Đang tải... (xem toàn văn)
LỜI MỞ ĐẦU Ung thư là căn bệnh có nguy cơ toàn cầu vì mức độ lan rộng cũng như tỉ lệ gia tăng số người mắc bệnh ngày càng cao. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) số người tử vong vì ung thư vào năm 2008 là 7,6 triệu, chiếm 13% trong tổng số ca tử vong. Ở Việt Nam, ung thư là một vấn đề được toàn xã hội quan tâm vì mức độ gia tăng nhanh chóng cũng như nhiều hạn chế trong điều trị. Với chức năng kích thích sự biệt hóa, tăng sinh, trưởng thành và chức năng của các tế bào bạch cầu trung tính trong vùng máu ngoại vi chống lại sự nhiễm khuẩn và các rủi ro khác khi điều trị ung thư, G-CSF đã được quan tâm sản xuất trong nhiều hệ thống biểu hiện khác nhau như vi khuẩn, nấm men, tế bào động vật... Trong đó, G-CSF tái tổ hợp đươc biểu hiện trong hệ thống vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) được sử dụng rộng rãi do có ưu điểm nuôi cấy đơn giản, chi phí sản xuất thấp, và năng suất cao, tuy nhiên, protein thu nhận được thường ở dạng thể vùi, và không có hoạt tính sinh học. Gần đây, Spela Petenel và cộng sự đã khám phá ra một dạng mới của thể vùi khi biểu hiện vượt mức trong tế bào E.coli, bên trong lớp thể vùi có cấu trúc gấp cuộn sai là các tiền chất gấp cuộn đúng, dễ dàng hoà tan trong dung dịch chất biến tính nhẹ, và đặc biệt là có hoạt tính sinh học sau khi hoà tan, được nhóm tác giả này gọi là thể vùi không điển hình (non classical inclusion body). Năm 1991, sản phẩm G-CSF tái tổ hợp đầu tiên được thương mại hóa có tên Neupogen, do công ty Amgen - Hoa Kỳ sản xuất, với giá thành một lọ tiêm 300µg/ml khoảng 1,7 triệu đồng. Do mức độ đào thải Neupogen ra khỏi cơ thể bởi các protease cũng như là khả năng gây đáp ứng miễn dịch trong tế bào khá cao, nên người bệnh cần phải được tiêm nhắc mỗi ngày trong suốt quá trình điều trị ung thư. Một lần nữa công ty Amgen đã đi đầu trong nghiên cứu khắc phục nhược điểm của Neupogen bằng cách tiến hành dung hợp G-CSF với chất cao phân tử Polyethylenglycol (PEG) và đã dung hợp thành công G-CSF với NH 2 -PEG20kDa tại vị trí đầu N của protein, Năm 2002, cơ quan quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa kỳ đã phê duyệt và đồng ý cho sản phẩm dung hợp này, có tên thương mại là Neulasta, được sử dụng thay thế cho các protein G-CSF tái tổ hợp đơn thuần, giúp cho quá trình điều trị ung thư dễ dàng và chi phí cũng thấp hơn. Việc nhập khẩu các sản phẩm G-CSF cũng như PEG-G-CSF từ nước ngoài để điều trị cho các bệnh nhân đã làm cho chi phí điều trị tăng lên khá cao và không phù hợp với phổ rộng người bệnh nước ta. Do đó, việc nghiên cứu các qui trình công nghệ để sản xuất protein G-CSF tái tổ hợp dung hợp với chất cao phân tử PEG nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước, giúp giảm chi phí điều trị, phù hợp với thu nhập của đại bộ phận bệnh nhân nước ta là một yêu cầu cấp thiết. Với mục tiêu như trên, chúng tôi thực hiện đề tài thạc sỹ: “Khảo sát lên men, thua nhận, tinh chế và dung hợp Grannlocyte colony stimulati factor (G-CSF) tái tổ hợp từ E. coli với Polyethylenglycol (PEG)” với các nội dung chính như sau: – Cảm ứng biểu hiện hG-CSF dạng thể vùi không điển hình – Khảo sát khả năng thu nhận hG-CSF có hoạt tính từ thể vùi không điển hình – Khảo sát khả năng hoà tan thể vùi không điển hình bằng N-lauroylsarcosine, Tween20 và DMSO – Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình dung hợp hG-CSF với chất cao phân tử Polyethyleneglycol (PEG) bằng enzyme transglutaminase (TGase) – Tinh sạch protein sau quá trình dung hợp – Phân tích trọng lượng phân tử của protein dung hợp sau tinh chế bằng phương pháp phổ khối (mass spectrometry)
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN QUANG HUY KHẢO SÁT LÊN MEN, THU NHẬN, TINH CHẾ VÀ DUNG HỢP GRANULOCYTE COLONY STIMULATI FACTOR (G-CSF) TÁI TỔ HỢP TỪ E. COLI VỚI POLYETHYLENGLYCOL (PEG) Chuyên ngành: VI SINH Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. ĐẶNG THỊ PHƯƠNG THẢO Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2012 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến GS.TS Trần Linh Thước, người thầy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em học tập và hoàn thành luận văn này. Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS. Đặng Thị Phương Thảo, người cô đã trực tiếp hướng dẫn khoa học, dạy bảo, giúp đỡ, quan tâm và động viên tinh thần những lúc em gặp khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn GS. Kaeko Kamei, Viện công nghệ Kyoto, Nhật Bản, đã luôn tạo mọi điều kiện để em có thể nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận văn Thạc sĩ một cách tốt nhất. Em xin chân thành cảm ơn chị Tú Anh, đã luôn nhiệt tình giúp đỡ em những lúc em gặp khó khăn trong công việc cũng như trong cuộc sống trong suốt thời gian em học tập ở Nhật. Chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn và các em phòng thí nghiệm CNSH Phân tử và Môi trường, phòng thí nghiệm Lên Men đã gợi mở và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm việc và nghiên cứu. Với lòng kính trọng và biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô giáo đã dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian học Đại học và sau Đại học. Và trên hết, con xin cảm ơn bố mẹ đã nuôi con khôn lớn, cho con nghị lực để vượt qua khó khăn. Cảm ơn các anh chị luôn yêu thương giúp đỡ em. Gia đình luôn là điểm tựa vững chắc cho con. TP. Hồ Chí Minh, ngày 03 tháng 09 năm 2012 Nguyễn Quang Huy MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH iii LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. NHÂN TỐ KÍCH THÍCH DÕNG BẠCH CẦU HẠT – GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR (G-CSF) 3 1.1. Giới thiệu chung 3 1.2. Cấu trúc và hình thái 3 1.3. Nguồn gốc và cơ chế hoạt động 5 1.3.1. Nguồn gốc 5 1.3.2. Cơ chế hoạt động 6 1.3.2.1. Sự tương tác của G-CSF với thụ thể 6 1.3.2.2. Con đường tín hiệu có liên quan 8 1.4. Hoạt tính sinh học 9 2. PHƯƠNG PHÁP CHỮA BỆNH NEUTROPENIA BẰNG G-CSF 11 2.1. Bệnh Neutropenia 11 2.2. Chữa bệnh Neutropenia bằng G-CSF 12 2.3. Một số sản phẩm G-CSF thương mại 14 3. SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN G-CSF Ở ESCHERICHIA.COLI 16 3.1. G-CSF dạng thể vùi điển hình 16 3.2. G-CSF dạng thể vùi non-classical (thể vùi không điển hình) 18 4. SẢN XUẤT THỂ VÙI KHÔNG ĐIỂN HÌNH 22 4.