Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THỊ MINH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN KERATIN TỪ LÔNG VŨ GIA CẦM VÀ THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN KERATINASE TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THỊ MINH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN KERATIN TỪ LÔNG VŨ GIA CẦM VÀ THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN KERATINASE TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI Chuyên ngành : Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Huy Hoàng THÁI NGUYÊN – 2011 Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân và sâu sắc tới TS. Nguyễn Huy Hoàng – Phó trưởng Phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN Việt Nam, là người thầy_người anh đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, em đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của các cán bộ Phòng Vi sinh vật đất, đặc biệt là Th.S. Nguyễn Quỳnh Mai, CN. Nguyễn Thu Hiền đã giúp đỡ em trong quá trình tiến hành thí nghiệm. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo tham gia giảng dạy tại Khoa Sinh-KTNN Đại Học Thái Nguyên- ĐH Sư Phạm Thái Nguyên- Khoa đào tạo sau đại học đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt 2 năm qua. Bên cạnh đó, em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới BGH cùng toàn thể cán bộ giáo viên trường THPT Điềm Thụy, Phòng ADT ứng dụng thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm CNG đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường và Viện Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ và những người thân trong gia đình lòng biết ơn sâu sắc, cảm ơn những người bạn đã chia sẻ khó khăn thử thách trong cuộc sống và công việc để em có được kết quả này. Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 09 năm 2011 Nguyễn Thị Minh Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17 i MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv Danh mục các bảng v Danh mục các hình vi MỞ ĐẦU 1 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1. Keratin 3 1.2. Keratinase .6 1.3. Đa dạng vi sinh vật có khả năng sinh keratinase cao 8 1.4. Tình hình nghiên cứu .12 1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước .12 1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13 1.5. Sản xuất và ứng dụng quá trình thuỷ phân keratin trong lông vũ 14 1.5.1. Tăng hàm lượng chất dinh dưỡng trong thức ăn gia súc 17 1.5.2. Tạo phân bón 17 1.5.3. Tạo enzyme trong các ngành công nghiệp 18 1.5.4. Cải tạo đất 18 1.5.6. Tạo hợp chất màu 19 1.5.7. Ứng dụng trong công nghiệp dược và sản xuất thực phẩm chức năng 19 PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 2.1. Nguyên liệu 20 2.1.1. Nguyên liệu 20 2.1.2. Hoá chất 20 2.1.3. Thiết bị 20 Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17 ii 2.1.4. Môi trường nuôi cấy 20 2.1.4.1. Môi trường Broth Peptone 20 2.1.4.2. Môi trường I 20 2.1.4.3. Môi trường II 21 2.1.4.4. Môi trường III 21 2.1.4.5. Môi trường để phân lập chủng Chryseobacterium .21 2.1.4.6. Môi trường nuôi lắc lông vũ 21 2.1.4.7. Môi trường MPA 21 2.2. Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1. Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao 22 2.2.1.1. Lấy mẫu và đo pH đất 22 2.2.1.2. Phân lập chủng vi khuẩn Chryseobacterium 22 2.2.1.3. Phân lập chủng vi khuẩn Vibrio 23 2.2.1.4. Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus 23 2.2.2. Xác định khả năng thuỷ phân lông vũ 23 2.2.2.1. Nuôi giống cấp 1 vào môi trường MPA 23 2.2.2.2. Xác định mật độ tế bào 25 2.2.3. Lựa chọn môi trường thích hợp cho các chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao 25 2.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn thủy phân lông vũ 26 2.2.5. Xác định đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn 26 2.2.6. Xác định gram âm và gram dương của vi khuẩn 26 2.2.6.1. Phương pháp Hucker cải tiến 26 2.2.6.2. Xác định bằng cách kiểm tra độ kết dính 27 2.2.7. Phương pháp phân loại vi khuẩn theo đặc tính sinh hoá 28 2.2.8. Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu hiện pET32a 30 2.2.8.1. Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn 30 2.2.8.2. Nhân bản đoạn DNA bằng PCR 32 Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17 iii 2.2.9. Phân tích hoạt tính keratinase ngoại bào 38 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1. Kết quả lấy mẫu ở các địa điểm 41 3.2. Giá trị pH của các mẫu đất 41 3.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả thủy phân keratin 42 3.4. Lựa chọn môi trường thích hợp của các chủng được chọn lọc 44 3.5. Tối ưu nhiệt độ của các chủng vi khuẩn chọn lọc 47 3.6. Đặc điểm hình thái nhóm vi khuẩn thuỷ phân lông vũ 48 3.7. Kết quả xác định gram của các chủng vi khuẩn 49 3.8. Phân loại các chủng phân lập theo phương pháp sinh hoá 50 3.8.1. Phân loại theo kit API 50CHB của chủng vi khuẩn Đ.GT.2.2 50 3.8.2. Phân loại theo kit API 20NE của chủng vi khuẩn L.SC.1.2 51 3.9. Phân loại theo kiểu gene 52 3.9.1. Tách DNA tổng số 52 3.9.2. Nhân đoạn gene mã hóa 16S rARN bằng kỹ thuật PCR 53 3.10. Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu hiện pET32a 55 3.10.1. Nhân đoạn gene keratinase bằng kỹ thuật PCR 55 3.10.2. Gắn sản phẩm PCR đã thôi gel tinh sạch vào vector tách dòng pET32a 56 3.10.3. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến DH10B 58 3.10.4. Tách DNA plasmid tái tổ hợp 59 3.11. Đánh giá hoạt tính ezyme dịch thô của chủng chọn lọc 60 3.11.1. Định lượng Protein bằng phương pháp Bradford 60 3.11.2. Thử hoạt tính enzyme bằng azokeratin 62 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 4.1 Kết luận 64 4.2 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17 iv BẢNG CHỮ VIẾT TẮT PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) EtBr Dung dịch Ethidium Bromide BSA Bovine serum albumin DNA Deoxyribonucleic axid rARN Ribosomal ribonucleic acid LB Luria-Bertani Ker Keratinase bp Base pair(cặp ba zơ) E.coli Escherichia coli. µl Microlit EtOH Ethanol Primer-F Mồi xuôi Primer-R Mồi ngược Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17 v DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 1.1 Sự đa dạng của vi sinh vật có khả năng sinh keratinase và các đặc tính hóa sinh của keratinase 9 1.2 Ứng dụng của enzyme 16 2.1 49 phép thử lên men API 50 CHB 28 2.2 50 phép thử sinh hóa API 20 CHB 31 3.1 Địa điểm lấy mẫu 41 3.2 Giá trị pH của các mẫu đất 41 3.3 Tỷ lệ thủy phân lông vũ của các chủng tuyển chọn 43 3.4 Mật độ tế bào và khả năng thủy phân 1 gam lông vũ ở các nhiệt độ khác nhau(Sau 4 ngày nuôi cấy lắc) 47 3.5 Kết quả xác định gram âm, gram dương 50 3.6 Kết quả phép thử sinh hóa theo kit API 50 CHB của chủng Đ.G.T.2.2 50 3.7 Kết quả phép thử sinh hóa theo kit API 50 CHB của chủng L.SC.1.2 52 3.8 Kết quả đo giá trị mật độ quang (OD) của BSA 61 3.9 Kết quả đo giá trị mật độ quang (OD) và hàm lượng protein của dịch nổi vi khuẩn 62 3.10 Kết quả xác định hoạt tính enzyme keratinase 63 Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17 vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Số hiệu hình vẽ Tên hình vẽ Trang 1.1 Một số hình dạng lông vũ 3 1.2 Cấu tạo phân tử keratin 5 1.3 Ảnh dưới kính hiển vi các sợi bên trong tế bào keratin 6 1.4 Cấu tạo phân tử enzyme keratinase 7 3.1 Khả năng thủy phân lông vũ của 4 chủng chọn lọc (Sau 4 ngày nuôi cấy lắc) 44 3.2 Khả năng sinh trưởng và thủy phân lông vũ của các chủng vi khuẩn trên các môi trường khác nhau (Sau 4 ngày nuôi cấy lắc) 46 3.3 Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi khuẩn trên các môi trường khác nhau (Sau 4 ngày nuôi cấy lắc) 46 3.4 Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi khuẩn các khung nhiệt độ khác nhau (Sau 4 ngày nuôi cấy lắc) 48 3.5 Hình ảnh tế bào vi khuẩn với độ phóng đại 4800 lần 49 3.6 Ảnh điện di DNA tổng số 53 3.7 Sản phẩm PCR bằng mồi 16S 54 3.8 Cây phát sinh chủng loại của 2 chủng Đ.GT.2.2 và L.SC.1.2 55 3.9 Sản phẩm PCR bằng mồi ker F và ker R 56 3.10 Sản phẩm thôi gel tinh sạch gene ker 56 Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17 vii 3.11 Sản phẩm tinh sạch gene ker và vector pET32asau khi xử lý bằng 2 enzyme cắt 57 3.12 Vector tái tổ hợp pET32a /ker 58 3.13 Sản phẩm biến nạp của 2 chủng vi khuẩn vào tế bào khả biến E.coli DH10B 58 3.14 Ảnh điện di sản phẩm tách DNA plasmid tái tổ hợp của các chủng sau biến nạp 59 3.15 Sản phẩm phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng 2 enzyme cắt XhoI và BamHI 60 3.16 Đường chuẩn Bradford 61 [...]... khả năng phân huỷ lông vũ, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: Tên đề tài Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân keratin từ lông vũ gia cầm và thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện keratinase trong tế bào vi khuẩn E.Coli ”  Mục tiêu của đề tài: - Tuyển chọn được bộ chủng vi sinh vật đất thuộc các nhóm vi sinh vật như Bacillus, Chryseobacterium và Vibrio có hoạt tính thủy. .. sinh tổng hợp keratinase và thủy phân keratin các kỹ thuật sinh học phân tử đã được sử dụng trong nghiên cứu phát triển các chủng đột biến và tái tổ hợp Bằng kỹ thuật chọn dòng và biểu hiện gen tái tổ hợp, sinh tổng hợp keratinase tái tổ hợp trong tế bào vi sinh vật không gây hại với thông tin di truyền từ vi sinh vật có nguồn bệnh tới sức khỏe cũng đã được nghiên cứu Gen kerA, mã hóa keratinse của chủng. .. vi sinh vật và được phân lập từ nhiều vị trí địa lý khác nhau cả ở điều kiện môi trường hiếu khí và kỵ khí Vì vậy, vi khuẩn tổng hợp keratinase có sự đa dạng rất lớn về đặc tính hóa sinh và lý sinh Các đặc tính của một số vi khuẩn tổng hợp keratinase được tóm tắt trong bảng 1.1 Bảng 1.1: Sự đa dạng vi sinh vật có khả năng sinh keratinase và các đặc tính hóa sinh của keratianse Dạng xúc Vi sinh vật Trọng... Nguyễn Thị Minh MỞ ĐẦU Lông vũ có lượng protein keratin thô rất cao (90 - 95%), nhưng phần lớn protein trong lông vũ không hòa tan trong nước Mặc dù rất khó bị phân hủy, nhưng các chất thải keratin có thể bị phân hủy bởi các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm có khả năng sinh tổng hợp keratinase Vi sinh vật sinh tổng hợp keratinase đã được phân lập từ nhiều vị trí địa lý khác nhau, từ đất Nam cực đến suối... 1.3: Ảnh dƣới kính hiển vi các sợi bên trong tế bào keratin 1.2 Keratinase Keratinase là một enzyme thuộc nhóm protease Đây là enzyme có khả năng thuỷ phân cấu trúc phức tạp của keratin lông Keratinase được tạo ra từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau thuộc nhóm vi sinh vật cổ, nhóm vi sinh vật nhân thật và nấm Keratinase thuộc nhóm enzyme protease, có khả năng thủy phân protein keratin không tan Các... để thủy phân [3] Hiện nay, tại Phòng Vi sinh vật đất, Vi n Công nghệ Sinh học đã và đang tiếp tục phân lập các chủng vi khuẩn có thể thuỷ phân lông vũ Sau khi tìm ra những điều kiện tối ưu cho các chủng có khả năng thuỷ phân tốt sẽ tiến hành định tên chủng bằng các phương pháp hoá sinh (API 20 NE và API 50 CHB) cũng như định loại bằng phương pháp sinh học phân tử Sau khi phân lập và tuyển chọn các chủng. .. lông thủy phân với Keratinase ở gà trưởng thành là 82% cao hơn so với bột lông thủy phân thương mại, 60% Vậy có thể kết luận rằng keratinase có khả năng thuỷ phân và biến đổi bột lông vũ thành nguồn protein có thể tiêu hoá ở mức tối đa là 70% protein khẩu phần trong thức ăn 1.5.2 Tạo phân bón Với tác dụng của các chủng vi khuẩn này chúng có thể sử dụng làm các loại phân bón vi sinh như: phân vi sinh vật. .. lượng lông còn lại sau 4 ngày nuôi cấy 2.2.4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH lên khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn thủy phân lông vũ Các chủng vi khuẩn đã chọn lọc là có khả năng thuỷ phân lông vũ tốt nhất, được thử nghiệm trong cùng môi trường lông vũ trên các khung nhiệt độ khác nhau với mục đích là tìm ra nhiệt độ thích hợp Khi tìm được nhiệt độ thích hợp với từng chủng thì giúp các chủng đó có khả năng. .. được rằng vi sinh vật thủy phân keratin có thể tồn tại trong lông, móng, guốc Chính sự xuất hiện của vi sinh vật này đã làm tăng khả năng xử lý chất thải, giảm thiểu gây ô nhiễm môi trường Đặc biệt keratinase của chủng vi sinh vật là thành phần quan trọng trong công nghệ sinh học liên quan tới nguồn chất thải công nghiệp lông vũ và trong chăn nuôi [24] Đối với phân bón, keratin sau khi bị thủy phân thành... (Làm khô lông và cân khối lượng còn lại sau nuôi cấy lắc) → xác định tỉ lệ % về khả năng thuỷ phân lông vũ của các chủng vi khuẩn theo công thức: A (%) = mBĐ  mC  100% mBĐ A (%): Tỉ lệ phần trăm về sự thuỷ phân của các chủng mBĐ: Trọng lượng lông vũ ban đầu mC: Trọng lượng lông vũ còn lại sau thời gian nuôi cấy lắc → Chọn lọc các chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân keratin mạnh nhất (sinh keratinase . keratin có thể bị phân hủy bởi các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm có khả năng sinh tổng hợp keratinase. Vi sinh vật sinh tổng hợp keratinase đã được phân lập từ nhiều vị trí địa lý khác nhau, từ. có khả năng phân huỷ lông vũ, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: Tên đề tài Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân keratin từ lông vũ gia cầm và thiết kế vector. hiển vi các sợi bên trong tế bào keratin 1.2. Keratinase Keratinase là một enzyme thuộc nhóm protease. Đây là enzyme có khả năng thuỷ phân cấu trúc phức tạp của keratin lông. Keratinase được