ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 604429 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. NGUYỄN VĂN RI Hà Nội – Năm 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 3 1.1. Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV 3 1.2. Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 6 1.3. Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng thuốc HIV 7 1.3.1.Các phƣơng pháp sắc ký 7 1.3.2.Phƣơng pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis-CE) 8 1.4. Giới thiệu chung về phƣơng pháp điện di mao quản 9 1.4.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp điện di mao quản 9 1.4.2. Thiết bị của phƣơng pháp điện di mao quản 10 1.4.3. Các quá trình xảy ra trong mao quản 11 1.4.4. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phƣơng pháp điện di mao quản 12 1.4.5. Điện di mao quản vùng (CZE) 12 1.4.6. Phƣơng pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 13 1.4.7. Phân tích định lƣợng theo điện di mao quản 23 CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 24 2.1.1. Điều kiện nghiên cứu 24 2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1. Nội dung nghiên cứu 26 2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 26 CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ƣu điều kiện tách 3TC,NVP và AZT 29 3.1.1. Chọn bƣớc sóng phát hiện chất 29 3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản 31 3.1.3. Chọn phƣơng pháp bơm mẫu 32 3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng 33 3.1.5. Lựa chọn cơ chế tách 34 3.1.6. Ảnh hƣởng pH của dung dịch đệm điện di 36 3.1.7. Ảnh hƣởng của thành phần dung dịch đệm 39 3.1.8. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất tạo mixen SDS 39 3.1.9. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ đệm 41 3.1.10. Khảo sát ảnh hƣởng thời gian bơm mẫu 43 3.1.11. Khảo sát ảnh hƣởng thế điện di 45 3.1.12. Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ của mao quản 46 3.1.13.Tổng kết điều kiện tối ƣu 47 3.1.14. Định tính 3TC, AZT và NVP trong điều kiện điện di thiết lập 47 3.2. Đánh giá phƣơng pháp phân tích. 50 3.2.1. Khảo sát tính tƣơng thích hệ thống 50 3.2.2 Tính đặc hiệu 50 3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đƣờng chuẩn 52 3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) 56 3.2.5. Độ lặp lại của phƣơng pháp 57 3.2.6. Độ đúng của phƣơng pháp 58 3.2.7. Kết quả định lƣợng trong chế phẩm 61 3.3. Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 63 3.4. Hƣớng phát triển của đề tài 64 KẾT LUẬN 65 DANH MỤC CÁC BẢNG STT bảng Tên bảng Trang 1.1 Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MEKC 19 3.1 Tổng kết các điều kiện điện di tối ƣu 47 3.2 Kết quả khảo sát tính tƣơng thích hệ thống 49 3.3 Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ 3TC tƣơng ứng 52 3.4 Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ AZT tƣơng ứng 54 3.5 Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ NVP tƣơng ứng 55 3.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) 57 3.7 Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định lƣợng 3TC 57 3.8 Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định lƣợng AZT 58 3.9 Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định lƣợng NVP 58 3.10 Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp trên thêm chuẩn 3TC 59 3.11 Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp trên thêm chuẩn AZT 60 3.12 Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp trên thêm chuẩn NVP 60 3.13 Kết quả định lƣợng viên nén Avocomb-N 61 3.14 Kết quả định lƣợng viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300mg 62 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản 11 1.2 Quá trình tách các chất trong CZE 13 1.3 Cấu trúc của Mixen và dòng EOF trong MEKC 15 1.4 Cấu trúc không gian của β- cyclodextrin 20 1.5 Cấu trúc không gian của phân tử α-CD, β- CD, γ- CD 21 1.6 Cấu trúc phân tử của phân tử α-CD, β- CD, γ- CD 22 3.1 Phổ hấp thụ của 3TC, AZT và NVP 31 3.2 Khảo sát cơ chế tách CZE, MEKC 35 3.3 Điện di đồ ở pH 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17. 37 3.4 Điện di đồ tại nồng độ SDS 25mM; 50mM và 75mM 40 3.5 Điện di đồ tại nồng độ đệm 5mM; 10mM và 20mM 42 3.6 Điện di đồ tại thời gian bơm mẫu 3s, 5s và 7s 44 3.7 Điện di đồ tại thế điện di 15kV; 20kV và 22 kV 46 3.8 Điện di đồ của 3TC, AZT và NVP tại điều kiện tối ƣu 48 3.9 Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP tại điều kiện tối ƣu 48 3.10 Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau khi thêm 3TC tại điều kiện tối ƣu 49 3.11 Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau khi thêm AZT tại điều kiện tối ƣu 49 3.12 Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau khi thêm NVP tại điều kiện tối ƣu 49 3.13 Điện di đồ mẫu trắng 51 3.14 Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP 51 3.15 Điện di đồ của chế phẩm làm việc 3TC, AZT và NVP 51 3.16 Điện di đồ của chế phẩm làm việc 3TC, AZT và NVP thêm hỗn hợp chuẩn 52 3.17 Đƣờng chuẩn biểu thị quan hệ giữa Diện tích pic và nồng độ 3TC 53 3.18 Đƣờng chuẩn biểu thị quan hệ giữa Diện tích pic và nồng độ AZT 54 3.19 Đƣờng chuẩn biểu thị quan hệ giữa Diện tích pic và nồng độ NVP 55 3.20 Điện di đồ viên nén Avocomb-N 62 3.21 Điện di đồ viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300mg 63 DANH MỤC VIẾT TẮT HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human Immunodeficiency Virus) AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở ngƣời (Acquired immunodeficiency syndrome) ARV Thuốc kháng virut USP Dƣợc điển Mỹ (United State Pharmacopiea) CE Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis) CEC Điện sắc ký mao quản (Capillary Electrochromatography) CGE Điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis) CZE Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis) DAD Detector mảng diod (Diod Array Detector) EOF Dòng điện thẩm (Electro- osmotic Flow) HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) MEKC Sắc ký điện động micell (Micellar Electrokinetic chromatography) S pic Diện tích pic t m Thời gian di chuyển (Migration times) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) RSD % Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation) STT Số thứ tự AZT Zidovudine LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantity) NVP Nevirapine D4T Stavudine 3TC Lamivudine 1 MỞ ĐẦU Theo phân tích của các chuyên gia, tổng số ngƣời nhiễm HIV vẫn đang tiếp tục duy trì sự sống ngày càng đƣợc tăng cao là hệ quả của hai tác động chủ yếu. Một là số ngƣời nhiễm HIV hàng năm trên toàn cầu vẫn ở mức cao. Chỉ tính riêng năm 2008, thế giới vẫn có khoảng 2,7 triệu ngƣời mới nhiễm HIV. Hai là do kết quả tích cực của liệu pháp điều trị kháng virut (ARV) làm giảm số ngƣời tử vong, kéo dài sự sống cho ngƣời bệnh. Đến tháng 12/2008 ƣớc tính khoảng 4 triệu ngƣời nhiễm HIV ở các nƣớc có thu nhập thấp và trung bình đƣợc điều trị bằng thuốc kháng HIV, tăng lên 10 lần trong vòng 5 năm. Trong vòng 4 năm (2004- 2008) nhờ chăm sóc điều trị tốt, số ngƣời chết do AIDS đã giảm 10% [12]. HIV/AIDS đang là vấn đề lớn hiện nay trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam. Ở nƣớc ta Thành Phố Hồ Chí Minh là nơi có nhiều ca nhiễm HIV/AIDS nhất (Sau đó là Hội