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành thể vùi không điển hình G-CSF 22 4.2. Đánh giá thể vùi không điển hình 24 4.2.1. Phân tích phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) 24 4.2.2. Đánh giá khả năng hòa tan trong dung môi gây biến tính nhẹ 25 4.2.3. Xác định đặc tính của thể vùi bằng kính hiển vi điện tử 25 4.2.4. Xác định xứ thay đổi thể tích thể vùi trong các điều kiện pH 26 5. DUNG HỢP VÀ TINH CHẾ PROTEIN G-CSF 27 5.1. Dung hợp protein 27 5.2. Tinh chế protein 31 5.2.1. Sắc ký trao đổi ion 31 5.2.2. Sắc ký lọc gel 34 5.2.3. Đánh giá hiệu quả của quá trình tinh chế 35 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 1. VẬT LIỆU 36 1.1. Thiết bị - dụng cụ 36 1.2. Hóa chất 37 1.2.1. Hóa chất dùng cho nuôi cấy vi sinh 37 1.2.2. Hóa chất dùng để phá tế bào 37 1.2.3. Hóa chất dùng cho điện di SDS-PAGE 38 1.2.4. Hóa chất dùng trong điện di NATIVE-PAGE 39 1.2.5. Hóa chất nhuộm bạc 39 1.2.6. Hóa chất lai Western 39 1.2.7. Hóa chất dùng cho định lượng protein bằng phương pháp Bradford 40 1.2.8. Hóa chất tinh chế bằng sắc ký trao đổi anion 40 1.2.9. Hóa chất thử nghiệm hoạt tính G-CSF 40 1.2.10.Hóa chất dùng trong sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC) 40 1.2.11.Hóa chất dùng trong dung hợp protein 40 1.2.12.Hóa chất dùng trong phân tích phổ khối (mass spectrometry) 41 1.3. Môi trường 41 1.4. Nguyên vật liệu 42 1.4.1. Chủng vi sinh vật 42 [...]... phù hợp với thu nhập của đại bộ phận bệnh nhân nước ta là một yêu cầu cấp thiết Với mục tiêu như trên, chúng tôi thực hiện đề tài thạc sỹ: Khảo sát lên men, thua nhận, tinh chế và dung hợp Grannlocyte colony stimulati factor (G-CSF) tái tổ hợp từ E coli với Polyethylenglycol (PEG) với các nội dung chính như sau: – Cảm ứng biểu hiện hG-CSF dạng thể vùi không điển hình – Khảo sát khả năng thu nhận... bằng cách tiến hành dung hợp G-CSF với chất cao phân tử Polyethylenglycol (PEG) và đã dung hợp thành công G-CSF với NH2-PEG20kDa 1 Luận văn Thạc sĩ Sinh học tại vị trí đầu N của protein, Năm 2002, cơ quan quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa kỳ đã phê duyệt và đồng ý cho sản phẩm dung hợp này, có tên thương mại là Neulasta, được sử dụng thay thế cho các protein G-CSF tái tổ hợp đơn thu n, giúp cho quá... hG-CSF có hoạt tính từ thể vùi không điển hình – Khảo sát khả năng hoà tan thể vùi không điển hình bằng N-lauroylsarcosine, Tween20 và DMSO – Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình dung hợp hG-CSF với chất cao phân tử Polyethyleneglycol (PEG) bằng enzyme transglutaminase (TGase) – Tinh sạch protein sau quá trình dung hợp – Phân tích trọng lượng phân tử của protein dung hợp sau tinh chế bằng phương... G-CSF chuột lần đầu tiên được nhận diện và tinh chế tại Úc vào năm 1983 Đến năm 1986, G-CSF người chính thức được tạo dòng phân tử bởi Nigata và cộng sự, họ sử dụng mẫu dò oligonucleotide để thu nhận cDNA mong muốn bằng lai Southern Blot [9] Từ đó mở ra một thời kì sản xuất G-CSF tái tổ hợp số lượng lớn trên vi sinh thông qua kĩ thu t tái tổ hợp