A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Ô đầu, Phụ tử vị thuốc quý, dùng phổ biến Y Dược học cổ truyền Hiện giới, có nghiên cứu chi Aconitum L nhằm phát triển sản phẩm theo hướng đại, nâng cao hiệu sử dụng lồi thuộc chi phịng điều trị bệnh Ở Việt Nam, Ô đầu trồng nhiều huyện Quản Bạ, Đồng Văn, tỉnh Hà Giang người dân địa phương sử dụng theo kinh nghiệm làm thuốc chữa bệnh đau nhức xương khớp nấu cháo ăn để tăng cường sức khoẻ Hàng năm nước ta có nhiều vụ ngộ độc sử dụng nhầm lẫn, đầu độc dược liệu, chế phẩm có nguồn gốc từ Ơ đầu Do cần có tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu phương pháp xác định nhanh nguyên nhân gây ngộ độc Ô đầu Theo định phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 định hướng đến năm 2030 Thủ Tướng Chính phủ, Ô đầu quy hoạch trồng tỉnh Hà Giang Để phát triển vùng trồng Ô đầu cách bền vững, cần có nghiên cứu theo hướng ứng dụng Y Dược học đại, góp phần phát triển sản phẩm từ Ô đầu, nhằm tạo đầu cho Ơ đầu Hà Giang Để đóng góp mặt khoa học, thực tiễn góp phần giải vấn đề nêu trên, luận án với tên đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học số tác dụng sinh học Ô đầu (Aconitum carmichaeli Debx.) trồng tỉnh Hà Giang” thực Mục tiêu nội dung luận án 2.1 Mục tiêu luận án + Xác định tên khoa học Ô đầu trồng tỉnh Hà Giang + Nghiên cứu thành phần hóa học: định tính, định lượng nhóm chất, chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hoá học chất phân lập + Đánh giá độc tính cấp thử số tác dụng sinh học số phân đoạn dịch chiết từ Ô đầu để gợi mở hướng sử dụng dược liệu 2.2 Nội dung luận án + Xác định tên khoa học Ô đầu trồng tỉnh Hà Giang phương pháp phân tích đặc điểm hình thái phương pháp giải trình tự gen ADN + Định tính, định lượng, chiết xuất, phân lập nhóm chất alcaloid, flavonoid, polysacharid từ Ơ đầu + Thử độc tính cấp phân đoạn dịch chiết chứa alcaloid, flavonoid, polysaccharid + Thử tác dụng giảm đau phân đoạn chứa alcaloid có độc tính thấp, tác dụng tăng cường miễn dịch phân đoạn dịch chiết chứa polysaccharid, tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan phân đoạn dịch chiết chứa flavonoid Những đóng góp luận án * Về thực vật: - Đã áp dụng phương pháp giải trình tự gen ADN để xác định tên khoa học Ô đầu trồng tỉnh Hà Giang là: Aconitum carmichaeli Debx * Về hóa học: - Đã áp dụng phương pháp ICP-MS xác định hàm lượng 12 kim loại nặng (Pb, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Hg, Ag, As) Ô đầu, Phụ tử - Đã chiết xuất phân lập alcaloid, flavonoid, sitosterol chất nhóm acid béo, este Trong có chất là: 5,7,3'trimethoxyquercetin 3-O-β-D-fructofuranosid (Z)-3- hydroxypentan-2-yl-10-aminooctacos-9-enoat Các chất lần phân lập từ chi Aconitum là: acid 9-chlorooctadecanoic, acid 3chloroicosanoic, acid 8-chlorohexadecanoic, 3-hydroxypropane-1,2diyl dihenicosanoat, 7,4′-O-dimethylluteolin 5-O-[α-L- arabinofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid], quercetin 3-O--Lrhamnopyranosid, quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid * Về độc tính cấp tác dụng sinh học: - Đã xác định LD50 phân đoạn dịch chiết chứa alcaloid là: 991.36 ± 176.78 (mg/kg) 27.257 ± 7.071 (mg/kg) - Đã xác định liều tối đa chuột uống 12g phân đoạn dịch chiết chứa flavonoid/kg 15 g phân đoạn chứa polysaccharid/kg tể trọng chuột mà khơng có chuột chết - Phân đoạn alcaloid (PĐ E) chiết xuất từ Phụ tử với liều 12.5 mg/kg/ngày, 25 mg/kg/ngày 50 mg/kg/ngày uống ngày liên tục, thấy có tác dụng giảm đau thơng qua kéo dài thời gian phản ứng với nhiệt độ, làm tăng khoảng cách gây phản xạ đau làm giảm số quặn đau tất thời điểm nghiên cứu so với lô chứng - Phân đoạn polysaccharid (PĐ I) chiết xuất từ Phụ tử với liều 100 mg/kg 300 mg/kg thể trọng chuột, thấy có tác dụng kích thích miễn dịch thơng qua mẫu thử làm tăng phục hồi số lượng bạch cầu, tăng nồng độ cytokine IL-2, nồng độ globulin miễn dịch hạn chế phần tổn thương giải phẫu vi thể tổ chức lympho - Phân đoạn flavonoid (PĐ C) chiết từ với liều 30mg/kg thể trọng chuột thấy có tác dụng chống viêm gan cấp chống oxy hóa thơng qua làm giảm hoạt độ enzym (39.23 %) làm giảm hàm lượng MDA gan (15.96 %) so với lô chứng Ý nghĩa luận án Luận án có ý nghĩa mặt khoa học thực tế sau: + Xác định tên khoa học giúp khẳng định rõ nguồn gốc dược liệu, góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu + Giám định tên khoa học phương pháp giải trình tự gen ADN, phương pháp áp dụng Việt Nam có độ xác, độ tin cậy cao + Chiết xuất, phân lập chất, xác định hàm lượng nhóm chất góp phần nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu, xác định nhanh nguyên nhân gây ngộ độc có phải Ơ đầu, Phụ tử hay không + Phân lập chất tự nhiên số chất với chi Aconitum, với lồi, góp phần bổ sung vào liệu chi, tạo thuận lợi cho nghiên cứu ứng dụng sau + Kết nghiên cứu độc tính cấp cho thấy mức độ độc góp phần định hướng sử dụng phân đoạn + Kết nghiên cứu tác dụng sinh học khẳng định thêm tác dụng chưa nghiên cứu ứng dụng nhiều, minh chứng rõ cơng dụng Ơ đầu, Phụ tử dùng Y học cổ truyền, gợi mở hướng sử dụng Y Dược học đại Kết đề tài luận án góp phần thúc đẩy việc trồng phát triển Ô đầu tỉnh Hà Giang, từ nâng cao đời sống nhân dân địa phương Bố cục luận án Luận án gồm chương, 40 bảng, 47 hình, 153 tài liệu tham khảo, 23 phụ lục Luận án có 124 trang gồm phần chính: Đặt vấn đề (2 trang), tổng quan (27 trang), nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu (13 trang), kết nghiên cứu (57 trang), bàn luận (23 trang), kết luận kiến nghị (2 trang) B NỘI DUNG LUẬN ÁN Chƣơng TỔNG QUAN Đã tập hợp trình bày có hệ thống kết nghiên cứu từ trước tới thực vật học, thành phần hóa học tác dụng sinh học chi Aconitum giới Việt Nam Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu Thu hái mẫu Ô đầu trồng huyện Quản Bạ tỉnh Hà Giang Lấy củ mẹ, củ lụi Lấy Nguyên liệu sấy khô 60 0C, bảo quản túi polyetylen kín, khơ Chuột nhắt trắng chủng Swiss, chủng giống khoẻ mạnh, khoảng 06 tuần tuổi, trọng lượng khoảng 20± g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực vật: Phân tích đặc điểm hình thái thực vật, chiết phân tích ADN, giải trình tự gen, so sánh với mẫu trình tự gen lồi thuộc chi Aconitum Nghiên cứu hóa học: - Định tính nhóm chất hữu - Định lượng alcaloid toàn phần theo phương pháp acid-base - Định lượng aconitin phương pháp HPLC - Định lượng flavonoid toàn phần polysacharid toàn phần phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến - Xác định hàm lượng kim loại nặng mẫu Ô đầu, Phụ tử phương pháp đo phổ ICP-MS - SKLM thực mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60GF254 Sắc ký cột tiến hành với chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 0.040-0.063 mm, 0.063-0.200 mm, Merck) silica gel pha đảo YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.), Sephadex G100 - Xác định cấu trúc chất phân lập dựa thông số vật lý phương pháp phổ gồm: điểm chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều chiều Nghiên cứu tác dụng sinh học: - Đánh giá độc tính cấp phân đoạn dịch chiết chuột nhắt trắng theo đường uống phương pháp Litchfield – Wilcoxon phương pháp Bliss - Đánh giá tác dụng giảm đau phân đoạn chứa alcaloid chuột nhắt trắng phương pháp Koster, mâm nóng máy tail-flick - Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch phân đoạn chứa polysaccharid mo hình gây suy giảm miễn dịch cấp cyclophosphamid - Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan phân đoạn chứa flavonoid mơ hình gây tổn thương gan thực nghiệm CCl4 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết nghiên cứu thực vật - Căn vào kết phân tích đặc điểm hình thái, khóa phân loại thực vật chí Trung Quốc (2001) giải trình tự gen ADN, so sánh với ADN loài thuộc chi Aconitum để xác định tên khoa học Ô đầu Hà Giang là: Aconitum carmichaeli Debx 3.2 Kết nghiên cứu hóa học 3.2.1 Xác định thành phần hóa học - Định tính nhóm chất hữu cơ: xác định có nhóm chất alcaloid, flavonoid, polysaccharid, ngồi cịn có số nhóm chất khác: acid béo, este, sterol… - Định lượng nhóm chất alcaloid, flavonoid, polysaccharid: + Áp dụng phương pháp acid-base để xác định hàm lượng alcaloid toàn phần Ô đầu, Phụ tử phân đoạn D, E chiết từ Phụ tử cho kết sau: 0.93 %, 0.70 %, 28.61 %, 26.83 % tính theo aconitin + Áp dụng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng aconitin Phụ tử, Ô đầu phân đoạn D, E chiết từ Phụ tử cho kết sau: 0.072 %, 0.125 %, 0.066 %, 0.015 % + Xây dựng, thẩm định áp dụng phương pháp đo quang phổ UVVis để xác định hàm lượng: * Flavonoid toàn phần lá, phân đoạn dịch chiết C, E là: 1.60 %, 38.24 %, 30.42 % tính theo quercetin * Polysaccharid tồn phần Phụ tử, Ơ đầu, phân đoạn I, II chiết từ Phụ tử là: 19.63 %, 14.52 %, 87.6 %, 72.8 % tính theo D-glucose + Áp dụng phương pháp đo ICP-MS xác định hàm lượng 12 kim loại nặng Ô đầu, Phụ tử sống là: Pb, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Hg, Ag, As nằm giới hạn cho phép quy định thuốc, thực phẩm 3.2.2.Chiết xuất phân lập chất từ Ô đầu, Phụ tử - Phụ tử (2,8 kg) ngâm chiết ethanol 96 % Chiết xuất phân lập chất sắc ký cột thu chất: (OD1, OD2, OD3, OD4, OD5, OD6, OP7, OD8, OD9, OD10) - Ô đầu (3,2 kg) ngâm chiết ethanol 96 % Chiết xuất phân lập chất sắc ký cột thu chất: OD4, OD6, OD7 - Bột Phụ tử 500 g ngâm chiết nước cất 90 oC Dịch chiết tủa ethanol 96 % ly tâm thu tủa polysaccharid Tách phân đoạn I, II cột sắc ký sephadex G100 3.2.3 Chiết xuất phân lập hợp chất từ Ô đầu Lá Ô đầu (1,5 kg) chiết ethanol 96 % Chiết xuất phân lập chất sắc ký cột thu chất: F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7 3.2.4 Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập đƣợc từ Ô đầu trồng tỉnh Hà Giang Căn vào phản ứng hóa học đặc trưng để dự kiến nhóm chất, vào phổ IR, MS, 13 C-NMR, 1H-NMR, DEPT 135, DEPT 90, HSQC, HMBC so sánh với liệu phổ công bố chất tương ứng để xác định cấu trúc chất phân lập sau: Chất OD7: Hình 3.18 Cấu trúc chất OD7 OD7 màu với thuốc thử Dragendorff nên dự kiến chất OD7 thuộc nhóm alcaloid Phổ IR xuất đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho nhóm liên kết O-H, C-H, C-N, C-O-C Phổ khối ESI-MS chất cho pic ion phân tử m/z 590 [M+H]+ tương ứng với khối lượng phân tử M= 589 Phổ 13C-NMR, DEPT 135, DEPT 90 cho thấy chất OD7 xuất 31 tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho có mặt 31 nguyên tử carbon có nhóm methyl, nhóm methoxy, C vịng benzen thế, nhóm methylen, 11nhóm methin bão hịa, carbon bậc carbon C-OH Phổ 1H-NMR xuất tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho chất 43 nguyên tử hidro, với tín hiệu đặc trưng như: 4.25 (m, 1H, H-1), 2.97 (s, 3H, - NCH3), 3.32 (s, 1H, H-17), tín hiệu (3.35s, 3.39 s, 3.43 s, 3.75 s, 3H) đặc trưng cho nhóm methoxy, 7.49 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 8.12 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.63 (m, 1H) đặc trưng cho nhóm benzoyl Kết hợp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HSQC, HMBC) so sánh với liệu công bố chất benzoylmesaconitin, chất OD7 xác định là: benzoylmesaconitin Khi so sánh chất OD7 OP7 (trong Phụ tử) thấy: hai chất màu với thuốc thử Dragendorff, giá trị Rf triển khai SKLM hệ dung môi phổ MS, phổ 13CNMR chất giống nhau, xác định chất OP7 phân lập từ Phụ tử benzoylmesaconitin Chất OD5, OD8, OD9, OD10 sau so sánh với phổ OD7, đặc điểm phổ NMR, so sánh với liệu phổ chất tương ứng: hokbusin A, fuzilin, delcosin, karacolin, xác định sau: chất OD5 là: hokbusin A, chất OD8 fuzilin, chất OD9 delcosin, chất OD10 karacolin, cấu trúc chất sau: OCH3 13 16 12 14 H HO 17 10 OH H 11 H3CH2C 15 N 19 18 OH OH OCH3 OCH3 Cấu trúc OD5: Hokbusin A 17 10 N H3CH2C H 18 10 15 OH H N 15 OH OCH3 19 OCH3 Cấu trúc OD9: Delcosin OH 14 11 H3CH2C OH 19 H 17 12 HO 11 16 OH 14 H OCH3 13 16 12 HO Cấu trúc OD8: Fuzilin OCH3 13 18 Cấu trúc OD10: Karacolin Chất OD4:Phổ IR xuất đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho nhóm O-H, C-H, C=O, C-O-C Phổ ESI-MS chất cho pic ion phân tử m/z: 709 [M+H]+ tương ứng với khối lượng phân tử M= 10 708 Phổ C-NMR DEPT 90, DEPT 135 cho thấy tín hiệu đặc 13 trưng chất có 45 nguyên tử carbon với nhóm CH3, 41 nhóm CH2, nhóm C=O Phổ 1H-NMR cho thấy có mặt 88 proton phù hợp với công thức phân tử C45H88O5, đồng thời phổ 1H-NMR cho pic điển hình như: 1.52-1.99 (m, 2H) đặc trưng cho nhóm CH2CO, 3.53 (m, 2H) đặc trưng cho nhóm CH2OH, 4.10 (dd, J=4.0 Hz, 7.0 Hz) đặc trưng cho nhóm CHOOC Các liệu trên, kết hợp so sánh với liệu phổ công bố, khẳng định chất OD4 là: 3hydroxypropan-1,2-diyl dihenicosanoat Hình 3.23.Cấu trúc OD4: 3-hydroxypropan-1,2-diyl dihenicosanoat Chất OD3: Dữ liệu phổ IR xuất đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho nhóm O-H, C-H, C=O, C-Cl Phổ ESI-MS chất cho pic ion phân tử m/z: 291 [M+H]+ tương ứng với khối lượng phân tử M= 290 Phổ 1H-NMR cho thấy có mặt 31 proton phù hợp với công thức phân tử C16H31ClO2 đồng thời có xuất tín hiệu đặc trưng cho nhóm CHCl, CH2COOH Căn vào phổ 13 C- NMR, DETP 90 DEPT 135 cho thấy chất OD3 có 16 nguyên tử carbon có 13 nhóm CH2, nhóm CH3, nhóm CH nhóm C=O Các liệu trên, kết hợp so sánh với liệu phổ công bố, khẳng định chất OD3 là: acid 8-clorohexadecanoic Hình 3.24 Cấu trúc OD3: acid 8-clorohexadecanoic Chất OD1, OD2: so sánh phổ IR, NMR chất với chất OD3, với dự liệu phổ công bố, khẳng định chất OD2 acid 3cloroicosanoic, chất OD1 là: acid 9-clorooctadecanoic Cấu trúc chất sau: 11 Hình 3.25 Cấu trúc OD2: acid 3-cloroicosanoic Hình 3.26 Cấu trúc OD1: acid 9-clorooctadecanoic Chất OD6: phản ứng với thuốc thử H2SO4 10%/EtOH cho màu hồng tươi chuyển xanh tím dần chứng tỏ OD6 thuộc nhóm sterol Phổ IR xuất đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho nhóm O-H, C-H, >C=C