Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM VĂN PHÚC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN NHANH VÀ ĐỒNG THỜI Staphylococcus aureus VÀ Salmonella typhi GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM VĂN PHÚC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN NHANH VÀ ĐỒNG THỜI Staphylococcus aureus VÀ Salmonella typhi GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã Số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. NGUYỄN VĂN DUY Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Văn Duy. Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này là trung thực. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Học viên Phạm Văn Phúc Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chương trình cao học và viết luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Lê Quang Hòa, trưởng phòng Công nghệ gen, Viện CNSH&CNTP, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội; TS. Nguyễn Đắc Trung, phó trưởng khoa Y học Cơ sở, Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên; ThS. Nguyễn Thị Lan Hương, cán bộ Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Thái Nguyên; ThS. Đỗ Bích Duệ, cán bộ phòng Vi sinh, Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã cung cấp các chủng vi sinh vật để thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn các cán bộ phòng Vi sinh, Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; các cán bộ Bộ môn Vi sinh, Khoa Y học Cơ sở, Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên; các cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Tôi x . Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 20 tháng 8 năm 2013 Học viên Phạm Văn Phúc Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài 2 4.1. Ý nghĩa khoa học 2 4.2. Ý nghĩa thực tiễn 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus và Salmonella 3 1.1.1. Trên thế giới 3 1.1.2. Ở Việt Nam 6 1.2. Tổng quan về Salmonella typhi và Staphylococcus aureus 7 1.2.1. Salmonella typhi 7 1.2.1.1. Hình thái, cấu tạo của Salmonella typhi 7 1.2.1.2. Cấu trúc di truyền của Salmonella typhi 10 1.2.1.3. Các chỉ thị phân tử của Salmonella typhi 11 1.2.1.4. Đặc tính sinh học của Salmonella typhi 12 1.2.1.5. Đặc tính gây bệnh của Salmonella typhi 14 1.2.2. Staphylococcus aureus 15 1.2.2.1 Hình thái , cấu tạo của Staphylococcus aureus 15 1.2.2.2. Cấu trúc di truyền của Staphylococcus aureus 18 1.2.2.3. Các chỉ thị phân tử của Staphylococcus aureus 18 1.2.2.4. Đặc tính sinh học Staphylococcus aureus 19 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv 1.2.2.5. Đặc tính gây bệnh do Staphylococcus aureus 22 1.3. Các phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 24 1.3.1. Các phương pháp vi sinh 24 1.3.2. Các phương pháp sinh học phân tử 25 1.4. Tổng quan về kỹ thuật multiplex PCR 27 1.4.1. Nguyên lý của kỹ thuật multiplex PCR 27 1.4.2. Ứng dụng của kỹ thuật multiplex PCR trong phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh……………………………………………………………………………….28 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. Đối tượng nghiên cứu 31 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 31 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu 31 2.2.2. Thời gian nghiên cứu 31 2.3. Vật liệu nghiên cứu 31 2.3.1. Các cặp mồi sử dụng trong đề tài 31 2.3.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài 32 2.3.3. Dụng cụ, thiết bị 33 2.4. Phương pháp nghiên cứu 33 2.4.1. Phương pháp thiết kế cặp mồi 33 2.4.1.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Staphylococcus aureus 33 2.4.1.2. Thử nghiệm khả năng khuếch đại của các cặp mồi sử dụng bằng phản ứng PCR 34 2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA 35 2.4.2.1. Phá vỡ tế bào vi khuẩn bằng sốc nhiệt 35 2.4.2.2. Tách chiết DNA vi khuẩn bằng hóa chất 36 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v 2.4.2.3. Định lượng, kiểm tra chất lượng tách chiết DNA 37 2.4.3. Phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 38 2.4.4. Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR 39 2.4.5. Phương pháp xác định độ đặc hiệu của multiplex PCR 39 Chƣơng 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 40 3.1. Thiết kế cặp mồi cho phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 40 3.2. Xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi bằng phản ứng multiplex PCR 43 3.2.1. Tách chiết DNA tổng số của các chủng vi khuẩn 43 3.2.2. Nghiên cứu nồng độ DNA tối thiểu của các phản ứng PCR đơn phát hiện riêng rẽ Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 45 3.2.3. Tối ưu phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 47 3.2.4. Thử nghiệm quy trình kỹ thuật multiplex PCR với các chủng vi khuẩn thuần …………………………………………………………………………… 53 3.2.5. Thử nghiệm quy trình kỹ thuật multiplex PCR với các phương pháp tách chiết DNA khác nhau 54 3.3. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi. 56 3.4. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi. 57 Chƣơng 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 60 4.1. Kết luận 60 4.2. Kiến nghị 61 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 DANH MỤC CÁC TỪ, CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ ATTP An toàn thực phẩm ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm CIAA Hỗn hợp gồm 24 chloroform : 1 isoamylalcohol CFU Colony Forming Unit - Đơn vị đo khuẩn lạc DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate NĐTP Ngộ độc thực phẩm OD Optical Density - Giá trị mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo danh pháp KauffmannWhite. 8 Bảng 1.2. Những đặc tính của S. aureus, S. epidermidis và Micrococci 22 Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 32 Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 32 Bảng 2.3. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 33 Bảng 3.1. Kết quả xác định nồng độ DNA tổng số của các chủng vi khuẩn nghiên cứu. 44 [...]... hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm với độ nhạy và độ đặc hiệu cao 3 Nội dung nghiên cứu * Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng multiplex PCR * Xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi bằng phản ứng multiplex PCR * Xác định độ nhạy của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus. .. Salmonella typhi * Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 4 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm Tạo tiền đề khoa học cho việc phát triển bộ kít phát hiện nhanh hai... năng lực nghiên cứu và được sự chấp thuận của Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Đại học Thái Nguyên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi gây bệnh trong thực phẩm” 2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Xây dựng được kỹ thuật multiplex PCR phát... ứng dụng trong việc phát hiện nhanh và đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh trong mẫu phân tích dựa trên các dấu hiệu phân tử mang tính đặc hiệu loài Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 Các kỹ thuật này bao gồm kỹ thuật PCR, multiplex PCR, ELISA, DNA arrays… Trong đó multiplex PCR là kỹ thuật có độ nhạy cao, cho phép phát hiện nhanh và đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh chỉ trong một... type): tụ cầu được phân vào các nhóm I, II, III, IV Đây là phương pháp sử dụng nhiều trong phân loại S aureus * Đặc điểm cấu trúc của Staphylococcus aureus (Hình 1.2) Hình 1.2 Hình thái Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus thuộc giống Staphylococcus, do đó mang những tính chất chung của Staphylococcus Staphylococcus aureus là những vi khuẩn hình cầu, không di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5... và được thải ra ngoài qua phân [43] 1.2.2 Staphylococcus aureus 1.2.2.1 Hình thái , cấu tạo của Staphylococcus aureus * Danh pháp và phân loại của Staphylococcus aureus Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Cocci, bộ Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus, loài Staphylococcus aureus Tên khoa học là Staphylococcus aureus [15] Số hóa bởi trung tâm học liệu... 1,8 ng/µl DNA tổng số của S typhi và 2,0 ng/µl DNA tổng số của S aureus 49 Hình 3.6 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR ở các nồng độ mồi khác nhau 51 Hình 3.7 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm multiplex PCR trên các chủng Salmonella typhi và Staphylococcus aureus 54 Hình 3.8 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR khi sử dụng 2 phương pháp... khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm là một trong những nguyên nhân góp phần giúp cho những tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan trong cộng đồng, ảnh hưởng đến sức khỏe của con người và gây ảnh hưởng đến công tác phòng chống bệnh truyền nhiễm trong cộng đồng Với sự phát triển của sinh học phân tử, các vùng gen đặc hiệu cho các loài vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh thuộc chi Staphylococcus. .. thì S typhi và S paratyphi chỉ gây bệnh ở người và còn gây nhiễm trùng hệ thống Trình tự DNA bộ gen S typhi và S paratyphi có mức độ tương đồng cao nhất Sự bất hoạt những Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 11 gen đóng vai trò quan trọng trong tương tác với các tế bào chủ, các gen làm thay đổi chu trình kí sinh nội bào…được xem là cơ chế tiến hóa để S typhi cũng như S paratyphi... làm 972 người mắc, trong đó có 726 người phải nhập viện và đã có 04 trường hợp tử vong Phần lớn các vụ NĐTP xảy ra với quy mô nhiều người mắc, nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc là do thực phẩm nhiễm vi sinh vật Đặc biệt vi khuẩn thương hàn (Salmonella typhi) và tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) là thủ phạm chính gây ra các vụ NĐTP Để phát hiện Salmonella typhi và Staphylococcus aureus, phương pháp . ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi. 56 3.4. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus. thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi gây bệnh trong thực phẩm”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Xây dựng được kỹ thuật multiplex PCR. hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi bằng phản ứng multiplex PCR. * Xác định độ nhạy của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus