Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 0 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HƢƠNG QUỲNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY PYRENE VÀ KHẢ NĂNG XỬ LÝ NƢỚC THẢI Ở QUY MÔ PHÕNG THÍ NGHIỆM 5 LÍT Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGHIÊM NGỌC MINH THÁI NGUYÊN - 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả Nguyên Hương Quỳnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới: PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh, trưởng phòng Công nghệ Sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của các cán bộ phòng Công nghệ Sinh học Môi trường, đặc biệt là KS. Cung Thị Ngọc Mai, CN. Vũ Thị Thanh đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn của mình. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Sinh trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên, lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện và giúp đõ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu tại trường và tại Viện. Bên cạnh đó tôi xin cảm ơn người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo điều kiện động viên và giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2011 Học viên Nguyễn Hương Quỳnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các hình vii MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Đặc điểm chung của PAH 3 1.1.1. Cấu trúc hóa học và một số đặc tính cơ bản của PAH 3 1.1.2. Tính độc và ảnh hưởng của PAH tới con người và môi trường 5 1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH 7 1.3. Tình trạng ô nhiễm PAH và các biện pháp xử lý 9 1.3.1. Tình trạng ô nhiễm PAH 9 1.3.2. Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH 11 1.4. Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật 14 1.4.1. Vi sinh vật phân hủy PAH 14 1.4.2. Cơ chế phân hủy PAH bởi vi sinh vật 16 1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình phân hủy PAH 22 1.5. Các phương pháp phân loại vi sinh vật 26 1.5.1. Phân loại theo phương pháp cổ điển 26 1.5.2. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử 26 1.6. Quá trình xử lý sinh học nước thải và thành phần các chất ô nhiễm điển hình trong nước thải công nghiệp 29 1.6.1. Quá trình xử lý sinh học nước thải 29 1.6.2. Thành phần các chất ô nhiễm điển hình trong nước thải công nghiệp 31 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 33 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và các thiết bị sử dụng 33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv 2.1.1. Nguyên liệu 33 2.1.2. Hóa chất, môi trường 33 2.1.3. Thiết bị 34 2.2. Phương pháp nghiên cứu 35 2.2.1. Thu thập mẫu nước thải 35 2.2.2. Làm giàu tập đoàn vi sinh vật trên môi trường chứa hỗn hợp PAH 35 2.2.3. Phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng PAH 35 2.2.4. Quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi điện tử quét 36 2.2.5. Phân loại, định tên và xây dựng cây phát sinh chủng loại 36 2.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển của các chủng vi khuẩn được lựa chọn 37 2.2.7. Xác định khả năng phân hủy pyrene của vi khuẩn 42 2.3. Thử nghiệm trên quy mô 5 lít 43 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường chứa PAH 44 3.2. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng BTL4 47 3.3. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng vi khuẩn BTL4 47 3.3.1. Tách chiết DNA tổng số và nhân đoạn gen 16S rRNA của chủng BTL4 47 3.3.2. Tách dòng gen 16S rRNA của chủng BTL4 48 3.3.3 Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BTL4 50 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến sự phát triển của chủng BTL4 53 3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ 53 3.4.2. Ảnh hưởng của pH 54 3.5. Khả năng phân hủy pyrene của chủng BTL4 55 3.6. Kết quả mô hình xử lý nước thải ở quy mô 5 lít 58 3.6.1. Quá trình hoạt hóa bùn 58 3.6.2. Xử lý nước thải ở quy mô 5 lít 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair (cặp bazơ) DNA Deoxyribonucleic acid LB Luria-Bertani PAH Polycyclic aromatic hydrocacbon (hydrocarbon thơm đa nhân) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) ppm Đơn vị một phần triệu (mg/l) RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid USEPA United State Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ môi trường Hoa Kỳ) X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside μl Microlit μm Micromet Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số PAH 4 Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH 15 Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật 28 Bảng 3.1: Chủng vi khuẩn phát triển trên môi trường khoáng có bổ sung hỗn hợp PAH 46 Bảng 3.2: Chủng vi khuẩn phát triển trên môi trường khoáng có bổ sung hỗn hợp PAH và 0,5% glucose 46 Bảng 3.3: Mức độ tương đồng của BTL4 so với một số chủng vi khuẩn 52 Bảng 3.4: Kết quả đo và phân tích 1 số chỉ tiêu của nước thải KCN Từ Liêm trước và sau xử lý ở quy mô 5 lit phòng thí nghiệm 61 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) 3 Hình 1.2: Các con đường phân hủy hiếu khí PAH chính của vi khuẩn và nấm 16 Hình 1.3: Con đường phân hủy napthalene ở Pseudomonas 19 Hình 1.4: Con đường phân hủy pyrene ở Mycobacterium sp. AP1 20 Hình 1.5: Con đường phân hủy anthracene ở Mycobacterium sp. PYR-1 21 Hình 3.1: Mẫu làm giàu lần 3 của mẫu nước thải lấy từ khu công nghiệp Từ Liêm 44 Hình 3.2: Tập đoàn vi sinh vật trên môi trường khoáng thạch với 50 ppm PAH sau 3 lần làm giàu: (A) có bổ sung glucose, (B) không bổ sung glucose 45 Hình 3.3: (A) Hình thái khuẩn lạc và (B) hình thái tế bào chủng BTL 4 47 Hình 3.4: Điện di đồ DNA tổng số chủng BTL4 (A), và kiểm tra nhân đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR (B) 48 Hình 3.5: Kết quả biến nạp chủng BTL4(A), và điện di đồ DNA plasmid của dòng số 2 từ BTL4 trên gel agarose 1% plasmid của chủng lạc mầu xanh (B) 49 Hình 3.6: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 2 từ BTL4 50 Hình 3.7: Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng BTL4 51 Hình 3.8: Cây phát sinh chủng loại của chủng BTL4 52 Hình 3.9: Đồ thị thể hiện sự phát triển của chủng BTL4 ở 30 0 C và 37 0 C 54 Hình 3.10: Đồ thị mật độ quang phổ của chủng BTL4 ở các điều kiện pH khác nhau 54 Hình 3.11: Kết quả nuôi BTL4 ở các nồng độ pyrene khác nhau 56 Hình 3.12: Kết quả phân tích khả năng phân hủy pyrene của chủng BTL4 56 Hình 3.13: Quá trình hoạt hóa bùn sau 3 tuần 59 Hình 3.14: Màu sắc của nước thải trước xử lý (A, C) và sau xử lý (B, D) với thời gian lưu của nước thải là 3 ngày 60 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU Nước là nguồn tài nguyên quý giá của nhân loại, không một ai, không một sinh vật nào có thể sống được nếu thiếu nước. Tuy nhiên cùng với sự phát triển của mình, con người đang ngày càng làm cho nguồn nước bị ô nhiễm nghiêm trọng trong đó phải kể đến nước thải công nghiệp. Xã hội phát triển, các ngành công nghiệp khác nhau phát triển làm cho các khu công nghiệp không ngừng tăng về số lượng. Tính đến tháng 10 năm 2009, toàn quốc đã có 233 khu công nghiệp được thành lập theo Quyết định của Thủ tướng Chính phủ. Trong đó, 171 khu công nghiệp đã đi vào hoạt động, với tổng diện tích đất 57264 ha, đạt tỷ lệ lấp đầy trung bình khoảng 46% [2]. Không ai có thể phủ nhân sự độc hại của nước thải công nghiệp, và việc xử lý chúng là một trong nhưng vấn đề đã được quan tâm, chú ý từ lâu, tuy nhiên do mức độ ô nhiễm và thành phần nước thải của các khu công nghiệp phụ thuộc vào thành phần các nhà máy, làng nghề thuộc khu công nghiệp, làm cho quá trình xử lý nước thải công nghiệp gặp rất nhiều khó khăn. Một trong những chất gây ô nhiễm nghiêm trọng nhất của nước thải công nghiệp là