An, An Giang, Hải Phòng, Quảng Ninh, ). Chúng ta không chỉ ngăn chặn sự lây lan của bệnh mà còn điều trị hiệu quả để giảm nguy cơ tử vong kéo dài và cải thiện chất lƣợng cuộc sống cho ngƣời HIV/AIDS. Trong điều trị thì kháng Retrovirut đóng vai trò rất lớn. Trƣớc đây nƣớc ta chƣa đầy đủ các loại thuốc Retrovirut nên thƣờng dùng đơn hóa hoặc phối hợp hai loại thuốc trong điều trị HIV/AIDS. Giờ có thể kết hợp 3 hoặc 4 loại thuốc trong những trƣờng hợp lâm sàng nặng hơn. Hiện nay, nƣớc ta đã sản xuất đƣợc thuốc chống HIV là Lamididrir (Lamivudine 150mg + Zidovudine 300mg). Tuy nhiên phần lớn vẫn đang sử dụng thuốc kháng HIV theo chƣơng trình quốc gia đƣợc cấp [12] Để đảm bảo trong điều trị, an toàn trong sử dụng, việc quản lý chất lƣợng thuốc kháng HIV là rất cần thiết. Vì vậy cần có phƣơng pháp phân tích có độ tin cậy cao, nhanh nhằm đáp ứng yêu cầu kiểm soát tốt chất lƣợng thuốc HIV. Cho tới nay sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phƣơng pháp phân tích hóa lý đa số đƣợc sử dụng để định lƣợng các loại thuốc. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là độ lặp lại, độ chính xác và khả năng tách tốt. Đồng thời thiết bị HPLC hiện đã 2 đƣợc tích hợp với hầu hết các kỹ thuật hóa lý hiện có (phổ UV-VIS, phân tích điện hóa, MS, NMR,…) cho phép nâng cao độ nhạy và hạ thấp giới hạn phát hiện của phƣơng pháp. Tuy vậy, phƣơng pháp HPLC đòi hỏi sử dụng dung môi có độ tinh khiết cao, đắt tiền, có nhiều loại gây ảnh hƣởng xấu, gây ô nhiễm môi trƣờng. Đó là xuất phát điểm của việc lựa chọn và phát triển phƣơng pháp định lƣợng thuốc dựa trên kỹ thuật hóa lý khác thay thế cho HPLC mà chúng tôi thực hiện trong nghiên cứu này. Kỹ thuật tách mà chúng tôi lựa chọn làm cơ sở cho nghiên cứu này là điện di mao quản (CE) [15]. CE là phƣơng pháp mới đƣợc phát triển, tuy nhiên có nhiều ƣu điểm vƣợt trội là hiệu lực tách rất cao, kinh tế và đặc biệt là thời gian phân tích nhanh có thể đáp ứng không những cho phân tích trong phòng thí nghiệm mà còn phục vụ cho phân tích lâm sàng và trong sản xuất. Vì thế đây là kỹ thuật rất hữu hiệu để thay thế hay hỗ trợ HPLC trong nhiều lĩnh vực phân tích, trong đó có nghiên cứu về Dƣợc. Hơn nữa, chuyên luận chung về CE đã đƣợc quy định trong Dƣợc điển một số nƣớc nhƣ Hoa Kỳ, Anh, Trung Quốc…Tuy nhiên ở Việt Nam, CE chƣa đƣợc ứng dụng nhiều và kinh nghiệm ứng dụng trong phân tích dƣợc phẩm còn hạn chế. Do vậy chúng tôi nhận định hƣớng nghiên cứu của mình sẽ rất có ý nghĩa thực tiễn cho công tác nghiên cứu quản lý chất lƣợng thuốc ở nƣớc ta. Từ những phân tích trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng của phƣơng pháp điện di mao quản vào định lƣợng thuốc kháng HIV với đề tài: “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phƣơng pháp điện di mao quản”. [...]... hệ điện di mao quản 1.4.3 Các quá trình xảy ra trong mao quản Trong quá trình điện di, dƣới tác dụng của lực điện trƣờng E, do điện thế V đặt vào hai đầu mao quản tạo ra, trong mao quản có các quá trình là: 1 Sự xuất hiện lớp điện kép sát thành mao quản 2 Trong mao quản có dòng điện i (5 – 200 A) 3 Xuất hiện dòng điện di thẩm thấu EOF 4 Sự tƣơng tác của các chất mẫu và pha động (MP) với thành mao quản. .. tính chất điện di (sự di chuyển Mobility) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản (đƣờng kính 25 - 100 m ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp, dƣới tác dụng của một từ trƣờng điện E nhất định đƣợc cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (V: 15 - 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản Nghĩa là CEC là kỹ thuật tách đƣợc thực hiện trong mao quản. .. Electro-Kenetic:MEK hay MCEK) 3 Điện di mao quản Gel-Filter (sàng lọc hay rây phân tử), (Capillary Gel Electrophoresis: Gel-CE), 4 Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing : CIEF) 5 Điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis: CITP) 1.4.5 Điện di mao quản vùng (CZE) Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophiresis- CZE) là phƣơng pháp phân tích cơ bản nhất của... trình sắc ký của các chất mẫu, khi chạy qua cột mao quản trong quá trình điện di Hình 1.3 Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MEKC : dòng EOF O: Chất hoạt động bề mặt ': Chất tan (chất PT). : Dòng điện di của chất Đối với các phần tử chất tan trung tính, nó chỉ là sự phân bố của chất tan vào trong Mixen và ở ngoài Mixen theo một cân bằng động học có hằng số phân bố Ki nhất định trong điều kiện đã... đƣợc mô tả trong hình 2.3 Các Mixen ở đây hoạt động nhƣ một pha tĩnh Các phân tử của chất mẫu (chất phân tích) đƣợc phân bố vào trong cả Mixen và cả ở ngoài Mixen (trong pha động) theo một cân bằng động học, có hằng số phân bố Ki xác định, trong những điều kiện nhất định đã đƣợc chọn để chạy điện di và mỗi chất tan Xi sẽ có một hằng số phân bố Ki nhất định trong điều kiện đó Nếu các Ki của các chất tan... thêm vào một hay nhiều chất phụ gia thích hợp là có thể chuyển sang các kỹ thuật điện di khác Tùy thuộc vào chất phụ thêm vào thì sẽ có nhiều kỹ thuật khác nhau 1.4.6 Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) [8,15] Phƣơng pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen ( MCEK, hay viết ngắn gọn là MEKC) là một kiểu của kỹ thuật tách theo bản chất của sự điện di có sử dụng kết hợp cả tính chất của... dụng rất nhiều trong kiểm nghiệm để định tính, định lƣợng các đồng phân quang học của một số dƣợc chất trong các kỹ thuật sắc ký và điện di Việc sử dụng các CD và các dẫn xuất CD vào CE liên tục đƣợc nghiên cứu 1.4.7 Phân tích định lƣợng trong phƣơng pháp điện di mao quản Theo lý thuyết sắc ký, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời gian lƣu của chất là đại lƣợng đặc trƣng để định tính (phát... điện E điều khiển sự tách của các chất Việc dùng cột mao quản có nhiều ƣu việt, nhƣ tốn ít mẫu và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, nhƣng số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu quả cao Cơ chế điện di: Sự điện di của các phần tử chất tan (các ion) trong ống mao quản là cơ chế di chuyển khác nhau của chất tan ( chất phân tích ), dƣới tác dụng của lực điện trƣờng E nhất định. .. chất hoạt động bề mặt trong một vùng nhất định Song khi tăng nồng độ chất hoạt động bề mặt nhiều, thì một vấn đề xuất hiện ở đây là khi dùng các chất hoạt động bề mặt loại ionic với nồng độ cao thƣờng gây ra sự tăng cƣờng độ dòng điện trong mao quản và hiệu ứng nhiệt Jun xuất hiện rõ rệt Công suất điện trong vùng từ 5 - 7 W/m mao quản trong môi trƣờng lực ion trung bình, thì cũng đã làm nhiệt độ mao quản. .. tính chất (đặc trƣng) của dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), trong sự phụ thuộc vào điện tích và kích thƣớc của chúng (Trong đó dòng EOF gọi là dòng điện di thẩm thấu, hay dòng điện thẩm) 1.4.2 Thiết bị của phƣơng pháp điện di mao quản Trang thiết bị của hệ: Theo nguyên tắc, để thực hiện điện di, hệ thống máy phải có các bộ phận chính nhƣ sau: 1 Buồng điện cực, bình điện di và các điện . của phƣơng pháp điện di mao quản vào định lƣợng thuốc kháng HIV với đề tài: Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phƣơng pháp điện di mao quản . . THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 604429 LUẬN. NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA