ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU HỆ XÚC TÁC SINH HỌC ĐỂ THỦY PHÂN POLYSACCHARIDE THÀNH OLIGO- VÀ SACCHARIDE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU HỆ XÚC TÁC SINH HỌC ĐỂ THỦY PHÂN POLYSACCHARIDE THÀNH OLIGO- VÀ SACCHARIDE Chuyên ngành: Hóa lí thuyết và hóa lí Mã số: 604431 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS Vũ Ngọc Ban – Trƣờng ĐH KHTN, ĐHQGHN GS. TSKH Trần Đình Toại – Viện Hóa học, Viện KH&CN VN Hà Nội – Năm 2011 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung 1 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Vi sinh vật phân hủy cellulose 1.1.1 Hệ Enzyme cellulase 1.1.2 Ức chế hệ enzyme cellulase 1.1.3 Cơ chế thủy phân cellulose bằng hệ enzyme cellulase 1.1.4 Các yếu tố quan trọng ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng của vi sinh vật 1.1.4.1 Ảnh hƣởng của pH tới quá trình phát triển của vi vinh vật 1.1.4.2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình sinh trƣởng của vi sinh vật 1. 2. Cấu trúc và tính chất của một số thành phần có trong rơm rạ 1.2.1 Cellulose 1.2.2 Hemicellulose 1.2.3 Lignin 1.3 Vài nét về nhiên liệu sinh học 1.3.1 Các thế hệ nhiên liệu sinh học 1.3.1.1 Nhiên liệu sinh học thế hệ I 1.3.1.2 Nhiên liệu sinh học thế hệ II 1.3.2 Tình hình sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học 1.3.2.1 Trên thế giới 1.3.2.2 Tại Việt Nam 1.4 Phƣơng pháp thủy phân cellulose và lên men etanol 1.4.1 Thủy phân cellulose 1.4.2 Lên men etanol 2 3 5 11 13 13 14 15 15 16 16 19 21 21 24 25 26 26 26 26 28 28 29 29 29 30 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung 2 1.4.3 “Lên men đồng thời” và “Lên men nối tiếp” 1.4.4 Tiền xử lý nguyên liệu CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu 2.1.1 Các chủng vi sinh vật để nghiên cứu 2.1.2 Các chế phẩm enzyme cellulase 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp xử lý nguyên liệu 2.2.1.1 Tách cellulose từ rơm rạ 2.2.1.2 Phƣơng pháp tiền xử lý 2.2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh 2.2.2.1 Môi trƣờng để nuối cấy các chủng vi sinh vật 2.2.2.2 Nuôi cấy các chủng vi sinh vật 2.2.2.3 Thu dịch enzyme từ các chủng vi sinh 2.2.3 Phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc 2.2.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase 2.2.4.1 Đơn vị enzyme 2.2.4.2 Phƣơng pháp đục lỗ thạch 2.2.4.3 Xác định hoạt lực enzyme cellulase đƣợc tách chiết từ vi sinh vật 2.2.5 Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào 2.2.5.1 Dùng máy so màu 2.2.5.2 Phƣơng pháp xác định ATP 2.2.6 Phƣơng pháp cố định enzyme cellulase từ tế bào vi sinh 2.2.7 Thủy phân cellulose bằng enzyme 2.2.7.1 Thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase tự do chƣa cố định 2.2.7.2 Thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase cố định trên PVA 2.2.8 Lên men đồng thời (SSF) 32 33 34 34 34 34 35 35 35 36 36 36 37 38 38 39 39 39 40 40 40 40 41 41 41 41 42 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung 3 2.2.9 Phƣơng pháp xác định đƣờng glucose bằng axit dinitro salicylic (DNS) 2.2.10 Phƣơng pháp xác định etanol bằng chuẩn độ với K 2 Cr 2 O 7 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu nguồn nguyên liệu để sản xuất etanol 3.2 Nghiên cứu tiền xử lý nguyên liệu 3.2.1 Hiệu quả thủy phân cellulose 3.2.1.1 Tách cellulose từ rơm, rạ 3.2.1.2 Định tính enzyme cellulase 3.2.1.3 So sánh hiệu quả của việc dùng cellulose và rơm cắt khúc để thủy phân 3.2.2 Hiệu quả của quá trình thủy phân rơm đƣợc xử lý cơ học và tiền xử lý 3.2.2.1 Xử lý cơ học