các hydrocarbon thơm đa vòng (PAH - Polycyclic Aromatic Hydrocarbon). PAHs có nguồn gốc khá đa dạng từ dầu mỏ, than đá, sản phẩm phụ của việc đốt nhiên liệu… [1]. PAHs tồn tại trong không khí có khả năng phản ứng với ozone và tạo thành ozone-alken có khả năng gây ung thư tồn tại trong khí quyển, ngoài ra nếu PAHs xâm nhập vào cơ thể con người thông qua con đường thực phẩm, tiếp xúc trực tiếp qua da… có thể gây ung thư, giảm tuổi thọ, đột biến thai nhi… Hầu hết PAHs đều ít tan trong nước nhưng tan tốt trong chất béo và khả năng gây ô nhiễm môi trường của chúng phụ thuộc vào khả năng tan của chúng trong môi trường nước. Do tác hại của PAH với con người mà từ lâu con người đã quan tâm nghiên cứu các phương pháp phân hủy PAH. Các PAH được nghiên cứu thường là các PAH có cấu tạo đơn giản như antharacene, naphthalene, phenantherene, pyren … trong đó pyren là chất có cấu tạo phức tạp, có khả năng gây độc hơn những chất còn lại, vì vậy nếu vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 khuẩn có khả năng phân hủy pyren thì cũng có khả năng phân hủy các loại PAH đơn giản khác. Có nhiều phương pháp phân hủy pyren như các phương pháp vật lý, hóa học tuy nhiên những phương pháp này vừa đắt lại vừa không triệt để nên khó có thể thực hiện trên quy mô lớn. Tuy nhiên ngày nay các nhà khoa học đã thấy rằng không những có thể sử dụng vi sinh vật để loại bỏ pyren mà đó còn là phương pháp vừa rẻ, triệt để và có khả năng thực hiện trên quy mô công nghiệp, có thể tiến hành thuận lợi trong điều kiện tự nhiên, độ an toàn cao và thân thiện với môi trường. Do vậy, trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu và điều tra về phân bố, cấu trúc các tập đoàn vi sinh vật, khả năng phân hủy pyren của các chủng đơn cũng như các tập đoàn vi sinh vật. Trong phương pháp này, vi sinh vật đóng vai trò quyết định do có khả năng xử lý các chất có trong nước thải. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: "Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy pyrene và khả năng xử lý nước thải ở quy mô phòng thí nghiệm 5 lít". Mục tiêu của đề tài - Phân lập tuyển chọn định tên , và kiểm tra khả năng phân hủy pyrene của chủng vi khuẩn được phân lập từ nguồn nước thải của khu công nghiệp Từ Liêm - Nghiên cứu khả năng xử lý nước thải của tập đoàn vi sinh vật được phân lập từ nguồn nước thải của khu công nghiệp Từ Liêm ở quy mô 5 lít Nội dung của đề tài: - Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật trên môi trường chứa PAH. - Nghiên cứu khả năng phân hủy pyrene của chủng vi khuẩn đại diện từ những chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được. - Đánh giá ảnh hưởng pH, nhiệt độ lên sự sinh trưởng… - Thử nghiệm khả năng xử lý nước thải bởi các chủng vi khuẩn phân lập được ở quy mô 5 lít phòng thí nghiệm [...]... cứu và áp dụng khá rộng rãi Tại Vi t Nam, các nhà khoa học tại Vi n Công nghệ sinh học đã tiến hành nghiên cứu và phân lập thành công một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy sinh học PAH cũng như phân bố của các tập đoàn vi sinh vật tại các vùng sinh thái khác nhau [3, 6, 8] 1.4 Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật 1.4.1 Vi sinh vật phân hủy PAH Hiện nay, có nhiều nghiên cứu về khả năng. .. có nhiều nghiên cứu về khả năng của vi sinh vật sử dụng các PAH có trọng lượng phân tử thấp như naphthalene, phenanthrene và anthracene Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về tiềm năng phân hủy các PAH có trọng lượng phân tử cao như chrysene và benzo[a ]pyrene [16] Vi sinh vật phân hủy PAH phân bố rộng rãi trong tự nhiên Số lượng các vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH tại các vùng ô nhiễm nhiều hơn... hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 15 Đa số các vi sinh vật phân lập được đều có nguồn gốc từ các địa điểm ô nhiễm [39] Tuy nhiên, với mỗi loại vi sinh vật khác nhau thì khả năng phân hủy PAH ở các vùng ô nhiễm là khác nhau Cụ thể, vi khuẩn là nhóm vi sinh vật có vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy PAH trong nước, đất và trầm tích, nấm sợi có khả năng phân. .. 1 .5 Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật Vi sinh vật rất đa dạng trong tự nhiên Tuy nhiên, chỉ một phần nhỏ trong số chúng là có thể nuôi cấy được ở trong điều kiện phòng thí nghiệm Do đó, vi c phân loại chúng gặp nhiều khó khăn Hiện nay có nhiều phương pháp để phân loại vi sinh vật Các phương pháp cổ điển chỉ dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái cấu tạo bên ngoài để phân loại vi sinh. .. mới cho phân loại vi sinh vật đó là phân loại học phân tử” Phương pháp mới này có thể phát hiện, mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử giữa các loài và trong phạm vi loài trong thời gian ngắn và có độ chính xác cao Trước đây, vi c phân loại vi sinh vật đôi khi gặp khó khăn và thiếu chính xác Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, vi c phân loại ngày nay dựa chủ yếu vào nghiên... nhiễm Các loài vi sinh vật trong vùng ô nhiễm có xu hướng thích nghi, bằng cách thay đổi cấu trúc di truyền để hướng đến vi c phân hủy PAH Vi khuẩn có vai trò quan trọng trong tham gia phân hủy sinh học PAH trong nước và trầm tích, trong khi đó, nấm sợi và xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng phân hủy PAH và các chất ô nhiễm trong môi trường đất [22] Thống kê ở bảng 1.2 cho thấy, vi sinh vật phân hủy PAH thuộc... quá trình sinh tổng hợp của của tế bào vi sinh vật Các muối phosphate và muối nitor có vai trò quan trọng trong vi c tổng hợp protein của vi sinh vật Carbon và nitor luôn có mặt trong đất, tuy nhiên nếu nồng độ của chúng thấp thì không có khả năng kích thích tập đoàn vi sinh vật hoạt động Đó chính là lý do vì sao trong đất nhiễm chất độc luôn tồn tại tập đoàn vi sinh vật song số lượng và khả năng hoạt... của các PAH, sự có mặt đồng thời hay riêng rẽ của các PAH trong môi trường Ngoài ra nó còn phụ thuộc vào bản thân các vi sinh vật, phương thức mà các vi sinh vật chuyển cơ chất qua màng tế bào Thường những phân tử tan có thể được vận chuyển qua màng tế bào và có khả năng phân hủy sinh học tốt hơn [16, 27, 36, 52 , 64] Các yếu tố môi trường tại nơi mà vi sinh vật được phân lập ảnh hưởng rất lớn đến sự... PAH Sự phân hủy sinh học PAH phụ thuộc rất nhiều yếu tố Nhiệt độ Mỗi chủng vi sinh vật thích hợp ở những nhiệt độ phát triển riêng vì vậy để tối ưu hóa quá trình phân hủy sinh học chúng ta cần nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi sinh vật pH môi trường cũng là một yếu tố gây ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển của vi sinh vật pH thích hợp nhất cho sự phát triển của vi sinh vật. .. http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 nước [16] Đặc điểm về khả năng hòa tan và áp suất hơi của PAH là nhân tố chính ảnh hưởng đến khả năng phân tán của chúng trong khí quy n, thủy quy n và sinh quy n Số lượng vòng benzen trong cấu trúc hóa học của các PAH quy t định khả năng hòa tan của các PAH trong nước PAH giảm khả năng hòa tan trong nước hay tăng tính kỵ nước khi số lượng vòng benzen tăng [59 ] Khả năng hòa tan của . của pH 54 3 .5. Khả năng phân hủy pyrene của chủng BTL4 55 3.6. Kết quả mô hình xử lý nước thải ở quy mô 5 lít 58 3.6.1. Quá trình hoạt hóa bùn 58 3.6.2. Xử lý nước thải ở quy mô 5 lít 59 KẾT. do có khả năng xử lý các chất có trong nước thải. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: " ;Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy pyrene và khả năng xử lý nước. cứu khả năng xử lý nước thải của tập đoàn vi sinh vật được phân lập từ nguồn nước thải của khu công nghiệp Từ Liêm ở quy mô 5 lít Nội dung của đề tài: - Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh