ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu) (TÊN ĐỀ TÀI) NGHIÊN CỨU NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS SP. VỚI TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM, GIẢM ĐAU TẠO NGUỒN NGUYÊN LIỆU DƯỢC CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) Hoàng Ngọc Anh CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/ 2010 TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Bò cạp đen Heterometrus sp. phân bố ở các vùng Tây Ninh và An Giang được xác định thuộc loài Heterometrus laoticus Couzijn 1981. Nọc bò cạp được thu bằng xung điện ở tần số 2,63 kHz. Nọc thu được lúc mới nuôi bò cạp trên cột sắc ký với Bio-Gel P10 đã tách ra làm 10 phân đoạn, trong đó có 6 phân đoạn có độc tính. Kết quả điện di các phân đoạn có độc tính cho thấy chúng có khối lượng phân t ử tương đương khối lượng phân tử của các neurotoxin và các enzyme, trong đó có phospholipase. Các neurotoxin là thành phần được cho là có dược tính chính của nọc bò cạp. Bảo quản nọc này ở điều kiện -20 0 C trong 6 tháng và phân tích nọc sau bảo quản bằng phương pháp sắc ký và điện di với điều kiện như trên thì trong 10 phân đoạn tách ra chỉ có 4 phân đoạn có độc tính. So với nọc đã khảo sát 6 tháng trước thì hai phân đoạn không gây độc là các enzyme. Các enzyme là các protein có khối lượng phân tử lớn hơn và dễ thay đổi tính chất trong khi đó các neurotoxin có khối lượng phân tử nhỏ nên bền hơn và tính chất không thay đổi sau thời gian bảo quản. K ết quả này cho thấy nọc bảo quản trong điều kiện như vậy có thể sử dụng làm nguyên liệu dược. Tính chất của nọc thu sau 6 tháng nuôi bò cạp trong phòng thí nghiệm cho thấy với điều kiện phân tích như trên thì trong 10 phân đoạn tách ra chỉ có 2 phân đoạn có độc tính, đó là các phân đoạn chứa các neurotoxin. Như vậy tính chất neurotoxin không thay đổi và nọc thu sau 6 tháng nuôi bò cạp trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng làm nguyên liệu dược. Nọc thu được có độc tính cấp trên theo đường tiêm tĩnh mạch là 12,4 mg/kg và đường tiêm dưới da là 190 mg/kg. Khảo sát độc tính bán trường diễn của nọc bò cạp đường tiêm dưới da cho thấy nọc tiêm vào không làm thay đổi các chỉ số sinh hoá về chức năng gan, thận và sự tăng trưởng thể trọng bình thường của chuột thử nghiệm sau 30 ngày sử dụng. Khảo sát tác dụng dược lý, nọc bò cạp cho thấy có tác dụng giảm đau trung ương nhưng không bằng morphin, tác dụng giảm đau ngoại biên tốt hơn aspirin liều 50 mg/kg và tác động kháng viêm tương đương tác động kháng viêm của ketoprofen liều 2,5 mg/kg. Dựa trên những kết quả nghiên cứu, các tiêu chuẩn của nọc bò cạp để dùng làm nguyên liệu dược đã được đề xuất. i SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Scorpions Heterometrus sp. found in Tay Ninh and An Giang provinces are determined as Heterometrus laoticus Couzijn 1981. Their venoms were collected by electro-stimulation at frequency 2.63 kHz. Venom was separated into ten fractions by column chromatography on Bio-Gel P10. Tests on mice showed six from these fractions were toxic. The toxic fractions are neurotoxins and enzymes. Neurotoxins were principal pharmacological actives in scorpion venom. This scorpion venom was preserved under -20 0 C in six months and then it was analysed by column chromatography with the above conditions. This venom was separated into tent fractions, and four from these were toxic. In comparing with the result getting six months ago we knew two enzyme fractions became no toxic. This result showed the proterties of neurotoxins remain unchanged in preserving time. The analysis of venom collected from scorpions breeding for six months in labotatory, showed from ten separated fractions only two are toxic and they are neurotoxic fractions. The properties of neurotoxins from breeding scorpions do not change so this venom can be using in pharmacology. The LD 50 of scorpion venoms was 12,4 mg/kg B.W. mouse (i.i) and 190 mg/kg B.W. mouse (s.c.). There is no signs of subchronic toxicity after one month duration of subcutaneous administration. Scorpion venomhas not only central and peripheral analgesic effect in acetic acid induced writhing test and tail immersion test, but also anti-inflammatory effect in carrageenin incluced inflammation test at the dosages 9,5 or 19 mg/kg, s.c. On getting result proposed the standard of scorpion venom. ii BÁO CÁO NGHIỆM THU 1.Tên đề tài: Nghiên cứu nọc bò cạp Heterometrus sp. với tác dụng kháng viêm, giảm đau tạo nguồn nguyên liệu dược Chủ nhiệm đề tài: TSKH. Hoàng Ngọc Anh Cơ quan chủ trì: Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Viện KH&CNVN Thời gian thực hiện đề tài: 2 năm (10/2007-10/2009) Kinh phí được duyệt: 305 triệu đồng 2. Mục tiêu (theo đề cương đã duyệt): Nghiên cứu thu nọc từ bò cạp đen Heterometrus sp. của Việt Nam và khảo sát độc tính, tác dụng kháng viêm, giảm đau của nọc bò cạp ứng dụng trong y dược. 3. Nội dung (theo đề cương đã duyệt) • Khảo sát các vùng có thể thu mua bò cạp; định danh tên bò cạp thu mua để lấy nọc. • Xây dựng quy trình và tiến hành thu gom nọc bò cạp bằng phương pháp xung điện. • Khảo sát tính chất và thành phần của nọc ở thời điểm thu mua bò cạp từ tự nhiên. • Khảo sát độ ổn định của nọc trong điều kiện bảo quản ở -20 0 C. • Khảo sát độc tính cấp, bán trường diễn của nọc bò cạp. • Khảo sát tác dụng dược lý thực nghiệm của nọc bò cạp toàn phần lên chuột nhắt. • Khảo sát tinh chất và thành phần nọc bò cạp sau thời gian nuôi. • Khảo sát độc tính của các phân đoạn sắc ký lên chuột nhắt. • Xây dựng tiêu chuẩn nọc bò cạp đen làm nguyên liệu dược. Các thành viên tham gia thực hiện đề tài: 1. TSKH. Hoàng Ng ọc Anh 2. TS. Trần Thanh Lương 3. KS. Phạm Nguyên Đông Yên 4. CN. Nguyễn Thị Thanh Thuỷ 5. ThS. Nguyễn Thị Mai Hương 6. TS. Võ Phùng Nguyên Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT FPLC Fast protein liquid chromatography (Sắc ký lỏng nhanh protein) AA Ammonium acetate PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis (Điện di gel polyacrylamide) LD 50 Lethal dose 50 (Liều gây tử vong 50% thú vật thử nghiệm) LD 0 Lethal dose 0 (Liều tối đa không gây tử vong cho thú vật thử nghiệm) LD 100 Lethal dose 100 (Liều tối thiểu gây tử vong 100% thú vật thử nghiệm) SDS Sodium dodecylsulfate iv DANH SÁCH CÁC BẢNG Số Tên bảng Trang 1 Kết quả nuôi bò cạp trong 6 tháng 13 2 Tác dụng tần số của xung điện vào việc thu nọc 15 3 Tác dụng của tần số xung điện đến việc thu nọc 16 4 Tác dụng của tần số xung điện đến việc thu nọc 16 5 Kết quả thu nọc sau thời gian nuôi 17 6 Lượng nọc thu được và độ ẩm của nọc trong thời gian nuôi 18 7 Kết quả đo mật độ quang của mẫu và chuẩn 19 8 Kết quả đo pH nọc bò cạp 20 9 Kết quả thử độc tính của các phân đoạn lên chuột 21 10 Thử độc tính các phân đoạn sắc ký tách ra từ nọc bò cạp 24 11 Liều LD 0 và LD 100 của nọc bò cạp An Giang 26 12 Tỉ lệ tử vong của chuột sau 24 giờ tiêm tĩnh mạch nọc bò cạp 27 13 Bảng tính kết quả theo phương pháp Karber-Behrens sau 24 giờ tiêm tĩnh mạch nọc bò cạp An Giang 27 14 Tỉ lệ tử vong của chuột sau 24 giờ tiêm dưới da nọc bò cạp An Giang 28 15 Bảng tính kết quả LD50 theo phương pháp Karber-Behrens sau 24 giờ tiêm dưới da nọc bò cạp An Giang 28 16 Các chỉ số hồng cầu của lô chứng và lô thử 29 17 Các chỉ số bạch cầu của lô chứng và lô thử 30 18 Các chỉ số tiểu cầu của lô chứng và lô thử 31 19 Các chỉ số sinh hóa về tổn thương tế bào gan và gan mật 31 20 Nồng độ BUN và Creatinin huyết thanh của chuột lô chứng và lô thử sau 30 ngày thử nghiệm 32 21 Kết quả sinh thiết gan, thận của chuột ở 2 lô 34 v 22 Thể trọng trung bình của chuột ở 2 lô trong 30 ngày thử nghiệm 35 23 Thời gian có phản ứng giật mạnh đuôi ở các lô vào các thời điểm 36 24 Số lần đau quặn trung bình của chuột ở các lô vào các thời điểm 37 25 Độ phù chân chuột viêm 38 26 Kết quả đo mật độ quang của mẫu và chuẩn 39 27 Kết quả đo pH nọc bò cạp 40 28 Khảo sát độc tính của các phân đoạn tách ra từ nọc bò cạp H. laoticus thu sau 6 tháng nuôi trong phòng thí nghiệm 42 29 Kết quả thử độc tính trên chuột của các phân đoạn nọc thu lúc mới nuôi bò cạp 45 30 Kết quả thử độc tính trên chuột của các phân đoạn nọc thu lúc mới nuôi bò cạp sau 6 tháng bảo quản ở -20 0 C 46 31 Kết quả thử độc tính trên chuột của các phân đoạn nọc thu sau khi nuôi bò cạp 6 tháng trong phòng thí nghiệm 47 32 Xác định độ giảm khối lượng của nọc khô (độ ẩm) 48 vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Số Tên hình Trang 1 Bò cạp Heterometrus laoticus 12 2 Thu nọc bò cạp 17 3 Đồ thị đường chuẩn nồng độ protein 19 4 Kết quả sắc ký nọc tan 20 5 Kết quả điện di các phân đoạn tách ra từ nọc bò cạp qua cột 23 6 Phân tách nọc bò cạp H. laoticus trên cột với Bio-Gel P 10 24 7 Kết quả điện di các phân đoạn tách ra từ nọc bò cạp qua cột 25 8 Các chỉ số hồng cầu và hemoglobin của lô chứng và lô thử 30 9 Số lượng bạch cầu của lô chứng và lô thử sau 30 ngày 30 10 Số lượng tiểu cầu của lô chứng và lô thử sau 30 ngày 31 11 Nồng độ SGOT, SGPT của lô chứng và lô thử 32 12 Nồng độ Bilirubin (toàn phần, trực tiếp, gián tiếp) lô chứng và lô thử 32 13 Giá trị BUN và Creatinin huyết thanh chuột lô thử và lô chứng 33 14a Mô gan có cấu trúc bình thường 34 14b Mô gan viêm 34 14c Mô thận bình thường 35 15 Sự thay đổi thể trọng chuột ở 2 lô theo thời gian thử nghiệm 35 16 Tiềm thời giật mạnh đuôi của các lô vào các thời điểm 36 17 Số lần đau quặn trung bình của các lô vào các thời điểm 37 18 Phần trăm độ sưng phù chân chuột sau 3 giờ tiêm carrageenin (ngày 0) và 30 phút sau tiêm thuốc mỗi ngày (trong 6 ngày) 38 19 Đường chuẩn nồng độ protein 40 20 Kết quả sắc ký nọc bò cạp thu sau 6 tháng nuôi 41 21 Kết quả điện di một số phân đoạn tách ra từ nọc bò cạp qua cột 43 22 Điện di các phân đoạn của nọc bò cạp 49 vii MỤC LỤC Trang CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4 2.1. THU MUA BÒ CẠP, NUÔI VÀ XÁC ĐỊNH LOÀI 4 2.1.1. Khảo sát vùng và thời gian thu mua bò cạp, xác định tên 4 2.1.2. Nghiên cứu nuôi bò cạp trong phòng thí nghiệm 4 2.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NỌC BÒ CẠP 4 2.3. KHẢO SÁT TÍNH CHẤT HOÁ LÝ VÀ THÀNH PHẦN NỌC BÒ CẠP 5 2.4. KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA NỌC TRONG ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN Ở -20 0 C 5 2.5. XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH CẤP, BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA NỌC BÒ CẠP 5 2.5.1. Phương tiện nghiên cứu độc tính cấp 5 2.5.2. Phương pháp thực nghiệm xác định độc tính cấp 6 2.5.3. Phân tích thông kế xác định độc tính cấp 6 2.5.4. Phương tiện nghiên cứu độc tính bán trường diễn 7 2.5.5. Phương pháp thực nghiệm xác định độc tính bán trường diễn 7 2.5.6. Phân tích thống kê xác định độc tính bán trường diễn 8 2.6. KHẢO SÁT TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, KHÁNG VIÊM CỦ A NỌC BÒ CẠP 8 2.6.1. Phương tiện nghiên cứu 8 2.6.2. Phương pháp thực nghiệm tác dụng giảm đau trung ương 8 2.6.3. Phương pháp thực nghiệm giảm đau ngoại biên 8 2.6.4. Khảo sát tác động kháng viêm 9 2.6.5. Phân tích thống kê 9 2.7. KHẢO SÁT TÍNH CHẤT HOÁ LÝ VÀ THÀNH PHẦN NỌC viii SAU THỜI GIAN NUÔI 9 2.8. KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN SẮC KÝ LÊN CHUỘT NHẮT 10 2.9. TIÊU CHUẨN NỌC CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 11 3.1. THU MUA BÒ CẠP, NUÔI VÀ XÁC ĐỊNH LOÀI 11 3.1.1. Thu mua bò cạp và xác định loài 11 3.1.2. Nuôi bò cạp 12 3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NỌC 14 3.3. KHẢO SÁT TÍNH CHẤT HOÁ LÝ VÀ THÀNH PHẦN NỌC BÒ CẠP 18 3.3.1. Tính chất hoá lý của nọc bò cạp 18 3.3.2. Hàm lượng protein trong nọc và pH của nó 18 3.3.3. Thành phần protein của nọc 20 3.3.3.1. Phân tích nọc bằng phương pháp s ắc ký lọc gel 20 3.3.3.2. Khảo sát độc tính của các phân đoạn sắc ký 21 3.3.3.3. Kết quả điện di trên gel SDS-polyacrylamide 22 3.4. KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA NỌC TRONG ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN Ở -20 0 C 23 3.4.1. Hàm lượng protein trong nọc và pH của nó 23 3.4.2. Thành phần protein của nọc 24 3.4.2.1. Phân tích nọc bằng phương pháp sắc ký lọc gel 24 3.4.2.2. Khảo sát độc tính của các phân đoạn sắc ký 24 3.4.2.3. Kết quả điện di trên gel SDS-polyacrylamide 25 3.5. XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH CẤP, BÁN TRƯỜNG DIỄN 26 3.5.1. Xác định độc tính cấp 26 3.5.1.1. Tình trạng chung của chuột thử nghiệm 26 3.5.1.2. Kết quả xác định LD 0 và LD 100 27 3.5.1.3. Liều LD 50 đường tiêm tĩnh mạch 27 ix [...]... dược Trước tình hình đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài: Nghiên cứu nọc bò cạp Heterometrus sp với tác dụng kháng viêm, giảm đau tạo nguồn nguyên liệu dược Dưới đây chúng tôi xin báo cáo việc thưc hiện đề tài này 3 CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung 1: Thu mua bò cạp, nuôi và xác định loài 2.1.1 Khảo sát vùng và thời gian thu mua bò cạp, xác định tên Việc khảo sát khả năng thu mua bò cạp. .. trong dân gian, bò cạp được sử dụng rộng rãi làm nguồn dược liệu trong đó có tác dụng giảm đau hiệu quả, nhưng còn hạn chế trong việc nghiên cứu để sử dụng chúng làm nguồn dược liệu Nghiên cứu nọc bò cạp nâu (Lychas mucronatus họ Buthudae) của chúng tôi đã cho thấy trong nọc này có hai nhóm toxin với khối lượng phân tử 3500 – 5000 Da và 6000 – 8000 Da [15] Từ nọc bò cạp này chúng tôi đã tách ra và khảo... Độc tính bán trường diễn của nọc bò cạp đường tiêm dưới da 29 3.5.2.1 Khảo sát các chỉ số huyết học 30 3.5.2.2 Khảo sát các chỉ số sinh hoá 32 3.5.2.3 Giải phẫu bệnh gan thận 34 3.5.2.4 Sự thay đổi về thể trọng chuột 36 3.6 KHẢO SÁT TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, KHÁNG VIÊM CỦA NỌC BÒ CẠP 38 3.6.1 Tác dụng giảm đau trung ương 38 3.6.2 Tác dụng giảm đau ngoại biên 39 3.6.3 Tác dụng kháng viêm 39 3.7 KHẢO SÁT TÍNH... Genetech, rất quan tâm đến việc ứng dụng của chúng để sản xuất thuốc [2] Nọc bò cạp đã được chứng minh có tác dụng giảm đau [6] kháng viêm [28,39], chống co giật, động kinh [29,7] Những năm gần đây đã có những nghiên cứu nọc bò cạp loài Heterometrus để ứng dụng trong y dược [22,33] 2 II NHỮNG NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC Trong y học cổ truyền của Việt Nam, bò cạp được sử dụng là một trong các vị thuốc để điều... lấy sau giảm so với lần lấy đầu tiên - Sau 3 tháng nuôi và lấy nọc (lấy nọc lần thứ 7) tại các đốt lấy nọc của bò cạp bị tạo sẹo nên không còn nhạy cảm tốt với que kích thích lấy nọc nữa nên lượng nọc thu được giảm và số con cho nọc cũng giảm một cách đáng kể - Sau 6 tháng nuôi, bò cạp cho nọc kém, chỉ còn 0,56 mg/con (so với lúc đầu 1,77 mg/con) Với điều kiện lấy nọc như vậy thì từ một con bò cạp trung... kiếm nguồn nguyên liệu bò cạp khác đó là bò cạp đen Heterometrus sp 2) Qua khảo sát lượng bò cạp đen Heterometrus sp tại hai vùng Tây Ninh và An Giang cho thấy lượng bò cạp phong phú, có thể thu mua dễ dàng, một tuần có thể mua được 400-500 con 6000 bò cạp đã được tiến hành thu mua 2 đợt vào năm 2007 và 2008, mỗi đợt 3000 con trong khoảng thời gian từ tháng 5 đến tháng 11 3) Định danh bò cạp: mẫu bò cạp. .. & Fisher's Exact Test với phần mềm thống kê Minitab 14.0 2.6 Nội dung 6 Khảo sát tác dụng giảm đau, kháng viêm của nọc bò cạp 2.6.1 Phương tiện nghiên cứu - Nọc bò cạp thu được từ bò cạp đen thu mua ở An Giang bằng phương pháp kích thích điện Nọc bò cạp được hòa trong nước cất pha tiêm thành dung dịch để thử tác động dược lý - Chuột nhắt trắng (Mus musculus albinos) khỏe mạnh, giống ddY, cả hai phái... toxin này có tác dụng ức chế dây thần kinh bị kích thích Ngoài bò cạp nâu, ở Việt Nam còn có một số loài bò cạp đen Heterometrus như H.spinifer, H.petersii, H.laoticus, H.cyaneus, H sp [19] Những bò cạp này thường được gọi là bò cạp rừng vì chúng thường gặp trong rừng nhiệt đới Trong những năm gần đây việc phá rừng tràn lan nên bò cạp nâu rất ít, bò cạp đen còn rất nhiều và có thể nghiên cứu sử dụng chúng... khi đau quặn bụng và duỗi ít nhất một chân sau So sánh số lần đau quặn của chuột giữa các lô tại các thời điểm với nhau 2.6.4 Khảo sát tác động kháng viêm Nghiên cứu tác động kháng viêm theo phương pháp gây phù chân chuột bằng carrageenin [40] Tác động kháng viêm của dung dịch nọc bò cạp thô đường sát tiêm dưới da được khảo Carrageenin được cung cấp bởi Sigma Aldrich, được dùng làm tác nhân gây viêm. .. thí nghiệm, bò cạp đã tăng trọng lượng trung bình là 4,81 g/ 1 con Việc quan sát này chỉ để xác định có thể nuôi bò cạp trong phòng thí nghiệm nhằm thu nọc phục vụ nghiên cứu Chúng tôi chỉ nuôi và theo dõi trong 6 tháng, sau đó loại bỏ vì bò cạp không còn cho nọc hiệu quả Qua 6 tháng nuôi bò cạp ở phòng thí nghiệm, chúng tôi thấy đây chỉ là điều kiện nuôi bò cạp để lấy nọc phục vụ nghiên cứu, chứ chưa . nghiên cứu sử dụng chúng trong y dược. Trước tình hình đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài: Nghiên cứu nọc bò cạp Heterometrus sp. với tác dụng kháng viêm, giảm đau tạo nguồn nguyên liệu dược chuột 36 3.6. KHẢO SÁT TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, KHÁNG VIÊM CỦA NỌC BÒ CẠP 38 3.6.1. Tác dụng giảm đau trung ương 38 3.6.2. Tác dụng giảm đau ngoại biên 39 3.6.3. Tác dụng kháng viêm 39 3.7. KHẢ O. tài: Nghiên cứu nọc bò cạp Heterometrus sp. với tác dụng kháng viêm, giảm đau tạo nguồn nguyên liệu dược Chủ nhiệm đề tài: TSKH. Hoàng Ngọc Anh Cơ quan chủ trì: Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng,