân biệt CSFV BDV hay BVDV Thực tế, việc chẩn đoán, phát xác CSFV có ý nghóa quan trọng nhằm định hướng biện pháp xử lý tránh lây nhiễm, tiêu diệt ổ bệnh vắc-xin phòng chống Đáp ứng nhu cầu thực tiễn này, kỹ thuật RT-PCR ứng dụng nhằm phát nhanh chuyên biệt CSFV dựa trình tự 5’UTR Trong RNA gen virus CSFV, vùng 5’UTR vùng đặc trưng chuyên biệt cho CSFV Dựa vào trình tự 5’UTR người ta phân biệt CSFV với loài khác chi Pestivirus BDV, BVDV Vì vậy, phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu cho vùng 5'UTR CSFV cho phép chẩn đoán xác bệnh dịch tả heo Ngoài ra, khảo sát xác định trình tự vùng 5’UTR CSFV có ý nghóa lớn nghiên cứu phân loại CSFV Hiện nay, số trình tự 5’UTR số chủng CSFV chủng Alfort/187 (Switzerland), chủng C (Trung Quốc), … xác định công bố lưu trữ ngân hàng gen Tuy vậy, chưa có công bố trình tự 5’UTR CSFV phân lập Việt Nam Vì vậy, mục tiêu đề xác định trình tự 5’UTR chủng CSFV phân lập Việt Nam nhằm phục vụ cho nghiên cứu phân loại hỗ trợ cho phương pháp phát CSFV RT-PCR So sánh trình tự đoạn 5’UTR số chủng CSFV khác Ngân hàng gen 1.2 TÓM TẮT TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC CÓ LIÊN QUAN Theo Hanson (1957), bệnh dịch tả heo ghi nhận từ năm 1810 Tennessce Sau ổ dịch phát Pháp năm 1822, Ohio vào đầu năm 1833, Đức năm 1835, Anh năm 1862 sau lan rộng khắp Châu Âu, Nam Mỹ Nam Phi Năm 1885, Xanmon Smit cho bệnh loài vi khuẩn gây Hai ông đặt tên vi khuẩn Bacillus cholera suis (hay gọi Samonella cholera suis) Đến năm 1903, Schweinitz Dorset chứng minh bệnh gây virus, vi khuẩn Bacillus cholera suis đóng vai trò phụ Năm 1907, Dorset, McBryde W.B Niles sử dụng huyết miễn dịch để phòng trị bệnh dịch tả heo Năm 1935, Dorset, McBryde, C.G Cole tạo vaccine vô hoạt tím kết tinh (crystal violet) Năm 1951, J.A Baker phát triển loại vaccine virus sống biến đổi (modified live vaccine) để phòng ngừa bệnh dịch tả heo thu hiệu bảo vệ cao Đầu thập niên 60, phương pháp tiêm truyền qua heo thỏ sử dụng để chẩn đoán bệnh dịch tả heo Năm 1963, Mengeling, E.C Pirtle, J.P Torrey phát triển phương pháp miễn dịch huỳnh quang để chẩn đoán bệnh nhanh Từ đến nay, kỹ thuật chẩn đoán liên tục cải tiến giúp phát bệnh nhanh chóng Đặc biệt, với đời phương pháp PCR, nhà nghiên cứu có thêm công cụ mạnh để chẩn đoán, phát bệnh nhanh chóng, việc nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại, … Từ năm 1997-1999, vùng 5’-UTR CSFV từ 27 chủng phân lập Lào phân tích so sánh với chủng châu Âu châu Á, hỗ trợ cho nghiên cứu dịch tễ học bệnh dịch tả heo 1.3 TÓM TẮT TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC CÓ LIÊN QUAN -2- Việt Nam nước nông nghiệp phát triển, xem 10 nước sản xuất thịt heo nhiều giới Vì vậy, việc bảo vệ kiểm soát dịch bệnh chăn nuôi có ý nghóa quan trọng việc nâng cao hiệu sản xuất xuất sản phẩm từ thịt Trong thời gian qua, bệnh dịch tả heo chẩn đoán dựa triệu chứng bệnh tích, phương pháp không đáng tin cậy triệu chứng bệnh thường xuyên biến đổi đa dạng phức tạp Một số phương pháp chẩn đoán truyền thống sử dụng tiêm truyền qua heo, trung hòa thỏ, phương pháp phân lập vi rút dịch tả heo nuôi cấy tế bào PK-15 cho kết chậm, tốn kém, phát bệnh có xuất triệu chứng lâm sàng Khi bệnh có nguy lây lan cao không đáp ứng yêu cầu kiểm soát dịch bệnh Vì nhu cầu có phương pháp chẩn đoán, phát bệnh gây CSFV cách nhanh chóng, xác, độ tin cậy cao cấp bách cần thiết Áp dụng thành tựu di truyền học phân tử kỹ thuật miễn dịch cho đời nhiều phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy, xác Trong đó, phương pháp ELISA sử dụng phổ biến Tuy nhiên, thông thường phương pháp phải kết hợp với chẩn đoán lâm sàng Một kỹ thuật có nhiều ưu điểm sử dụng phản ứng tổng hợp dây chuyền polymerase (PCR) nhằm phát gen đặc trưng, chuyên biệt vi rút CSFV Phương pháp dễ thực hiện, độ nhạy cao, đặc biệt khác phục nhược điểm phương pháp phân lập virút, xem tiêu chuẩn vàng chẩn đoán, nguồn mẫu không cần phải Tuy nhiên, chưa có công trình nghiên cứu phát CSFV RT-PCR công bố Việt Nam Vì vậy, mục tiêu đề xác định trình tự 5’UTR chủng CSFV phân lập Việt Nam nhằm phục vụ cho nghiên cứu phân loại hỗ trợ cho phương pháp phát CSFV RT-PCR 1.4 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Mục tiêu đề dòng hóa giải trình tự đoạn 5’UTR CSFV phân lập tỉnh thành phía Nam Việt Nam xây dựng quy trình phát sớm CSFV kỹ thuật RT-PCR, tạo công cụ chẩn đoán chuyên biệt cho CSFV Việt Nam, góp phần bảo vệ kiểm soát bệnh dịch tả heo ngành chăn nuôi heo, đồng thời phục vụ cho nghiên cứu phân loại, dịch tễ học bệnh 1.5 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Để thực mục tiêu này, tiến hành nội dung nghiên cứu bao gồm: - Thu nhận đoạn gen 5'UTR từ virus CSFV - Tạo dòng gen 5'UTR E coli - Giải trình tự gen 5'UTR, so sánh với trình tự công bố giới - Thiết kế mồi để phát CSFV RT-PCR - Xây dựng quy trình chẩn đoán sớm, nhanh, nhạy CSFV RT-PCR -3- (ii) Nồng độ mồi CSR Nhằm khảo sát nồng độ mồi sử dụng phản ứng RT, thực phản ứng thành phần khác không thay đổi, riêng nồng độ mồi sử dụng thay đổi sau: 1,25; 0,75; 0,5; 0,25; 0,05 pmol 20 l thể tích phản ứng Kết khảo sát nồng độ mồi trình bày (hình 17) Kết cho thấy nồng độ khảo sát cho tín hiệu khuếch đại rõ nét Do vậy, nồng độ mồi sử dụng nhỏ 0,05 pmol (giếng 6) chọn sử dụng bước khảo sát (iii) Nồng độ dNTP dNTP giữ vai trò quan trọng phản ứng RT, thêm vào việc giảm thiểu nồng độ dNTP sử dụng phản ứng có ý nghóa kinh tế quy trình phát sử dụng thực tiễn kiểm tra, phát bệnh dịch tả heo Chúng tiến hành pha loãng sử dụng dNTP nồng độ 0,5; 0,1; 0,01; 10-3; 10-4 mM 20 l thể tích phản ứng Kết thu sau (hình 18) Kết cho thấy nồng độ cho sản phẩm khuếch đại Tuy nhiên, nồng độ103 mM (giếng 5) 10-4mM (giếng 6) sản phẩm khuếch đại thu ít, không rõ nét Trong nồng độ dNTP lại, phản ứng RT-PCR cho sản phẩm khuếch đại rõ nét Chúng chọn sử dụng dNTP phản ứng với nồng độ 0,01mM (giếng 4) cho bước khảo sát Hình 17: Khảo sát nồng độ mồi CSR Giếng 1: Thang DNA 50bp; 2: 1,25 pmol; 3: 0,75 pmol; 4: 0,5 pmol; 5: 0,25 pmol; 6: 0,05 pmol Hình 18: Khảo sát nồng độ dNTP Giếng 1: Thang DNA 50bp; 2: 0,5mM; 3: 0,1mM; 4: 0,01mM; 5: 10-3mM; 6:10-4mM (iv) Nồng độ mẫu RNA Nồng độ RNA sử dụng phản ứng RT có ý nghóa định cho kết phát Bên cạnh đó, nồng độ RNA sử dụng phản ứng cho biết độ nhạy quy trình phát Chúng tiến hành pha loãng sử dụng RNA mẫu nồng độ 500 ng; 100ng; 10ng; 1ng; 100pg; 10pg; 1pg 20 l phản ứng Kết trình bày (hình 19) Kết cho thấy: nồng độ mẫu từ 500ng (giếng 2) đến 100pg (giếng 6) cho kết rõ nét Ở nồng độ mẫu 10pg (giếng 7) phản ứng cho kết không rõ, nồng độ - 51 - 1pg (giếng 8) không cho sản phẩm khuếch đại Như vậy, phát diện virus CSFV từ nồng độ mẫu ban đầu 10pg Hình 19: Khảo sát nồng độ mẫu 1: Thang DNA 50bp; 2: 500 ng; 3: 100 ng; 4: 10 ng; 5: 1ng; 6: 100 pg; 7: 10 pg; 8: pg b) Khảo sát thành phần phản ứng PCR (i) Nồng độ dNTP Nồng độ dNTP khảo sát nồng độ: 1; 0,5; 0,1; 0,01; 10-3; 10-4; 10-5 mM 25 l thể tích phản ứng Kết thu sau: Hình 20: Khảo sát nồng độ dNTP phản ứng PCR 1: Thang DNA 50bp; 2:1mM; 3: 0,5 mM; 4: 0,1 mM; 5: 0,01 mM; 6: 10-3 mM; 7: 10-4 mM; 8: 10-5 mM Kết cho thấy tất nồng độ khảo sát cho sản phẩm khuếch đại Tuy nhiên, nồng độ 10-3mM (giếng 6) đến 10-5 mM (giếng 8) cho kết không rõ nét Chúng chọn sử dụng dNTP với nồng độ 0,01mM (giếng 5) 25 l phản ứng PCR để tiếp tục thực khảo sát (ii) Nồng độ mồi Cặp mồi sử dụng phản ứng PCR khảo sát nồng độ 1; 0,25; 0,2; 0,08; 4.10-4 pmol 25 l thể tích phản ứng Kết cho thấy nồng độ 1; 0,25; 0,2 pmol cho sản phẩm khuếch đại rõ nét Ở nồng độ 4.10-4 pmol (giếng 6) không thấy dấu hiệu khuếch đại Nồng độ 0,08 pmol (giếng 5) cho sản phẩm yếu Chúng chọn sử dụng cặp mồi CSR/CSF với nồng độ 0,2 pmol (giếng 4) 25 l thể tích phản ứng để thực khảo sát - 52 - Hình 21: Khảo sát nồng độ mồi 1: Thang DNA 50bp 2: 1pmol 3: 0,25pmol 4: 0,2 pmol 5: 0,08pmol 6: 4.10-4 pmol (iii) Nồng độ Mg2+ Mg2+ có vai trò liên kết với dNTP, DNA giúp Taq polymerase hoạt động Nếu nồng độ Mg2+ thấp (< 0,5 mM) làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA hoạt động Taq polymerase bị ức chế, làm giảm số sản phẩm cuối Để chọn nồng độ Mg2+ thích hợp sử dụng phản ứng PCR, tiến hành khảo sát dải nồng độ Mg2+ thay đổi từ 0-5 mM Hình 22: Khảo sát nồng độ Mg2+ Giếng 1: Thang DNA 50bp; 2: 0mM; 3: 0,5mM; 4: mM; 5:1,5 mM; 6: mM;7: 2,5 mM; 8: mM; 9: 3,5 mM; 10: mM; 11: 4,5 mM; 12: mM Keát cho thấy Mg2+ (giếng 2) có tín hiệu khuếch đại tín hiệu yếu Nồng độ Mg2+ cần nhỏ 0,5mM (giếng 3) cho tín hiệu khuếch đại rõ nét Chúng chọn nồng độ Mg2+ 0,5 mM cho bước khảo sát (iv) Nhiệt độ bắt cặp Hình 23: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp 1: Thang DNA 50bp 2: 50oC 3: 53oC 4: 55oC 5: 57oC 6: 60oC 7: 63oC 8: 65oC - 53 - Nhiệt độ bắt cặp yếu tố quan trọng phản ứng PCR nhiệt độ bắt cặp thấp tạo sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu Ngược lại nhiệt độ bắt cặp cao phản ứng không xảy Do vậy, việc khảo sát nhiệt độ bắt cặp để chọn nhiệt độ thích hợp cần thiết Chúng tiến hành thiết lập phản ứng PCR đặt trương trình luân nhiệt với nhiệt độ bắt cặp khác sau: 50; 53; 57; 60; 63; 65oC Kết cho thấy nhiệt độ bắt cặp 65oC không thấy tín hiệu khuếch đại Ở nhiệt độ 50; 60; 63 oC sản phẩm khuếch đại mờ so với nhiệt độ bắt cặp 53; 55; 57oC Do vậy, chọn 57oC nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng PCR (v) Thời gian bắt cặp thời gian kéo dài Thời gian bắt cặp Thời gian bắt cặp khảo sát là: phút; 45 giây; 30 giây Kết điện di cho thấy thời gian bắt cặp phút (giếng 2) 45 giây (giếng 3) cho tín hiệu rõ nét Ởû nhiệt độ 30 giây sản phẩm khuếch đại mờ Chúng chọn 45 giây thời gian bắt cặp sử dụng quy trình Hình 24: Khảo sát thời gian bắt cặp 1: Thang DNA 50bp; 2: phút; 3: 45 giây; 4: 30 giây Hình 25: Khảo sát thời gian kéo dài 1: Thang DNA 50bp; 2:1 phút; 3: 45 giây; 4:30 giây Thời gian kéo dài Thời gian kéo dài khảo sát là: phút; 45 giây; 30 giây Kết trình bày hình 26 Kết cho thấy mức thời gian khảo sát, phản ứng RT-PCR cho sản phẩm khuếch đại rõ nét Tuy nhiên chọn thời gian kéo dài 30 giây để sử dụng quy trình nhằm rút ngắn quy trình kiểm mẫu 4.4 KIỂM CHỨNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN CSFV BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR 4.4.1 Kiểm chứng quy trình Chúng tiến hành kiểm chứng quy trình RT-PCR thiết lập với mẫu bệnh phẩm Trung Tâm Thú Y Vùng cung cấp Các mẫu kiểm tra diện virus CSFV phương pháp ELISA Thí nghiệm tiến hành song song - 54 - với mẫu đối chứng âm RNA mẫu thay nước cất vô trùng Kết kiểm chứng trình bày (hình 26) Hình 26: Kiểm chứng quy trình phát CSFV Giếng 1: Thang DNA 50bp; 2: Đối chứng âm; 3: Mẫu 1; 4: Maãu 2; 5: Maãu 3; 6: Maãu 4; 7: Maãu 5; 8: Maãu 6; 9: Maãu 7;10: Maãu 8; 11: Mẫu 9; 12: Mẫu 10 Trong mẫu bệnh phẩm có mẫu (giếng 5) mẫu (giếng 9) cho kết âm tính, mẫu lại dương tính Kết đối chứng so sánh với kết ELISA Trung Tâm Thú Y vùng trình bày bảng Bảng 5: Kiểm chứng quy trình phát CSFV phản ứng RT-PCR Ký hiệu mẫu Địa phương Kết RT-PCR Kết ELISA Đồng Nai + + + + - - + + + + + + - - + + + + + + Biên Hòa Vũng Tàu Củ Chi 10 Như kết với kết đối chứng nhận từ Trung Tâm Thú Y Vùng Có thể kết luận có đồng kết phương pháp ELISA RTPCR Tỉ lệ tin cậy 100% 10 mẫu kiểm chứng 4.4.2 Khảo sát độ chuyên biệt quy trình RT-PCR Tính chuyên biệt quy trình khảo sát dựa khả khuếch đại chuyên biệt CSFV phản ứng RT-PCR diện đối tượng vi sinh khác có mẫu bệnh phẩm Salmonella Typhimurium tác nhân gây bệnh phó thương hàn heo Bệnh có biểu gần giống bệnh dịch tả heo, đó, có nhầm lẫn chẩn đoán lâm sàng Chúng tiến hành bổ sung Salmonella Typhimurium vào mẫu bệnh phẩm kiểm chứng phương - 55 - pháp ELISA Trung Tâm Thú Y vùng, thu nhận RNA thực phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu cho CSFV Kết thí nghiệm trình bày bảng hình 27 Bảng 6: Kết phản ứng RT-PCR với cặp mồi chuyên biệt CSFV thực 21 mẫu bệnh phẩm nhiễm Salmonella STT Ký hiệu mẫu Tình trạng mẫu Kết phản ứng RT-PCR thực cho mẫu nhiễm Salmonella 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 D9M D7M T36M T37M D8M T38M LD1 T35L D9BH LDL1 LD2 D9T D6M T39M D6BH T39 T35BH T35L LD3 T35M LDL2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Chú thích: (+) Mẫu nhiễm CSFV; (-) Mẫu không nhiễm CSFV Số liệu trình bày bảng cho thấy cặp mồi sử dụng phản ứng RT-PCR chuyên biệt cho CSFV kết phản ứng RT-PCR phản ánh tình trạng mẫu Trong hình 27, mẫu âm tính CSFV nhiễm Salmonella (giếng 2, 3, 4, 5, 10) không cho thấy vạch khuếch đại, mẫu dương tính CSFV nhiễm Salmonella (giếng 6, 7, 8, 9) cho vạch sản phẩm với đoạn gen 287 bp CSFV vạch ký sinh Từ số liệu trên, kết luận phản ứng RT-PCR thực chuyên biệt với CSFV kết phản ứng không bị ảnh hưởng mẫu có diện Salmonella Sự chuyên biệt qui trình CSFV so với virus khác thuộc chi Pestitivirus khảo sát thông qua độ chuyên biệt cặp mồi phát CSFV trình tự sản phẩm khuếch đại (287 bp) - 56 - 287 bp Hình 27: Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR thực mẫu bệnh phẩm nhiễm Salmonella Thang DNA 100 bp; Maãu D6M; Maãu D7M; Maãu D8M; Maãu T39M; Maãu T35M; Maãu T36M; Maãu T37M ; Maãu D9M;10 Maãu T38M Khảo sát độ chuyên biệt cặp mồi Khi khảo sát khả bắt cặp mồi CSF – CSR sử dụng qui trình với gen BVDV BDV, kết cho thấy cặp mồi không bắt cặp vị trí vùng 5’UTR BVDV BDV Nói cách khác, cặp mồi hoàn toàn chuyên biệt cho CSFV không cho sản phẩm khuếch đại gen BVDV BDV Khảo sát trình tự sản phẩm khuếch đại Chúng sử dụng kết giải trình tự sản phẩm khuếch đại thu nhận từ qui trình RT-PCR (được lưu trữ ngân hàng gen với mã số AY306121) so sánh với trình tự đoạn 5’UTR virus thuộc chi Pestivirus (CSFV, BVDV, BDV) Kết cho thấy trình tự vùng 5’UTR CSFV sai khác lớn so với trình tự 5’UTR BVDV (mức độ tương đồng 55,1%) tương đối khác biệt với trình tự 5’UTR BDV (tương đồng 79,8%) Trong đó, trình tự có tương đồng vùng 5’UTR chủng CSFV nước giới như: Chủng C (93%), chủng Afort/187 (93%), chủng Eystrup (94%) 4.4.3 Ứng dụng quy trình RT-PCR kiểm mẫu bệnh phẩm Mẫu lấy lần thứ nhất: Lâm trường Mã Đà-Đồng Nai gồm heo số số Mẫu lấy lần thứ hai: Bà Rịa-Vũng Tàu gồm heo số số Hình 28: Kết sản phẩm PCR mẫu lấy từ thực địa 1: Thang DNA 50bp 2: heo số 3: heo soá 4: heo soá 4: heo số - 57 - Kết RT-PCR cho thấy mẫu cho kết dương tính Như có diện virus dịch tả heo heo Kết phù hợp với triệu chứng lâm sàng heo bệnh ghi nhận lấy mẫu Từ kết khảo sát xây dựng quy trình phát CSFV phản ứng RT-PCR sau: - 58 - QUY TRÌNH PHÁT HIỆN CSFV BẰNG RT - PCR Mẫu bệnh phẩm (100mg 200 l máu) Đồng mẫu dung dịch Trizol Pha tách biệt (Thêm Chloroform) Tủa RNA Rửa hoà tan tủa Thu nhận RNA tổng số g RNA tổng số + l BSA 0,1% Chương trình nhiệt 85oC - 10 phút Giữ 4oC Xử lý mẫu dNTP 0,1mM RT buffer 5X DTT 0,1M Moài 1pmol RNASin 30U MMLV 10 U RNA xử lý + H2O RT PCR MgCl2 25mM dNTP 0,1 mM PCR buffer 10X Moài CSR, CSF 5pmol Taq polymerase Sản phẩm RT H2O Điện di phân tích kết - 59 - l l Chương trình RT 0,5 l 37oC - RT l Chương trình 60 phút 37oC 94oCphút phút - 60 - 10 l 94oC - 10 phút 0,5 l Bổ sung đủ 20 l 0,5 l Chương trình PCR 2,5 l 94oC - phuùt 2,5 l 94oC - phút 57oC - 45 giây 30chu kỳ l o 0,5 l 72 C - 30 giaây 72oC - phút l 14 l PHẦN V: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Với mong muốn giải trình tự đoạn 5’UTR CSFV phân lập Việt Nam nhằm mục đích nghiên cứu phân loại hỗ trợ cho phương pháp RT-PCR phát trình thí nghiệm, đồng thời xây dựng quy trình phát nhanh virus dịch tả heo, trình thực đề tài, thu kết sau: Thu nhận đoạn gen 5’UTR từ CSFV phân lập Việt Nam Tạo dòng tế bào E coli mang plasmid tái tổ hợp pBlue-5’UTR Giải trình tự đoạn gen 5’UTR virus dịch tả heo Việt Nam so sánh với trình tự 5’UTR chủng khác Thiết kế cặp mồi chuyên biệt cho CSFV để phát CSFV RT-PCR Xây dựng quy trình phát virus dịch tả heo (CSFV) phương pháp RT-PCR với thông số khảo sát, tối ưu sau: - Quy trình tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm Nồng độ MMLV ( U/20 l thể tích phản ứng RT) Nồng độ mồi CRS (0,05 pmol/20 l thể tích phản ứng RT) Nồng độ dNTP (0,01 mM/20 l thể tích phản ứng RT) Nồng độ dNTP (0,01 mM/25 l thể tích phản ứng PCR) Nồng độ mồi CRS-CRF (0,2 pmol/25 l thể tích phản ứng PCR) Mg2+ với nồng độ 0,5 mM/25 l thể tích phản ứng PCR Nhiệt độ bắt cặp tối ưu 570C Thời gian bắt cặp 45 giây Thời gian kéo dài 30 giây 5.2 ĐỀ NGHỊ Các kết thu đề tài bước mở đầu cho nghiên cứu phân loại CSFV sau Đồng thời, việc nghiên cứu đưa vào ứng dụng quy trình phát virus dịch tả heo có ý nghóa thực tiễn phát triển ngành chăn nuôi nước ta Để đề tài hoàn thiện đề nghị : - Tiếp tục sâu nghiên cứu, so sánh vùng gen 5’UTR CSFV - Phân lập thêm, dòng hóa giải trình tự vùng gen 5’UTR số chủng CSFV phân lập Việt Nam nhằm mục đích so sánh nghiên cứu biến chủng - Tiếp tục mở rộng việc thu nhận, lấy mẫu từ thực địa ứng dụng quy trình để kiểm tra phát virus CSFV - Tiến hành khảo sát đánh giá hiệu lực để quy trình phát CSFV RT-PCR xây dựng dùng phương pháp thường quy - 60 - PHẦN VI: SO SÁNH CÁC NỘI DUNG ĐĂNG KÝ VÀ KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯC Nội dung đăng ký Kết thực Dòng E coli tái tổ hợp mang gen 5’UTR CSFV Tạo dòng tế bào E coli mang plasmid tái tổ hợp pBlue-5’UTR/DH5 Trình tự gen 5’UTR CSFV miền Nam Việt Nam Trình tự gen 5’UTR đăng ký ngân hàng gen với mã số AY306121 Quy trình chẩn đoán sớm bệnh dịch tả heo RT-PCR Đã tối ưu hóa quy trình cho phép chẩn đoán sớm bệnh dịch tả heo, cho kết vòng 6-8 giờ, cho phép phát RNA CSFV nồng độ 10pg Bộ KIT chẩn đoán sớm bệnh dịch tả heo Để trở thành phương pháp chẩn đoán thường quy cần tiến hành đánh giá hiệu lực thứ cấp - 61 - PHẦN VII: CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI PGS TS Trần Linh Thước CN Huỳnh Ngọc Vi Ca CN Phạm Hồng Ánh CN Trần Văn Hiếu CN Nguyễn Trí Nhân CN Cao Thị Ngọc Phượng CN Nguyễn Thị Thanh Điều - 62 - PHẦN VIII: CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI N T Nhân, Đ.T.P Thảo, T.L.Thước (2004) Thiết lập đánh giá hiệu lực sơ quy trình phát nhanh virus dịch tả heo kỹ thuật RT-PCR Báo cáo khoa học “Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống” – Định hướng Nông Lâm nghiệp Miền núi Thái Nguyên, trang 547 – 551 - 63 - TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang Di truyền phân tử – Những nguyên tắc chọn giống trồng NXB Nông nghiệp Đào Trọng Đạt Bệnh Dịch tả lợn cổ điển, Dịch tễ – Chẩn đoán – Chương trình kiểm soát Henry Too, Sacha Seneque Bệnh dịch tả heo – Cẩm nang cho nhà chăn nuôi chuyên nghiệp Merial Asia Private Limited Hồ Huỳnh Thùy Dương (1997) Sinh học phân tử Chương X, XIII, trang 135140; 173-189, NXB Giáo dục Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Tiến Dũng (1996) Tình hình bệnh dịch tả heo giới hướng phòng trị Nguyễn Tiến Hà (2001) So sánh độ nhạy ứng dụng hai phương pháp ELISA phân lập virus tế bào PK-15 chẩn đoán virus dịch tả heo Luận văn tốt nghiệp, Tủ sách Đại học Nông Lâm, Tp HCM Nguyễn Vónh Phước Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc NXB Nông nghiệp, trang 150-195 Phạm Sỹ Lăng, Phan Địch Lân, Trương Văn Dung Bệnh phổ biến lợn phương pháp phòng trị Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phân tử (2001) Tài liệu tập huấn kỹ thuật giải trình tự nucleotide Đại học Khoa học tự nhiên Tp HCM 10 Trần Linh Thước (2002) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Trang 169-170, NXB Giáo dục 11 Trần Linh Thước (2002) Thực tập di truyền tái tạo dòng (Công nghệ sinh học) Khoa sinh, Đại học Khoa học tự nhiên Tp HCM 12 Trương Thị Nga (2002) Thăm dò hàm lượng kháng thể thụ động dịch tả heo heo để xác định thời gian tiêm chủng vaccine lần đầu Khóa luận tốt nghiệp Khoa chăn nuôi thú y Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh 13 Vũ Triệu An (2001) Miễn dịch học Trang 121-122, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14 Alan J, Cann (1998) Principles of Molercular Virology University of Leicester UK: Academic Press p.66 – 104 15 Claudio WC, Isido H, Laura, Paulo M & AviMasuda (1996) Differentiation of Classiacal swine fever virus from ruminant pestivirus by reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) Veterinary Microbiology 48, pp.373-379 - 64 - 16 Edwar Alacmo (1996) DNA technology The awesome skill Chapter 5, 97-113, Wm C Brown Publishers 17 Harding, Lutze-Wallace C, Zhong X, Rola J (1994) Reverse transcriptasePCR assay for detection of hog cholera virus J Clin Microbiol 32(10): 2600-2 18 Hulst, M M., F E Panoto , A hoekman, H G P van Gennin, R J M Moormann (1988) Inactivation of the RNase activity of glycoprotein Erns of classiacal swine fever virus result in a cytopathogenic virus J Virol, pp 151-157 19 J T Van Oischot (1992) Hog cholera Diseases of swine 7th ed Iowa USA: Iowa State University Press, Ames 20 Li Hong Wei, Tu Chang Chun., Jin Kuo Shi & Zhang JinGang (1995) Amplication and cloning the 5’ regulator sequence and P23 gene of Hog cholera virus strain C Annual anthology of university of Agriculture and Animal Science, PLA, pp 7-10 21 Liu ST, Wang DC, Chang SF, Chiang SC, Ho WC (1991) Rapid detection of hog cholera virus in tissues by the polymerase chain reaction J Virol Methods.35 (2) : 227-36 22 Michael T.M., John M.M & Jack P (2000) Brock Biology of Microorganism Ninth edition, Prentice Hall International, Inc, chapter 9, 306-307; chapter 10, 345-353 23 M M Hulst, F E Panoto, A Hoekman, H G P van Gennip, R J M Moormann Inactivation of the RNase Activity of Glycoprotein Erns of Classical Swine Fever Virus Results in a Cytopathogenic Virus 1997 24 Sakoda Y, Ozawa.S, Damrongwatanapokin S, Sato M, Ishikawa K & Fukusho A (1998) Genetic heterogeneity of porcine and ruminant pestiviruses mainly isolated in Japan Veterinary Microbiology 65, pp 75-86 25 Zhang F, Syseng K, Zhang N & Blacksell (1999) Consideration regarding the transport of sample and development of diagnostic protocols for the detection of Classiacal swine fever virus under endemic conditions Classiacal swine fever and Emerging Disease in Southeast Asia, pp 31-37 TÀI LIỆU TỪ CÁC TRANG WEB 26 http://www.ars.usda.gov/cholera.html 27 http://www.cidrap.umn.edu/cidrap/content/biosecurity/ag-biosec/animisease/csf.html 28 http://www.cvm.tamv.edu/description-viruses/flavi.html 29 http://www.niah.affrc.go.jp/niah99007-e.html 30 http://www.triroc.com/sunnen/topics/virology.htm 31 http://rover.vetmed.lsu.edu/student/y4/boardstuff/swinerev.doc 32 http://wc.pima.edu/~lwerner/Biotech/298/Handouts/Optimizing Amplification.htlm - 65 - ... VIRUS DỊCH TẢ HEO, CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS – CSFV 2.5.1 Đặc điểm phân loại [23] Virus dịch tả heo, Classical swine fever virus – CSFV, trước xếp vào họ Togaviridae thuộc chi Pestivirus Theo... AUG định vị đầu 5? ?UTR 2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ HEO Trước đây, bệnh dịch tả heo chuẩn đoán dựa triệu chứng bệnh tích, phương pháp không đáng tin cậy triệu chứng bệnh thường xuyên... trình tự công bố giới - Thiết kế mồi để phát CSFV RT-PCR - Xây dựng quy trình chẩn đoán sớm, nhanh, nhạy CSFV RT-PCR -3- PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TÌNH HÌNH BỆNH DỊCH TẢ HEO Bệnh dịch tả