và tiền xử lý nguyên liệu 3.2.2.2 So sánh hiệu quả của quá trình thủy phân rơm đƣợc xử lý cơ học và tiền xử lý 3.2.3 So sánh hiệu quả thủy phân cellulose và rơm tiền xử lý 3.3 Nghiên cứu lựa chọn chủng vi sinh để thuỷ phân polisaccharide 3.3.1 Khảo sát 5 chủng vi sinh 3.3.1.1 Khảo sát ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ ảnh hƣởng tới các chủng vi sinh trong quá trình thủy phân nguyên liệu 3.3.1.2 Khảo sát khả năng thủy phâ của 5 chủng vi sinh 3.3.2 So sánh hiệu quả thủy phân của chủng A. Terreus với enzyme Cellic HTech2 3.4 Nghiên cứu hiệu quả quá trình cố định enzyme cellulase 3.4.1 Cố định enzyme cellulase 3.4.2 Hiệu quả quá trình cố định enzyme cellulase 3.5 Khảo sát khả năng chuyển hóa các sản phẩm trung gian thành nhiên liệu 42 44 45 45 46 46 46 47 47 49 49 49 51 51 51 52 54 58 59 59 60 61 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung 4 sinh học của các chủng nấm men 3.5.1 Khảo sát các chủng nấm men của Việt Nam 3.5.2 Khảo sát các chủng nấm men của Nga 3.6 Nghiên cứu “Lên men đồng thời” chuyển hóa rơm rạ thành etanol 3.6.1 Kết quả lựa chọn các chủng nấm men cho phƣơng pháp lên men đồng thời 3.6.2 “Lên men đồng thời” chuyển hóa rơm rạ thành etanol thế hệ II 3.6.2.1 Cố định nấm Saccharomyces cerevisiae T2 trên PVA 3.6.2.2 Tiến hành lên men KẾT LUẬN 61 66 69 69 70 70 70 71 73 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung 5 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ATP BSA CMC DNS PVA TCA SSF OD Y ATP Y(p/s) Y(x/s) g/l C V MT Adenosine triphosphate Bovine serum albumine (Albumin huyết thanh bò) Carboxyl methyl cellulose Axit dinitrosalicylic Polyvinyl alcohol Triclo axetic axit Simultaneous saccharification and fermentation (Đồng thời đƣờng hóa và lên men) Optical density (mật độ quang) Hiệu suất tế bào theo ATP Hiệu suất tế bào theo sản phẩm Hiệu suất tế bào theo cơ chất gam/lít Nồng độ Thể tích Môi trƣờng Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung 6 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Vi sinh vật phân huỷ cellulose (nuôi cấy đƣợc) 13 Bảng 1.2 Giá trị pH đối với sự phát triển của một số vi sinh vật 17 Bảng 1.3 Nhiệt độ (°C ) phát triển của một số vi sinh vật 19 Bảng 1.4 Giá trị trung bình các thành phần hóa học của rơm rạ (%) 21 Bảng 1.5 Cellulose tinh khiết trong nguyên liệu 22 Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật để thủy phân cellulose 34 Bảng 2.2 Các chủng nấm men cho lên men etanol 34 Bảng 2.3 Mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn glucose 43 Bảng 3.1 Thành phần hóa học của rơm, rạ một số giống lúa gieo trồng tại các tỉnh phía Bắc, Bắc Trung Bộ 45 Bảng 3.2 Thành phần hóa học của rơm. Rạ một số giống lúa gieo trồng tại các tỉnh phía Bắc Trung bộ 46 Bảng 3.3 Kích thƣớc vòng phân giải cellulose trên đĩa thạch 47 Bảng 3.4 Sự biến đổi nồng độ glucose (mg/ml) trong quá trình thủy phân của cellulose và rơm cắt khúc 48 Bảng 3.5 Sự biến đổi hàm lƣợng G c ,G o , G h 50 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng của pH tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu 52 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu 53 Bảng 3.8 Sự biến đổi nồng độ cellulose và glucose theo thời gian của 5 chủng vi sinh 54 Bảng 3.9 Tổng hợp sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bởi các chủng vi sinh 57 Bảng 3.10 Sự biến đổi nồng độ glucose trong quá trình thủy phân cellulose bằng tế bào chƣa cố định và cố định enzyme Cellic HTech2 60 Bảng 3.11 Các chủng nấm men đƣợc lựa chọn để nghiên cứu 62 Bảng 3.12 Các thông số động học của quá trình lên men etanol bởi các chủng của Việt Nam 62 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung 7 Bảng 3.13 Một số thông số động học trong quá trình lên men 65 Bảng 3.14 Các chủng nấm men của Nga đƣợc lựa chọn để nghiên cứu 66 Bảng 3.15 Các thông số động học của quá trình lên men etanol bởi các chủng của Nga 66 Bảng 3.16 Một số thông số động học trong quá trình lên men (bởi chủng của Nga) 69 Bảng 3.17 Kết quả chuyển hóa dịch thủy phân rơm thành etanol khi sử dụng các tế bào nấm men cố định ở 37ºС và 45ºС 70 Bảng 3.18 Nồng độ etanol trong quá trình lên men etanol bằng nấm Saccharomyces cerevisiae T2, Candida sp 71 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung 8 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Giả thiết cơ chế thủy phân cellulose 16 Hình 1.2 Ảnh hƣởng của pH đối với chủng vi sinh có pH tối ƣu cho sự phát triển là 6,2 18 Hình 1.3 Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới tốc độ sinh trƣởng tƣơng đối (%) của chủng vi sinh có nhiệt độ phát triển tối ƣu là 45-47 0 C 20 Hình 1.4 Cấu trúc không đồng nhất của phân tử cellulose 23 Hình 1.5 Cấu trúc phân tử hemicellulose 25 Hình 1.6 Giả thiết cấu trúc của lignin 26 Hình 1.7 Xu hƣớng sản xuất nhiên liệu sinh học trên thế giới 28 Hình 1.8 Sự biến đổi các thành phần trong quá trình lên men etanol 32 Hình 2.1 Phƣơng pháp đếm số lƣợng khuẩn lạc 38 Hình 2.2 Lên men đồng thời trong điều kiện yếm khí 42 Hình 2.3 Đồ thị đƣờng chuẩn glucose theo phƣơng pháp DNS 43 Hình 2.4 Sự thay đổi màu trong quá trình chuẩn độ xác định etanol 44 Hình 3.1 Cellulose tách từ rơm rạ 46 Hình 3.2 Hiệu quả của thủy phân cellulose 48 Hình 3.3 Mẫu rơm đƣợc xử lý cơ học 49 Hình 3.4 Mẫu rơm đƣợc tiền xử lý ở 80 о С, рН = 12, trong 3 giờ 49 Hình 3.5 Sự biến đổi hàm lƣợng G c ,G o , G h 50 Hình 3.6 So sánh hiệu quả thủy phân cellulose và rơm tiền xử lý 51 Hình 3.7 Ảnh hƣởng của pH tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu 53 Hình 3.8 Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu 54 Hình 3.9 Sự biến đổi nồng độ cellulose và glucose theo thời gian của 5 chủng vi sinh 57 Hình 3.10 Sự biến đổi nồng độ glucose trong quá trình thủy phân cellulose bằng các chủng vi sinh 58 [...]... nông thôn Để góp phần thực hiện “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025” theo quyết định số 177/2007/Qđ-TTg do Thủ tƣớng chính phủ ký ngày 20 tháng 11 năm 2007, chúng tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu hệ xúc tác sinh học để thủy phân polisacchride thành oligo- và saccharide Đây là một trong những cơ sở để nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học (etanol thế hệ II) từ... tôi nghiên cứu các nội dung sau: 1 Lựa chọn các loại phế thải nguồn gốc nông nghiệp của Việt Nam (rơm, rạ) để làm nguồn nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học 2 Nghiên cứu quá trình tách cellulose từ rơm, rạ 3 Lựa chọn nguồn vi sinh vật để lên men etanol 4 Nghiên cứu hệ xúc tác sinh học dị thể dựa trên cơ sở các enzyme cellulase vi sinh cố định 5 Nghiên cứu quá trình thuỷ phân cellulose để tạo thành. .. là thủy phân polysaccharide có trong rơm rạ đến sản phẩm glucose, đồng thời lên men tạo etanol dùng làm nhiên liệu sinh học Do vậy, trƣớc khi trình bày về phƣơng pháp thủy phân cellulose và lên men etanol, chúng tôi xin giới thiệu một vài nét về nhiên liệu sinh học 1.3 Vài nét về nhiên liệu sinh học 1.3.1 Các thế hệ nhiên liệu sinh học và nguyên liệu chủ yếu để sản xuất Etanol dùng làm nhiên liệu sinh. .. phẩm trung gian 6 Nghiên cứu quá trình chuyển hoá (lên men) các sản phẩm trung gian (hydrolizat) thành nhiên liệu sinh học bằng con đƣờng sinh học dùng các vi sinh vật, enzyme tự do và cố định 11 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN Trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi nghiên cứu hệ xúc tác sinh học là các vi sinh vật và polisaccharide là cellulose có trong rơm, rạ Để có cái nhìn khái... hoạt tính của các enzyme hệ cellulase, đặc biệt ức chế làm giảm mạnh hoạt tính của các enzyme exoglucanase và -glucosidase (những enzyme thủy phân cellulobiose thành glucose) 1.1.3 Cơ chế thủy phân cellulose bằng hệ enzyme cellulase Việc nghiên cứu cơ chế thủy phân cellulose đƣợc tác giả Klyosov [8,9] chú ý từ sớm Sau này nhiều tác giả khác cũng chú ý tới vấn đề này Cơ chế thủy phân cellulose đƣợc giả... đƣợc sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ I là các polysaccharide đƣợc tạo bởi liên kết (1→4) -glucosid: Amylose, amylopectin; nguyên liệu đƣợc sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ II các polysaccharide đƣợc tạo bởi liên kết  (1 4) - glucosid: Cellulose, hemicellulose Với thành phần chính của rơm rạ đã nêu ở mục 1.2 và một vài số liệu về phế phẩm nông nghiệp tại Ấn Độ và Việt Nam... sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung Ca(II) và Mg(II), có khả năng tạo phức với lignin cũng có thể đƣợc sử dụng để lôi kéo lignin CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu 2.1.1 Các chủng vi sinh vật để nghiên cứu Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật để thủy phân cellulose Chủng vi sinh TT Xuất sứ 1 Chủng vi khuẩn C32 Phân lập ở Hà Nội 2 Chủng Xạ khuẩn 7P Phân lập ở Hà Nội 3 Chủng nấm Aspergillus... liệu sinh học đƣợc chia làm 2 thế hệ: 1.3.1.1 Nhiên liệu sinh học thế hệ I [33] Etanol dùng làm nhiên liệu sinh học thế hệ I đƣợc sản xuất từ lƣơng thực nhƣ ngô, sắn, mía đƣờng Sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ I đang đƣợc thực hiện tại 26 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung các vùng khí hậu nóng ẩm nhƣ ở Brazil và một số nƣớc khác dùng nguyên liệu mía đƣờng Ở Mỹ, nguyên liệu chủ yếu để sản xuất... về vi sinh vật phân hủy cellulose; cấu trúc, tính chất của một số thành phần có trong rơm rạ 1.1 Vi sinh vật phân hủy cellulose [11] Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân huỷ bởi vi sinh vật cả trong điều kiện hiếu khí và kị khí Các loài vi sinh vật có thể có tác động hiệp lực hoặc thay phiên nhau phân huỷ cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose Số lƣợng các loài vi sinh vật tham gia phân. .. chủng vi sinh vật lên men hoạt động có hiệu lực cao tại nhiệt độ tối ƣu cho giai đoạn thủy phân Các chủng vi sinh vật đáp ứng đƣợc yêu cầu ấy thƣờng là các nấm men chịu nhiệt 1.4.4 Tiền xử lý nguyên liệu [29] Quá trình sản xuất ethanol từ sinh khối gồm 2 giai đoạn Trong đó, giai đoạn thủy phân nguyên liệu để thu dịch thủy phân chứa các oligosaccharide và các đƣờng tan là chìa khóa quyết định cho sự thành . hành đề tài Nghiên cứu hệ xúc tác sinh học để thủy phân polisacchride thành oligo- và saccharide . Đây là một trong những cơ sở để nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học (etanol thế hệ II) từ. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU HỆ XÚC TÁC SINH HỌC ĐỂ THỦY PHÂN POLYSACCHARIDE THÀNH OLIGO- VÀ SACCHARIDE. nguồn vi sinh vật để lên men etanol. 4. Nghiên cứu hệ xúc tác sinh học dị thể dựa trên cơ sở các enzyme cellulase vi sinh cố định 5. Nghiên cứu quá trình thuỷ phân cellulose để tạo thành các