ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM BỘ Y TẾ SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN PASTEUR TP.HCM B B A A Ù Ù O O C C A A Ù Ù O O N N G G H H I I E E Ä Ä M M T T H H U U ( ( đ đ a a õ õ c c h h ỉ ỉ n n h h s s ư ư û û a a t t h h e e o o y y ù ù k k i i e e á á n n c c u u û û a a H H o o ä ä i i Đ Đ o o à à n n g g n n g g h h i i e e ä ä m m t t h h u u n n g g a a ø ø y y 5 5 / / 1 1 1 1 / / 2 2 0 0 0 0 9 9 ) ) NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM TẠO HUYẾT THANH KHÁNG ðA ðỘC TỐ HAI LOẠI RẮN HỔ ðẤT (Naja kaouthia), VÀ HỔ CHÚA (Ophigophagus hannah) TRÊN THỎ Chủ nhiệm đề tài: 1. PGS.TS. NGUYỄN LÊ TRANG 2. Th.S. NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 11/ 2009 I BÁO CÁO NGHIỆM THU 1. Tên đề tài: Nghiên cứu thử nghiệm tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất (Naja kaouthia) và hổ chúa (Ophigophagus hannah) trên thỏ Chủ nhiệm đề tài: 1. PGS.TS. NGUYỄN LÊ TRANG 2. Th.S. NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU Cơ quan chủ trì: VIỆN PASTEUR TP.HCM Thời gian thực hiện đề tài: 23 tháng (11/2007- 9/2009) Kinh phí được duyệt: 320.000.000 đồng Kinh phí cấp đợt 1: 240.000.000 đồng theo TB 224 -12/11/2007 Kinh phí cấp đợt 2: 48.000.000 đồng theo TB 83 - 21/4/2009 2. Danh sách những người tham gia đề tài: STT Họ và tên Học hàm, học vị Cơ quan 1 2 3 4 5 Võ Thị Mỹ Duyên Đỗ Thị Châm Lạc Ngọc Thêm Dương Ngọc Diễm Doãn Thị Sim Th.S. Sinh học CN. Sinh học CN. Xét nghiệm CN. Sinh học Viện Pasteur TP.HCM ” ” ” ” 3. Mục tiêu: Nghiên cứu thử nghiệm tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất (Naja kaouthia) và hổ chúa (Ophigophagus hannah) trên thỏ 4. Nội dung: Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện Xác định độc lực của nọc rắn hổ đất và hổ chúa - Độc lực của nọc rắn hổ đất: LD 50 = 5,93 µg/chuột 18-20 gam - Độc lực của nọc rắn hổ chúa: LD 50 = 9,44 µg/chuột 18-20 gam II Tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ đất và hổ chúa và xác định độc lực của độc tố - Đã tiến hành tinh chế độc tố qua hai giai đoạn sắc ký lọc trên Sephadex G-50 và sắc ký trao đổi ion Biorex-70 - Đã xác định được các thành phần gây độc chính trong nọc hai loại rắn. Kết quả được tóm tắt trong bảng 1 (trang 20) và bảng 2 (trang 24). * Độc lực độc tố peak 3.1 (sau sắc ký trao đổi ion) của nọc hổ đất: LD 50 = 0,77µg/chuột 18-20 gam * Độc lực độc tố peak 3 (sau sắc ký lọc) của nọc hổ chúa: LD50 = 3,02 µg/chuột 18-20 gam Tạo huyết thanh kháng độc tố của hai loại rắn trên thỏ - Lô I: 3 thỏ (đánh số 17, 18, 19) được gây miễn dịch với độc tố peak 3.1 của nọc rắn hổ đất. - Lô II: 4 thỏ (đánh số 13, 14, 15, 16) được gây miễn dịch với độc tố peak 3 của nọc rắn hổ chúa. - Lô III: 4 thỏ (đánh số 7, 8, 11, 12) được gây miễn dịch với cả hai loại độc tố trên. Sau quá trình gây miễn dịch, thu nhận kháng huyết thanh và lưu trữ kháng thể dưới dạng tủa trong ammonium sulfate bão hòa 50%, 4 0 C. III Theo dõi đáp ứng miễn dịch bằng phản ứng ELISA - Tất cả các thỏ đều có kháng thể đặc hiệu đối với thành phần kháng nguyên đưa vào và hiệu giá kháng thể đặc hiệu tăng dần và cao nhất trong huyết thanh sau lần tiêm thứ 3 và hơi giảm trong huyết thanh sau lần tiêm thứ 4. - Sử dụng huyết thanh sau lần tiêm thứ 3 và thứ tư để thực hiện phản ứng trung hòa trên chuột. Xác định khả năng trung hòa của huyết thanh kháng độc tố đối với nọc toàn phần trên chuột - Huyết thanh kháng độc tố thần kinh rắn hổ đất có khả năng trung hòa với nọc rắn hổ đất và nọc rắn hổ chúa. - Huyết thanh kháng độc tố thần kinh rắn hổ chúa không có khả năng trung hòa với nọc hổ chúa (theo qui trình gây miễn dịch của đề tài). Đây là một vấn đề cần được nghiên cứu thêm. - Huyết thanh kháng đa độc tố của hai loài rắn hổ đất và rắn hổ chúa có khả năng trung hòa với nọc rắn hổ đất và nọc rắn hổ chúa. Kháng huyết thanh đa giá có thể cải thiện hiệu giá trung hòa đối với nọc rắn hổ chúa so với tác dụng trung hòa chéo của huyết thanh kháng độc tố thần kinh rắn hổ đất. Tuy nhiên tác dụng trung hòa đối với nọc rắn hổ đất bị giảm. Viết báo cáo Hoàn thành báo cáo IV 4. Sản phẩm của đề tài: 1. Kết quả xác định độc lực của nọc rắn hổ đất và hổ chúa trên chuột nhắt trắng 2. Độc tố của nọc rắn hổ đất và hổ chúa sau tinh chế 3. Các thành phần gây độc của nọc hổ chúa và hổ đất sau tinh chế 4. Kết quả xác định độc lực của các thành phần gây độc 5. Kháng thể thỏ kháng độc tố của rắn hổ đất và hổ chúa ở dạng tủa trong ammonium sulfate bão hòa 50% 6. Kết quả xác định hiệu lực trung hòa nọc toàn phần của 3 loại kháng thể thỏ (kháng độc tố hổ đất, kháng độc tố hổ chúa, kháng độc tố hỗn hợp) sau tinh chế trên chuột. 7. Báo cáo nghiệm thu đề tài V TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HUYẾT THANH ĐA ĐỘC TỐ KHÁNG HAI LOÀI RẮN HỔ ĐẤT (Naja kaouthia) VÀ HỔ CHÚA (Ophigophagus hannah) TRÊN THỎ Các phân đoạn độc tố thần kinh có trọng lượng phân tử thấp được tinh chế từ nọc của hai loài rắn hổ đất và hổ chúa. Đây là những phân đoạn độc tố gây chết chủ yếu trong nọc. Kháng huyết thanh được chế tạo bằng cách gây miễn dịch trên 3 lô thỏ: lô I- gây miễn dịch với độc tố thần kinh của nọc rắn hổ đất; lô II- gây miễn dịch với độc tố thần kinh của nọc hổ chúa và lô III- gây miễn dịch với phức hợp hai loại độc tố trên. Huyết thanh kháng độc tố rắn hổ đất của thỏ ở lô I có khả năng trung hòa nọc hổ đất với hiệu giá là 60 LD 50 /mL huyết thanh, đồng thời có tác dụng trung hòa chéo nọc rắn hổ chúa với hiệu giá là 13,3 LD 50 /mL huyết thanh. Huyết thanh kháng đa độc tố của thỏ ở lô III có khả năng trung hòa nọc hổ đất với hiệu giá là 35 LD 50 /mL huyết thanh và trung hòa nọc hổ chúa với hiệu giá là 25 LD 50 /mL huyết thanh. Huyết thanh kháng độc tố rắn hổ chúa của thỏ lô II không có khả năng trung hòa nọc hổ chúa cũng như phân đoạn độc tố hổ chúa. VI SUMMARY OF RESEARCH CONTENT PRODUCTION OF ANTI-POLYTOXINS AGAINST TWO ELAPID VENOMS : Naja kaouthia AND Ophiophagus hannah Low molarcular weigh neurotoxin fractions were isolated from the venom of Naja kaouthia and Ophiophagus hannah. These fractions were the major lethal toxin fractions in these venoms. Antisera were prepared by immunizing rabbits with the Naja kaouthia neurotoxin fraction (group I), the Ophiophagus hannah neurotoxin fraction (group II) and the mixture of both neurotoxin fractions (group III), respectively. The potency of sera from group I and group III rabbits against the toxicity of the Naja kaouthia venom were 60 LD 50 and 35 LD 50 /ml serum. The serum of group II rabbits gave no protection against the toxicity of the Ophiophagus hannah venom as well as of the Ophiophagus hannah neurotoxin fraction. The potency of sera from group I and group III against the toxicity of the Ophiophagus hannah venom were 13 LD 50 and 25 LD 50 /ml serum. VII MỤC LỤC Trang Tóm tắt báo cáo I Mục lục VII Danh sách các chữ viết tắt X Danh sách bảng XI Danh sách hình XI CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1.1. Tình hình nhiễm nọc độc rắn 1 1.2. Độc tố nọc rắn hổ 1 1.3. Huyết thanh kháng nọc rắn hổ 2 1.4. Huyết thanh đơn giá và huyết thanh đa giá kháng nọc rắn 3 1.5. Tình hình sản xuất huyết thanh kháng nọc trên thế giới và tại Việt Nam 4 1.6. Đặt vấn đề 4 CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 6 CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 7 3.1. Phương pháp xác định độc lực của nọc rắn hổ đất và hổ chúa 7 3.1.1. Vật liệu 7 3.1.2. Phương pháp 7 3.1.2.1. Các thông số kỹ thuật 8 3.1.2.2. Gây nhiễm 8 3.2. Phương pháp tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ đất và nọc rắn hổ chúa 9 3.2.1. Vật liệu 9 3.2.2. Phương pháp 9 3.3. Phương pháp tạo huyết thanh kháng độc tố của hai loài rắn hổ đất và hổ chúa 9 3.3.1. Vật liệu 9 3.3.2. Phương pháp 10 VIII 3.4. Phương pháp kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của thỏ 10 3.4.1. Nguyên tắc 10 3.4.2. Vật liệu 10 3.4.3. Phương pháp 11 3.5. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu với các độc tố bằng phản ứng ELISA 11 3.5.1. Phương pháp gắn biotin vào độc tố 11 3.5.2. Kỹ thuật ELISA hai kháng nguyên kẹp kháng thể 12 3.6. Phương pháp tách và lưu trữ kháng thể bằng kỹ thuật tủa với ammonium sulfate 50% độ bão hòa 13 3.6.1. Nguyên tắc 13 3.6.2. Vật liệu 14 3.6.3. Tiến hành 14 3.7. Phương pháp xác định hiệu lực trung hòa độc lực nọc toàn phần của kháng thể kháng độc tố trên chuột 15 3.7.1. Vật liệu và các thông số kỹ thuật 16 3.7.2. Phản ứng trung hòa 16 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 4.1. Kết quả 18 4.1.1. Xác định độc lực của nọc rắn hổ đất và hổ chúa 18 4.1.2. Tinh chế độc tố và xác định độc tính 18 4.1.2.1. Tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ đất (Naja kaouthia) 18 a) Tinh chế qua sắc ký lọc Sephadex G-50 superfine 18 b) Tinh chế độc tố của nọc rắn hổ đất qua sắc ký trao đổi ion BioRex -70 19 c) Phân tích độ tinh khiết peak 3.1 trên điện di gel SDS-PAGE gradient 8- 18% 20 4.1.2.2. Tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ chúa (Ophigophagus hannah) 21 a) Tinh chế qua sắc ký lọc Sephadex G-50 superfine 21 IX b) Tinh chế độc tố của nọc hổ chúa qua sắc ký trao đổi ion Bio-Rex 70 22 c) Phân tích độ tinh khiết độc tố trên điện di gel SDS- PAGE gradient 8- 18% 23 4.1.3. Gây miễn dịch và theo dõi đáp ứng miễn dịch 25 4.1.3.1. Gây miễn dịch trên 3 lô thỏ thí nghiệm 25 4.1.3.2. Theo dõi đáp ứng miễn dịch bằng phương pháp khuếch tán miễn dịch kép Ouchterlony 25 4.1.3.3. Theo dõi đáp ứng miễn dịch bằng phương pháp Elisa 26 4.1.4. 4.1.4.1. 4.1.4.2. 4.1.4.3. 4.2. Xác định khả năng trung hòa của huyết thanh kháng độc tố đối với nọc toàn phần trên chuột Khả năng trung hòa đối với nọc hổ đất toàn phần Khả năng trung hòa đối với nọc hổ chúa toàn phần Khả năng trung hòa đối với độc tố peak 3 của nọc hổ chúa Bàn luận 29 29 29 30 30 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC 1 37 PHỤ LỤC 2 44 PHỤ LỤC 3 47 [...]... c a hai lo i r n h đ t và r n h chúa 2.7 Xác đ nh hi u l c trung hòa c a t ng lo i kháng huy t thanh v i n c tồn ph n c a hai lo i r n trên -6- S Khoa H c & Cơng Ngh TP.HCM Báo cáo nghi m thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế t o huy t thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ CHƯƠNG III: V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 3.1 Phương pháp xác đ nh đ c l c c a n c r n h đ t và h chúa: ... ng th i hai lo i đ c t gây ch t đư c tách t n c c a chúng có trình t amino -4- S Khoa H c & Cơng Ngh TP.HCM Báo cáo nghi m thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế t o huy t thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ acid tương đ ng cao (28) Vì th , chúng tơi d đ nh th c hi n nghiên c u qui trình t o huy t thanh đa giá kháng đ c t c a lồi r n h đ t (Naja kaouthia) và lồi r n h chúa (Ophigophagus... Báo cáo nghi m thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế t o huy t thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ 3.3.2 Phương pháp: 3.3.2.1 T o huy t thanh kháng đ c t c a n c r n h đ t và h chúa: * Lơ I: 3 th (đánh s 17, 18, 19) đư c gây mi n d ch v i đ c t peak 3.1 c a n c r n h đ t đ t o huy t thanh kháng đ c t r n h đ t Li u tiêm mũi th 1 là 32 µg/th và gi m ½ li u nh ng mũi tiêm k ti p... TP.HCM Báo cáo nghi m thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế t o huy t thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ • Ngư i ta nh n th y r ng kh năng b o v c a kháng huy t thanh s tăng khi nó đư c đưa vào trư c FLT [36] Tuy nhiên, LMT hay FLT đ u l thu c vào m t s ph n ng sinh lý ph c t p, khác nhau tùy theo lồi đ ng v t và con v t và tùy theo lồi và con r n gây đ c Hi n nay cho dù chúng... Cho kháng th trong huy t thanh k t h p v i đ c t trên pha r n: - Cho 100 µl m u huy t thanh pha lỗng 1/100 vào m i gi ng - 37°C trong 60 phút - R a 3 l n v i đ m PBS – 0.05% Tween 20 đ lo i b protein còn th a -12- S Khoa H c & Cơng Ngh TP.HCM Báo cáo nghi m thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế t o huy t thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ c) Cho đ c t – biotin k t h p v i kháng. .. (Ophigophagus hannah) qua đó kh o sát kh năng trung hòa đ c l c n c r n tồn ph n c a chúng Thành cơng c a đ tài s là ti n đ cho vi c nghiên c u t o huy t thanh đa giá d a trên đ c t đ i v i các lồi r n cùng h r n h ph bi n t i Vi t Nam -5- S Khoa H c & Cơng Ngh TP.HCM Báo cáo nghi m thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế t o huy t thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ CHƯƠNG II : N I DUNG NGHIÊN... ch huy t thanh đư c pha lỗng thành lo t theo b c hai 200µL dung d ch kháng huy t thanh v i 3 LD50 c a dung d ch n c hay đ c t t i 37°C trong 30 phút Tiêm 0,2 ml h n h p trên vào tĩnh m ch đi chu t Quan sát k t qu trong vòng 48 gi k t lúc tiêm -16- S Khoa H c & Cơng Ngh TP.HCM Báo cáo nghi m thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế t o huy t thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ Cơng... 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế t o huy t thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ Hình 7: Phân tách n c r n h chúa b ng s c ký l c G-50 Superfine b) Tinh ch đ c t c a n c h chúa qua s c ký trao đ i ion Bio-Rex 70: S c ký đ c a q trình tinh ch đ c t c a n c r n h chúa qua s c ký trao đ i ion BioRex -70 đư c bi u di n trên hình 8 Qua giai đoạn này ta thu được 5 peak có lượng và độc tính... cáo nghi m thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế t o huy t thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ - Dung d ch huy t thanh th sau l n tiêm th 2 - Hóa ch t khác đ u đ t m c đ phân tích 3.4.3 Phương pháp: - Làm th ch agar 1% (6 x 6 x 0,2cm) trong đ m PBS - Đ c các gi ng (th tích c a m t gi ng kho ng 20 µl) trên th ch và cho m u vào các gi ng - Đ th ch vào h p đóng kín: 100% đ m 40C... u tr b ng huy t thanh đa giá góp ph n làm gi m đáng k s ngư i ch t trong -3- S Khoa H c & Cơng Ngh TP.HCM Báo cáo nghi m thu - 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế t o huy t thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ nh ng trư ng h p lồi r n c n khơng xác đ nh đư c M t s th y thu c ch ng l i có đ nh ki n vi c s d ng huy t thanh đa giá vì cho r ng nó ít hi u qu hơn huy t thanh đơn giá Đi . đề cần được nghiên cứu thêm. - Huyết thanh kháng đa độc tố của hai loài rắn hổ đất và rắn hổ chúa có khả năng trung hòa với nọc rắn hổ đất và nọc rắn hổ chúa. Kháng huyết thanh đa giá có thể. 9/2009 Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ -2- 1.3. Huyết thanh kháng nọc rắn hổ: Dùng huyết thanh kháng nọc rắn được xem như. gây độc của hai lồi rắn: hổ đất (Naja kaouthia) và hổ chúa (Ophigophagus hannah) 2.3. Tạo huyết thanh kháng độc tố của nọc rắn hổ đất Naja kaouthia 2.4. Tạo huyết thanh kháng độc tố của nọc rắn