DNA 1.2 Cấu trúc và hình thái Gen g-csf mã hóa cho G-CSF... dàng và chi phí cũng thấp hơn Việc nhập khẩu các sản phẩm G-CSF cũng như PEG-G-CSF từ nước ngoài để điều trị cho các bệnh nhân đã làm cho chi phí điều trị tăng lên khá cao và không phù hợp với phổ rộng người bệnh nước ta Do đó, việc nghiên cứu các qui trình công nghệ để sản xuất protein G-CSF tái tổ hợp dung hợp với chất cao phân tử PEG nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước, giúp giảm chi phí điều trị, phù hợp. .. không điển hình với các tỉ lệ hòa tan khác nhau 77 Hình 3.10 Kết quả dung hợp G-CSF với PEG5kDa ở các khoảng thời gian khác nhau 78 Hình 3.11 Kết quả dung hợp PEG5kDa với G-CSF ở hai hệ đệm nước miliQ và phosphate buffer 80 Hình 3.12 Kết quả khảo sát nhiệt độ tối ưu cho enzyme TGase hoạt động 81 Hình 3.13 Kết quả tinh sạch sản phẩm sau dung hợp bằng phương pháp... TransGlutaminase ii DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 So sánh ưu nhược điểm của mỗi phương pháp sản xuất protein ở E .coli 16 Bảng 1.2 So sánh ưu điểm và nhược điểm giữa việc sản xuất protein tái tổ hợp ở dạng thể vùi điển hình và thể vùi không điển hình 21 Bảng 2.1 Môi trường lên men chủng E coli BL21(DE3)/pET-G-CSF (TV) 42 Bảng 2.2 Thí nghiệm đo Bradford với dung dịch chuẩn Albumin ... thu được trong các dung dịch biến tính nhẹ Do đặc điểm cấu trúc như vậy, thể vùi không điển hình cũng ổn định trong tế bào, protein mục tiêu được giữ tránh khỏi sự phân cắt của các protease nội bào, và thể vùi này cũng có thể thu nhận dễ dàng theo cách thu nhận thể vùi điển hình (a) (b) Sinh khối E coli Sinh khối E coli Thể vùi Thể vùi Hòa tan và tái gấp cuộn Hòa tan Tinh chế Tinh chế G-CSF G-CSF Hình... chi phí rất cao và không phù hợp với thực tế ở Việt Nam Nếu G-CSF được sản xuất với một lượng lớn, giá thành rẻ thì đây sẽ là một tác nhân liệu pháp khắc phục nhiều trường hợp bệnh nhân bị bệnh liên quan đến neutropenia do hóa trị ung thư Hiện nay, hầu hết G-CSF thương mại được sản xuất theo mô hình DNA tái tổ hợp trong E coli, nấm men, CHO… 3 SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN G-CSF Ở ESCHERICHIA COLI Có nhiều hệ... Được tạo ra với lượng lớn Nhược điểm - Cần công đoạn tái gấp trong tế bào cuộn phức tạp và tốn kém - Tránh được tác dụng của các nhằm protease nội bào lên protein protein có hoạt tính mục tiêu - Không thân thiện với môi - Dễ dàng thu nhận từ tế bào (classical IBs) trường thu được dạng - Chi phí cao, thời gian và công sức lớn - Hiệu suất thu nhận thấp Thể vùi không điển hình - Giảm chi phí và thời gian . QUANG HUY KHẢO SÁT LÊN MEN, THU NHẬN, TINH CHẾ VÀ DUNG HỢP GRANULOCYTE COLONY STIMULATI FACTOR (G-CSF) TÁI TỔ HỢP TỪ E. COLI VỚI POLYETHYLENGLYCOL (PEG) Chuyên ngành:. điều kiện pH 26 5. DUNG HỢP VÀ TINH CHẾ PROTEIN G-CSF 27 5.1. Dung hợp protein 27 5.2. Tinh chế protein 31 5.2.1. Sắc ký trao đổi ion 31 5.2.2. Sắc ký lọc gel 34 5.2.3. Đánh. NEUTROPENIA BẰNG G-CSF 11 2.1. Bệnh Neutropenia 11 2.2. Chữa bệnh Neutropenia bằng G-CSF 12 2.3. Một số sản phẩm G-CSF thương mại 14 3. SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN G-CSF Ở ESCHERICHIA.COLI