ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM ĐẠI HỌC KHTN VIỆN HÓA HỌC BÙI MINH NHUỆ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY KHỔ SÂM MỀM (BRUCEA MOLLIS WALL. EX KURZ) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM ĐẠI HỌC KHTN VIỆN HÓA HỌC BÙI MINH NHUỆ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY KHỔ SÂM MỀM (BRUCEA MOLLIS WALL. EX KURZ) Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số : 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGUYỄN MẠNH CƢỜNG HÀ NỘI - 2012 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN ÁN 6 DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN ÁN 7 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 7 MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Giới thiệu về chi Brucea (Sầu đâu) 3 1.1.1. Sơ lƣợc về chi Brucea 3 1.1.2. Thành phần hóa học của chi Brucea 3 1.1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc 3 1.1.2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 3 1.1.2.2.1. Lớp chất quassinoit 4 1.1.2.2.2. Lớp chất ancaloit 4 1.1.2.2.3. Lớp chất tritecpenoit và steroit 4 1.1.2.2.4. Lớp chất flavonoit 5 1.1.2.2.5. Lớp chất axít béo và loại khác 5 1.1.3. Hoạt tính sinh học 12 1.1.3.1. Hoạt tính kháng u và ung thƣ 12 1.1.3.2. Hoạt tính chống sốt rét 13 1.1.3.3. Hoạt tính kháng virus TMV (Tobacco Mosaic Virus) 13 1.1.3.4. Hoạt tính chống đái đƣờng 13 1.1.3.5. Hoạt tính kháng ký sinh trùng mũi khoan 14 1.1.3.6. Hoạt tính kháng amíp 14 1.1.3.7. Các hoạt tính khác 14 1.1.4. Loài Brucea mollis (Khổ sâm mềm) 14 1.1.5. Lớp chất quassinoit 16 1.1.5.1. Giới thiệu 16 1.1.5.2. Phân lập và xác định cấu trúc 17 Trang 1.1.5.3. Sinh tổng hợp các quassinoit 17 1.1.5.4. Bán tổng hợp các quassinoit 18 1.1.5.5. Tổng hợp toàn phần các quassinoit 19 1.1.5.6. Hoạt tính sinh học 21 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu 22 2.1.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết 22 2.1.3. Các phƣơng phƣơng xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 22 2.1.3.1. Xác định điểm chảy và góc quay cực 22 2.1.3.2. Phổ khối lƣợng (ESI-MS) và phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) 23 2.1.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 23 2.1.4. Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ in vitro 23 2.1.4.1. Vật liệu 23 2.1.4.2. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào in vitro 23 2.1.4.3. Phép thử sinh học xác định hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxic assay) 23 2.2. Xử lí mẫu thực vật và chiết tách 24 2.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập đƣợc 28 2.3.1. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.01 (12N) 28 2.3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.02 (MC218) 28 2.3.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.03 (3R, 12K) 28 2.3.4. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.04 (MC220) 28 2.3.5. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.05 (MC221) 28 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1. Xác định tên khoa học cây Brucea mollis 30 3.2. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào các cặn chiết từ lá cây Brucea mollis 31 3.3. Cấu trúc của các hợp chất đƣợc phân lập 31 3.3.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ lá cây Khổ sâm mềm 31 3.3.1.1. Hợp chất BM.02: tetratriacontan-1-ol (MC218) 32 3.3.1.2. Hợp chất BM.03: stigmast-5,22-dien-3-  -ol (3R, 12K) 33 3.3.1.3. Hợp chất BM.04: bombiprenone (MC220) 33 3.3.1.4. Hợp chất BM.05: α-tocopherol (MC221) 37 3.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất đƣợc phân lập 42 KẾT LUẬN 44 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TRONG KHUÔN KHỔ LUẬN ÁN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Trang Hình 1.1. Cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) 15 Hình 1.2. Các bộ khung cơ bản của lớp chất quassinoit 16 Hình 1.3. Quassin 117 và neoquassin 118. 17 Hình 1.4. Con đƣờng sinh tổng hợp các quassinoit 18 Hình 1.5. Bán tổng hợp bruceantin từ bruceoside A 19 Hình 1.6. Tổng hợp toàn phần bruceantin 20 Hình 2.1. Sơ đồ phân đoạn các cặn chiết từ lá cây Khổ sâm mềm 24 Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các chất từ lá cây Khổ sâm mềm 26 Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.01. 32 Hình 3.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.02. 33 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.03 33 Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.04 35 Hình 3.5. Phổ 1 H-NMR của hợp chất BM.04 36 Hình 3.6. Phổ DEPT của hợp chất BM.04 36 Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.05 37 Hình 3.8. Phổ 1 H-NMR của hợp chất BM.05 38 Hình 3.9. Phổ DEPT của hợp chất BM.05 38 DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN ÁN Trang Bảng 1.1. Thành phần hóa học các cây thuộc chi Brucea 9 Bảng 3.1. Kết quả thử độc tính tế bào các cặn chiết từ lá cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall.ex Kurz) 31 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.04 33 Bảng 3.3. Số liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất BM.05 và chất tham khảo 36 Bảng 3.4. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ lá cây Khổ sâm mềm 40 Bảng 3.5. tổng kết các hợp chất phân lập từ lá cây Khổ sâm mềm 42 Bảng 3.6. kết quả thử hoạt tính các chất tách ra trên bốn dòng ung thƣ 43 Bảng 3.7. Kết quả sàng lọc hoạt tính độc tế bào trên hai dòng tế bào LU và KB 44 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton 13 C- NMR Carbon -13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13 DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Phổ DEPT HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ HMBC HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ HSQC NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Phổ NOESY 1 H- 1 H-COSY 1 H- 1 H- Correlation Spectroscopy Phổ tƣơng tác proton ESI-MS Electron Spray Ionization-Mass Spectroscopy Phổ khối ion hóa bằng phun mù điện tử HR-ESI-MS High Resolution Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy Phổ khối phân giải cao ion hóa bằng phun mù điện tử IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại s singlet d doublet t triplet q quartet dd doublet doublet dt doublet triplet b broad m multiplet J (Hz) Hằng số tƣơng tác tính bằng Hz HzHz δ (ppm) (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học tính bằng ppm (phần triệu) CC Column Chromatography Sắc ký cột thƣờng TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng HS (%) Hiệu suất so với mẫu khô KB Human epidermoid carcinoma Ung thƣ biểu mô Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Ung thƣ gan ngƣời MCF-7 Adeno carcinoma Ung thƣ vú LU Human lung carcinoma Ung thƣ phổi LNCaP Human prostate adenocarcinoma Ung thƣ tiền liệt tuyến HL-60 Human promyelocytic leukemia Ung thƣ máu cấp tính IC 50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế tối thiểu 50% Mp Melting point Điểm chảy MeOH Metanol DMSO Dimethylsulfoxide Py Pyridin EtOAc Etyl axetat TMS Tetremetyl Silan BuOH Butanol 1 MỞ ĐẦU Ngày nay dân số thế giới đã đạt đến con số bảy tỷ ngƣời, một con số khổng lồ. Nhu cầu về khám chữa bệnh vì thế cũng tăng theo. Trong khi đó tình trạng sử dụng thuốc bừa bãi không theo hƣớng dẫn của bác sĩ dẫn đến kháng thuốc, đặc biệt là ở những nƣớc đang phát triển, đã vô tình tạo một áp lực lớn đối với ngành y tế thế giới. Thiên nhiên là một kho thuốc khổng lồ mà đến nay thế giới vẫn chƣa khám phá hết. Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, có một hệ động thực vật đa dạng phong phú với 10.368 loài thực vật, trong đó có tới 3.830 loài có khả năng dùng làm thuốc (Viện dược liệu, 2001). Đây chính là tiềm năng to lớn mà chúng ta cần phải tận dụng. Tuy nhiên tình trạng đốt phá rừng ngày càng gia tăng và không thể kiểm soát, đồng thời khí hậu thay đổi theo chiều hƣớng khắc nghiệt hơn đã và đang làm cho một số lƣợng lớn các loài suy thoái dần. Nếu chúng ta không nhanh chóng nghiên cứu và bảo vệ nguồn gien này thì đó sẽ là một mất mát to lớn của loài ngƣời. Hiện nay, hầu hết các bài thuốc gia truyền đều sử dụng theo kinh nghiệm, phần lớn chƣa đƣợc chứng minh theo y học hiện đại. Thông thƣờng ngƣời ta sử dụng ở dạng sắc lấy nƣớc uống hoặc ở dạng cao, viên. Đó là một hỗn hợp bao gồm nhiều thành phần khác nhau, có những thành phần có khả năng làm tăng hoặc giảm hoạt tính hoặc độc tính của thuốc. Vì vậy, xu hƣớng chữa bệnh hiện nay là kết hợp Đông – Tây y với phƣơng châm vừa áp dụng kinh nghiệm chữa bệnh của cha ông ta bằng thuốc Nam, vừa nghiên cứu tính năng tác dụng của cây thuốc bằng cơ sở khoa học hiện đại, từ đó tạo cơ sở cho sử dụng tốt hơn cây thuốc và bài thuốc dân tộc. Trong y học dân gian cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) đƣợc sử dụng để trị sốt rét, đau bụng, u nhọt, amíp, ghẻ lở [1]. Ngoài ra, trong chƣơng trình hợp tác giữa Việt Nam và Hàn Quốc, 2002, nhằm tìm kiếm các loài thực vật có hoạt tính kháng lại dòng ung thƣ phổi ngƣời A549, các tác giả đã phát hiện ra cây B. [...].. .mollis có hoạt tính rất mạnh, dịch chiết MeOH từ lá cây Khổ sâm mềm ức chế tới 96% tế bào ung thƣ phổi ngƣời A549 [14] Nhằm mục đích đi sâu nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lý của cây này, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: " Nghiên cứu thành phần hóa học cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall ex Kurz) với nội dung nghiên cứu nhƣ sau: 1 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây 2 Xác... 21 CHƢƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu Cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall ex Kurz) đƣợc thu hái vào tháng 3/2009, ở Mai Châu, tỉnh Hoà Bình Tên khoa học của cây do TS Trần Thế Bách (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật) xác định Mẫu tiêu bản của cây đƣợc lƣu trữ tại phòng tiêu bản thực... mollis và Brucea mollis var tonkinensis [5] Cây Brucea mollis còn có tên là Sầu đâu rừng hay Khổ sâm mềm, thƣờng mọc ở vùng Lào Cai, Kom Tum, Lâm Đồng [1] 14 Hình thái thực vật của cây Brucea mollis khá giống với cây Meliosma pinnata thuộc họ Sabiaceae Để tránh nhầm lẫn khi thu hái hai loài này, chúng tôi đƣa ra một số mô tả về đặc điểm thực vật của cây Brucea mollis (Khổ sâm mềm) nhƣ sau: Brucea mollis. .. antidysenterica B mollis var tonkinenis B mollis var tonkinenis B javanica B mollis var tonkinenis B mollis var tonkinenis B mollis var tonkinenis B mollis var tonkinenis B mollis var tonkinenis B mollis var tonkinenis B mollis var tonkinenis B mollis var tonkinenis B mollis var tonkinenis B antidysenterica B javanica B antidysenterica B javanica B javanica B mollis var tonkinenis B mollis var tonkinenis B mollis. .. và đầu tƣ nghiên cứu thành phần hóa học, bởi vì hoạt tính đa dạng và phong phú của chúng Các nghiên cứu hóa học về chi Brucea đã phát hiện ra nhiều hợp chất thuộc các lớp chất chính là quassinoit, ancaloit, tritecpenoit và flavonoit 1.1.2 Thành phần hóa học của chi Brucea 1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Ở trong nƣớc, cho đến nay chỉ có ba công bố các nghiên cứu về hai loài trong chi Brucea là... chuột (Brucea javanica) và Khổ sâm mềm (Brucea mollis) trị sốt rét, đau bụng, u nhọt , thƣờng mọc ở vùng Lào Cai, Kom Tum, Lâm Đồng [1] Ở Trung Quốc, hai loài Brucea mollis và Brucea javanica cũng đƣợc sử dụng nhƣ là thuốc thảo dƣợc truyền thống bởi vì hoạt tính chống ung thƣ và chống sốt rét của chúng [6] Gần đây, các cây thuộc chi Brucea đã thu hút nhiều sự quan tâm và đầu tƣ nghiên cứu thành phần hóa. .. hai quassinoit và một flavonolignan 1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 3 Cho đến nay, đã có năm loài trong sáu loài chính của chi Brucea đƣợc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới gồm: B javanica, B mollis var tonkinensis, B sumatrana, B antidysenterica và B amarissima Kể từ năm 1900, đã có hơn 100 hợp chất hóa học đƣợc tách ra từ chi Brucea, bao gồm các lớp chất:... lƣới nông [5], [63] Hình 1.1 Cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall ex Kurz) Sinh học và sinh thái: Mùa quả tháng 6-12 Mọc rải rác trong rừng, ở độ cao 1200-1700 m 15 Phân bố: Lào Cai (Sa Pa), Hòa Bình (Mai Châu, Pà Cò), Kon Tum (Đác Glây, Ngọc Linh), Lâm Đồng (Đà Lạt, Lang Bian) Còn có ở Trung Quốc, Mianma, Lào, Campuchia, Ấn độ, Malaysia, Thái Lan, Philippin, Nepal Mẫu nghiên cứu: Hòa Bình (Mai Châu, Pà... Văn Thu, 1979, nghiên cứu về hoạt tính chống sốt rét của các dịch chiết từ cây B sumatrana [7] Năm 1995, GS Trần Văn Sung và cộng sự đã phân lập đƣợc một glycoside mới từ lá cây B javanica [8] Và mới đây, 2009, GS Douglas Kinghorn, Ohio Mỹ, nghiên cứu phân tách theo định hƣớng thử hoạt tính sinh học các thành phần có hoạt tính gây độc tế bào từ cây B javanica thu hái tại Việt Nam [9] Từ cây này đã tách... 8-hydroxyhexadecanoic Axít azelaic Axít vanillic [6] [6] [6] [58] B mollis var tonkinenis B.javanica B javanica Tritecpenoit and steroit Bruceajavanin A Bruceajavanin B Dihydrobruceajavanin A Daucosterol Flavonoit Luteolin-7-O--D-glucoside [47] [48] [52] [52] [52] [49] [52] [58] [58] [58] [58] [58] [58] [7] [41] [41] [58] 1.1.3 Hoạt tính sinh học Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học . của cây này, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: " Nghiên cứu thành phần hóa học cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) với nội dung nghiên cứu nhƣ sau: 1. Nghiên cứu thành phần hóa học. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM ĐẠI HỌC KHTN VIỆN HÓA HỌC BÙI MINH NHUỆ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY KHỔ SÂM MỀM (BRUCEA MOLLIS WALL. EX KURZ) . THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY KHỔ SÂM MỀM (BRUCEA MOLLIS WALL. EX KURZ) Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số : 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGUYỄN