i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HỒ VĂN HOÀN NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN BIỂN SINH KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ CÁC VÙNG VEN BIỂN VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI – 2013 ii ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HỒ VĂN HOÀN NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN BIỂN SINH KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ CÁC VÙNG VEN BIỂN VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Phƣơng Nhuệ HÀ NỘI – 2013 v CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CKS Chất kháng sinh CW Cell wall DAP Diaminopienat DNA Deoxyribose nucleic axit ĐHSP Đại học sƣ phạm KHKT Khoa học kĩ thuật KTCC Khuẩn ti cơ chất KTKS Khuẩn ti khí sinh NXB Nhà xuất bản PG Peptidoglycan RNA Ribonucleoic axit TNTĐCNG Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gene VKK Vòng kháng khuẩn vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển Bảng 2.1. Các thiết bị chính sử dụng trong đề tài Bảng 3.1. Hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn Bảng 3.2. Mầu sắc của các chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng ISP khác nhau Bảng 3.3. Khả năng sử dụng nguồn nitơ của các chủng xạ khuẩn Bảng 3.4. Khả năng sử dụng nguồn cacbon của các chủng xạ khuẩn Bảng 3.5. Khả năng sinh trƣởng của xạ khuẩn ở nồng độ NaCl khác nhau Bảng 3.6. Khả năng sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau Bảng 3.7. Khả năng sinh trƣởng của xạ khuẩn ở điều kiện pH khác nhau Bảng 3.8. So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn NA113 với chủng xạ khuẩn S. scabies ISP 5058 Bảng 3.9. So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn NA115 với chủng chuẩn S. tendae ISP 5101 Bảng 3.10. Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA113 với gene tƣơng ứng của các chủng vi khuẩn đƣợc đăng ký trên GenBank Bảng 3.11. Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA115 với gene tƣơng ứng của các chủng vi khuẩn đƣợc đăng ký trên GenBank Bảng 3.12. Khả năng sinh chất kháng sinh trên các môi trƣờng lên men khác nhau của các chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon và nitơ đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng NA113 và NA115 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của pH ban đầu và độ thoáng khí đến hoạt tính kháng sinh Bảng 3.15. Phổ hoạt tính kháng sinh của hai chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 vii DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc của Abyssomicin C và Trioxacacin Hình 1.2. Cấu trúc của Diazepinomicin Hình 1.3. Cấu trúc của deoxynyboquinone (1) và pseudonocardian A-C (2-4) Hình 3.1. Tỉ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc của chủng NA113 trên môi trƣờng ISP2, ISP3 Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc của chủng NA115 trên môi trƣờng ISP2, ISP3 Hình 3.5. Cuống sinh bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng NA113 Hình 3.6. Cuống sinh bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng NA115 Hình 3.7. Khả năng sinh trƣởng của chủng NA113 trên môi trƣờng có pH khác nhau Hình 3.8. Khả năng sinh trƣởng của chủng NA115 trên môi trƣờng có pH khác nhau Hình 3.9. Kết quả điện di DNA tổng số của hai chủng xạ khuẩn trên gel agarose 1% Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% Hình 3.11. Cây phân loại của chủng NA113 và một số chủng xạ khuẩn Hình 3.12. Cây phân loại của chủng NA115 và một số chủng xạ khuẩn viii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN iv CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH VẼ vii MỤC LỤC viii MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan về xạ khuẩn 3 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 3 1.1.3. Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn 6 1.2. Phân loại xạ khuẩn 7 1.2.1. Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 7 1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) 8 1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 8 1.2.4. Phân loại số (Numerical Taxonomy) 9 1.2.5. Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gene 16S- rDNA 9 1.3. Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển 10 1.3.1. Nhóm chất kháng sinh polyketide 10 1.3.2. Nhóm kháng sinh Non-ribosomal peptide 11 1.3.3. Nhóm kháng sinh phức hợp Polyketide-Nonribosomal peptide 12 1.3.4. Nhóm kháng sinh isoprenoid 12 1.3.5. Các chất kháng sinh khác 13 1.4. Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 15 1.4.1. Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 15 1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn 16 1.5. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh 17 1.5.1. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh ở trong nước 17 1.5.2. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh trên thế giới 18 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Vật liệu và hóa chất dùng trong nghiên cứu 21 2.1.1. Vật liệu 21 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 21 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 22 ix 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu 22 2.2.2. Phương pháp xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu 22 2.2.3. Tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh kháng sinh 23 2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn 24 2.2.5. Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn biển sinh kháng sinh 29 3.2. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn 32 3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy 32 3.2.2. Đặc điểm hình thái 34 3.3. Đặc điểm sinh lí - sinh hóa 35 3.3.1. Khả năng sử dụng nguồn nitơ 35 3.3.2. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon 36 3.3.3. Khả năng chịu muối NaCl 38 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng 38 3.3.5. Ảnh hưởng của độ pH 39 3.4. Kết quả phân loại chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 40 3.4.1. Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lí-sinh hóa 40 3.4.2. Phân loại các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử 43 3.5.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men 48 3.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nguồn nitơ 49 3.5.3. Ảnh hưởng của pH môi trường và độ thoáng khí 51 3.6. Phổ hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 KẾT LUẬN 53 ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 1: VỊ TRÍ LẤY MẪU VÙNG VEN BIỂN 58 PHỤ LỤC 2: CÁC LOẠI MÔI TRƢỜNG DÙNG TRONG ĐỀ TÀI 59 PHỤ LỤC 3: VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH 61 PHỤ LỤC 4: TRÌNH TỰ GENE MÃ HÓA 16S-rRNA 62 1 MỞ ĐẦU Vùng biển Việt Nam có diện tích khoảng 1.000.000 km 2 và 3.260 km bờ biển (không tính các đảo), với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, tạo cho nƣớc ta tính đa dạng về cảnh quan tự nhiên và nguồn lợi thuỷ sinh vật. Với mong muốn khám phá, khai thác và sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên phong phú của biển, nhiều nghiên cứu khoa học gần đây, nhất là công nghệ sản xuất sinh học đã chuyển dần từ khai thác sang tìm hiểu, ứng dụng và đƣa vào sản xuất nguồn nguyên liệu từ những vùng nƣớc ngập mặn, biển xa bờ, thậm chí cả đáy biển sâu để sinh trƣởng bền vững dựa trên cơ sở của các công nghệ mới. Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Xạ khuẩn đƣợc quan tâm và nghiên cứu nhiều do có khả năng sản xuất các sản phẩm trao đổi chất quan trọng. Trong số hơn 8000 chất kháng sinh hiện đã đƣợc biết trên thế giới thì có trên 80% có nguồn gốc từ xạ khuẩn chủ yếu là từ các chi Streptomyces và Micromonospora. Giai đoạn những năm 1980 trở về trƣớc các nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung vào khám phá các chủng xạ khuẩn trên mặt đất. Từ vài thập kỷ trở lại đây các nhà khoa học đã phát hiện ra các chủng xạ khuẩn biển có nhiều đặc tính quý nhƣ: khả năng sản xuất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế các tế bào ung thƣ… có ý nghĩa ứng dụng trong y học [1]. Cùng với sự sinh trƣởng của công nghệ sinh học hiện đại, các nghiên cứu về ứng dụng xạ khuẩn biển đã thu đƣợc rất nhiều thành tựu to lớn trong sản xuất sinh khối, dƣợc phẩm… đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp, y dƣợc học, nông nghiệp… Trong lĩnh vực y dƣợc, sản xuất chất kháng sinh có ý nghĩa lớn trong đời sống, góp phần đẩy lùi bệnh tật và nâng cao sức khỏe cộng đồng. Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh đã dẫn đến hiện tƣợng nhờn thuốc làm ảnh hƣởng đến kết quả điều trị bệnh. Việc tìm ra các chất kháng sinh mới có hoạt tính kháng khuẩn cao từ các nguồn khác nhau, đặc biệt từ biển, trở thành nhu cầu cấp thiết hiện nay. Bên cạnh đó, nghiên cứu phân loại các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh cũng rất 2 quan trọng, các nghiên cứu cơ bản này giúp định hƣớng sản xuất các sản phẩm hữu ích từ các chủng xạ khuẩn biển, góp phần đánh giá sự đa dạng của các vi sinh vật biển. Xuất phát từ những định hƣớng trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam”. Mục tiêu: Tuyển chọn và phân loại các chủng xạ khuẩn biển có khả năng tổng hợp kháng sinh cao định hƣớng ứng dụng trong y dƣợc. Nội dung nghiên cứu: - Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh từ nƣớc, bùn ở các vùng biển Bắc, Trung, Nam. - Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn lựa chọn. - Phân loại chủng xạ khuẩn tuyển chọn theo phƣơng pháp giải trình tự gene 16S-rRNA - Nghiên cứu một số điều kiện thu nhận chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong phòng thí nghiệm. 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về xạ khuẩn 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nƣớc, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các vi sinh vật khác không sinh trƣởng đƣợc. Số lƣợng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật. Đất giàu dinh dƣỡng và lớp đất bề mặt thƣờng có số lƣợng lớn xạ khuẩn. Trong 1 gam đất canh tác có thể phân lập đƣợc 5 triệu mầm xạ khuẩn, đất hoang hóa chỉ có 10 – 100 nghìn mầm. Số lƣợng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm [7]. Xạ khuẩn cũng thƣờng sống hoại sinh trên xác các sinh vật (cây chết, rơm rạ) nhƣng cũng có thể kí sinh trên thân, củ hoặc rễ cây. Xạ khuẩn biển thƣờng đƣợc phân lập từ cát biển, đất ngập mặn, trầm tích biển ở các độ sâu khác nhau hoặc ở trên các sinh vật khác nhƣ san hô, rong biển. Trƣớc đó, ngƣời ta tin rằng xạ khuẩn biển có nguồn gốc từ trên cạn. Tuy nhiên, sau đó có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nhiều nhóm xạ khuẩn có nguồn gốc từ biển. Xạ khuẩn biển thƣờng có khả năng chịu mặn cao, đặc biệt có những chủng Streptomyces ssp. có thể sinh trƣởng đƣợc ở nồng độ NaCl 16% và nhiều loài thuộc chi Streptomyces và Nocardia sinh trƣởng tốt khi ở nồng độ NaCl 10%, Micromonospora sp. và Salinospora sp. cũng có khả năng chịu mặn cao [24, 25]. 1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn Ở trên môi trƣờng đặc, xạ khuẩn sinh trƣởng thành những khuẩn lạc khô, kích thƣớc khuẩn lạc thay đổi tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh. Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn, ƣớt nhƣ ở vi khuẩn, nấm men mà thƣờng có dạng thô ráp, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ. Do đó mới có tên gọi là xạ khuẩn (Actinomycetes, [...]... ung thƣ Kháng tế bào ung thƣ Kháng tế bào ung thƣ, kháng khuẩn Kháng tế bào ung thƣ Kháng tế bào ung thƣ Kháng tế bào ung thƣ Kháng khuẩn Kháng khuẩn, kháng ung thƣ Kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thƣ Kháng tế bào ung thƣ Kháng tế bào ung thƣ Kháng khuẩn, kháng viêm, kháng ung thƣ Kháng khuẩn Kháng khuẩn 1.4 Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 1.4.1 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn. .. sát vòng kháng khuẩn [3] Chọn và giữ các chủng có vòng kháng khuẩn để nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại 2.2.4 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn Nghiên cứu định tên các chủng xạ khuẩn đã chọn theo đặc điểm phân loại của Waskman, 1961; Krasilnikov, 1970; Gause, 1983; Sổ tay phân loại vi sinh vật của Bergey, 1989 và tham khảo các bản mô tả xạ khuẩn của chƣơng trình xạ khuẩn quốc... 1.5.2 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh trên thế giới Trong những năm gần đây, vi sinh vật biển là đề tài quan trọng trong nhiều nghiên cứu mới về vi sinh vật ở nhiều nƣớc trên thế giới; đặc biệt là các đề tài tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật biển nhƣ các chất kháng khuẩn, kháng virus, kháng tế bào ung thƣ, kháng nấm, chống đông máu hoặc là kháng trùng sốt... ngừng quá trình sinh tổng hợp CKS Sự thừa photphat cũng ức chế tổng hợp các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp làm giảm khả năng tổng hợp CKS [7] 1.5 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh 1.5.1 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh ở trong nước Ở Việt Nam, việc nghiên cứu vi sinh vật biển có khả năng sinh các chất có hoạt tính đối kháng còn hạn... là loại khuẩn ti sinh trƣởng từ các loại bào tử nảy mầm [4] Nhiều loại chỉ có khuẩn ti cơ chất mà không có khuẩn ti khí sinh, nhƣng cũng có loại nhƣ chi Sporichthya lại chỉ có khuẩn ti khí sinh Khi đó khuẩn ti khí sinh vừa làm nhiệm vụ dinh dƣỡng vừa làm nhiệm vụ sinh sản Khuẩn ti của xạ khuẩn thƣờng mảnh hơn của nấm mốc, đƣờng kính thay đổi trong khoảng 0,2 – 1 m đến 2 – 3 m Đa số xạ khuẩn có khuẩn. .. có quy mô lớn nghiên cứu các vi sinh vật và tách chiết các chất kháng sinh từ vi sinh vật biển Tác giả Lê Gia Hy và cs, Viện Công nghệ sinh học đã phân lập và nghiên cứu đƣợc đặc điểm của chủng vi khuẩn biển HT0523 có nhiều đặc điểm quý có thể khai thác trong nuôi trồng thủy sản Chủng vi khuẩn biển HT0523 chính là vi khuẩn Gram dƣơng, sinh bào tử có khả năng ức chế mạnh cả 2 chủng vi sinh vật Vibrio... năng sinh trƣởng và sinh trƣởng bình thƣờng khi không có các hợp chất này Do đó, vai trò đối với tế bào của các sản phẩm này cần đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng hơn [11] 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn Quá trình sinh tổng hợp CKS ở xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố nhƣ pH, nhiệt độ, thành phần môi trƣờng lên men… Để xạ khuẩn sinh trƣởng tốt và hình thành các. .. thành bào tử [7] 1.2 Phân loại xạ khuẩn 1.2.1 Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy Trong phân loại ngƣời ta thƣờng chia xạ khuẩn thành 4 nhóm chính dựa trên các dấu hiệu hình thái: - Các nhóm xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt Đặc trƣng của nhóm này là sinh sản bằng bào tử và phân hóa thành KTKS và KTCC - Nhóm xạ khuẩn có bào tử nang Đặc trƣng của nhóm này là khuẩn ti phân chia theo hƣớng... đặc điểm cuống sinh bào tử và sự phân đốt của khuẩn ti Tuy nhiên, ngày nay chỉ tiêu này chỉ là bổ sung cho việc nghiên cứu phân loại bằng sinh lí, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử [7, 36] 7 1.2.2 Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) Đặc điểm hóa phân loại đƣợc sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong một vài thập kỉ trƣớc và ngày nay vẫn còn là cơ sở quan trọng trong phân loại xạ khuẩn Đây là... một công cụ mới để phân loại sinh vật đó là phân loại học phân tử Phƣơng pháp này có ƣu điểm là thời gian ngắn và có độ chính xác cao Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gene, hoặc các sản phẩm của gene Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thƣờng sử dụng 3 phƣơng pháp chính đó là lai DNA, lai RNA và phân tích trình tự gene mã hóa 16S-rRNA 9 Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA là phƣơng . phát từ những định hƣớng trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam . Mục tiêu: Tuyển chọn và phân loại. ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn 16 1.5. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh 17 1.5.1. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh ở trong. HỌC TỰ NHIÊN HỒ VĂN HOÀN NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN BIỂN SINH KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ CÁC VÙNG VEN BIỂN VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC