BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH ĐỊNH HCV BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : BÙI QUANG THIỆU MSSV: 0811110081 Lớp: 08CSH2 TP. Hồ Chí Minh, 2011 MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT……………………………………….… i DANH MỤC HÌNH ẢNH………………………………….…………………ii DANH MỤC CÁC BẢNG……………………………………………………iii CHƯƠNG MỞ ĐẦU………………………………………………….………iv CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI C 1.1. Giới thiệu về bệnh viêm gan……………………………………… 2 1.1.1. Giới thiệu chung ……………………………….……………. 2 1.1.2. Lịch sử phát hiện viêm gan C………………………………… 2 1.2. Dịch tể học…………………………………………………………… 3 1.2.1.Tình hình nhiễm siêu vi C tại thế giới………………………… 3 1.2.2. Tình hình nhiễm siêu vi C trên Việt Nam …………………… 5 1.3. Con đường lây nhiễm……………………………………………… 5 1.4. Triệu chứng lâm sàng………………… …… …… …………… 6 1.5. Biện pháp phòng ngừa và điều trị 7 1.5.1. Biện pháp phòng ngừa………… …………………………… 8 1.5.2. Điều trị…………………………… …… 8 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ VIÊM GAN SIÊU VI C 2.1. Giới thiệu…………………………………………… …… …… 11 2.2. Cấu trúc - đặc điểm…………………………………………… …12 2.2.1. Protein cấu trúc……………………………………… …… 12 2.2.2. Protein không cấu trúc ………………….…………… …… 13 2.3. Cơ chế gây bệnh…………………………………………………… 13 2.3.1. Sự sao chép và xâm nhập tế bào chủ……………… ……… 14 2.3.2. Nhiễm HCV cấp……………………………………… …… 14 CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM GAN C 3.1. Chẩn đoán lâm sàng……………………………………………… 17 3.1.1. Xét nghiệm chẩn đoán tình trạng viêm gan………… ……….17 3.1.2. Xét nghiệm đánh giá chức năng gan………………… ………17 3.1.3. Siêu âm bụng tổng quát………………………………… … 17 3.1.4. Sinh thiết tế bào gan……………………………………… 17 3.1.5. Xét nghiệm miễm dịch học…………………… …………….17 3.2. Chẩn đoán cận lâm sàng……………………………………………18 3.2.1. Phương pháp bDNA…………………… ………………… 18 3.2.2. Phương pháp ELISA…………………………… ………… 18 3.2.3. PCR định lượng cạnh tranh……………… ………………….19 3.2.4. Kỹ thuật Hybrid……………………… …………………… 20 3.2.5. Kỹ thuật Real-Time PCR………………… … 20 CHƯƠNG 4: QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT ĐỊNH LƯỢNG HCV 4.1. Kỹ thuật Real-Time PCR………………………………………….23 4.1.1. Nguyên tắc……………………………………………… ….23 4.1.2. Các thành phần của phản ứng Real-Time PCR………… 24 4.1.3. Các kiểu phản ứng Real-Time PCR…………………… …25 4.1.4. Khái niệm chu kỳ ngưỡng………………………… ….……28 4.1.5. Thiết kế đường cong chuẩn………… ………………… ….29 4.1.6. Tính lặp lại của phản ứng Real-Time PCR………… … ….30 4.2. Quy trình thực hiện…………………………………… …… ….33 4.3. Thuyết minh quy trình……………………………………… … 34 4.3.1. Phương pháp thu nhận mẫu…………… …………… … 34 4.3.2. Thu nhận RNA………… ………………………… …… 35 4.3.3. Quy trình thực hiện…………………… …………… ….35 4.3.4. Thực hiện phản ứng RT……………… ……………………35 4.3.5. Thực hiện phản ứng Real-Time PCR……… ………… ….36 4.4. Đọc và giải thích kết quả ……………………………… ………44 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN……………………………………………….45 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ALT : Aspartate Amino Transferase AST : Alanin Amino Transferase bDNA : branched DNA bp : base pair cDNA :complementary DNA Ct : threshold Cycle DNA : Desoxyribonucle acid dNTPs : deoxynucleotide Triphosphates ELISA : Enzyme Linked Immuno Assay FRET : Fluorescent Resonance HAV : Hepatitis A Virus HBV : Hepatitis B Virus HCV : Hepatitis C Virus mRNA : messenger Ribonucleic Acid RNA : Ribonucle acid PCR : Polymerase Chain Reaction RT-PCR : Reverse Transcription-Polymerase Chai Reaction Tm : melting Temperature DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1: Biểu đồ phân bố tình hình nhiễm HCV trên thế giới………… 3 Hình 2.1: Cấu trúc HCV…………………………………………………11 Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc gen HCV………………………………………12 Hình 4.1: Các bước của một chu trình Real-Time PCR…………………23 Hình 4.2 : Máy ly tâm thu huyết thanh………………………………… 30 Hình 4.3 : Máy Stratagene Mx3000P………………………………… 30 Hình 4.4 : Máy ly tâm……………………………………………………31 Hình 4.5 : Máy vortex……………………………………………………31 Hình 4.6 : Máy ủ nhiệt khô………………………………………………32 Hình 4.7 : Máy ly tâm eppendorf 0.2ml…………………………………32 Hình 4.8: Quá trình luân nhiệt………………………………………… 37 Hình 4.9: Kết quả chạy Real-Time PCR cho mẫu bệnh phẩm nhiễm HCV…………………………………………………………… 40 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điều trị viêm gan C………………7 Bảng 4.1. Kết quả quá trình thử nghiệm quy trình Real-Time PCR…………… 38 CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh gan do siêu vi C (hepatilis C virus – HCV) gây ra là một trong những bệnh lý nguy hiểm về gan. Bệnh không có các triệu chứng lâm sàng rõ ràng, diễn tiến âm thầm, 85% người bệnh chuyển sang xơ gan và ung thư gan. Hơn nữa, bệnh chưa có vacxin phòng ngừa, chi phí cho quá trình điều trị là khá cao. Những yếu tố góp phần tăng tỷ lệ điều trị thành công là phát hiện sớm bện, xác định được nồng độ và loại type virus nhiễm trong máu. Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, hiện nay, đã có thể phát hiện một số type phổ biến của virus tại Việt Nam. Đối với yêu cầu xác định nồng độ virus trong máu, kỹ thuật realtime PCR có thể đáp ứng được các yêu cầu đặt ra. Vì vậy, tôi tiến hành tìm hiểu đề tài “Tìm hiểu quy trình định lượng HCV bằng kỹ thuật Realtime PCR”. 2. Mục đích nghiên cứu Tìm hiểu về quy trình định lượng virus viêm gan C bằng phương pháp sinh học phân tử, giúp phát hiện bệnh nhanh chóng và chính xác để điều trị kịp thời. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Tìm hiểu về quy trình định lượng virus viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Đánh giá được độ nhạy và chính xác của quy trình. 4. Phương pháp nghiên cứu Thu thập tài liệu. Tìm hiểu các quy trình phát hiện virus viêm gan siêu vi C. Xác định quy trình về mặt lý thuyết. Dự đoán đánh giá quy trình đề xuất. 5. Các kết quả đạt được của đề tài Tìm hiểu thành công về quy trình định lượng virus viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử, điều quan trọng ở đây là việc tách chiết và tinh sạch RNA của vi virus viêm gan C để tránh trường hợp dương tính giả có thể xảy ra. Đánh giá được độ nhạy và chính xác của quy trình. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 2 1.1. Giới thiệu về bệnh viêm gan C [1,9] 1.1.1. Giới thiệu chung Gan là cơ quan nội tạng lớn nhất và đảm nhận nhiều vai trò chức năng quan trọng của cơ thể như hỗ trợ tiêu hóa, điều hòa chuyển hóa năng lượng, dự trữ máu, khử độc,… Viêm gan là tính trạng gan bị sưng hoại tử tế bào gan, giảm hoặc mất dần chức năng hoạt động. Có nhiều nguyên nhân gây viêm gan như thuốc, rượu, chất độc,… quan trọng và phổ biến nhất là do nhiễm siêu vi. Có nhiều loại siêu vi viêm gan: A, B, C, D, E, G, TT virus, Sen virus,… trong đó, chỉ có virus gây viêm gan B, C, D là có thể gây viêm gan mãn tính, xơ gan và dẫn đến ung thư gan. Bệnh viêm gan siêu vi C lần đầu được phát hiện vào năm 1989, do Hepatitis C virus gây ra. Bệnh thường ít gây triệu chứng rõ ràng và điển hình. Chủ yếu là các dấu hiệu mệt mỏi, chán ăn rối loạn tiêu hóa, ít khi bị vàng da. Việc phát hiện bệnh hầu hết là do tình cờ khi xét nghiệm máu hoặc kiểm tra sức khỏe. Diễn tiến bệnh âm thầm, chưa có vacxin phòng ngừa, tỷ lệ chuyển thành xơ gan và ung thư gan cao hơn so với bệnh viêm gan so siêu vi B. Mặt khác, chi phí điều trị bệnh là khá cao và cần tuân theo phát đồ điều trị chặt chẽ . Do đó, việc xét nghiệm máu định kỳ là rất cần thiết để phát hiện bệnh gan sớm. 1.1.2. Lịch sử phát hiện viêm gan siêu vi C Năm 1975, Prince và cộng sự nhận định rằng có một chứng bệnh viêm gan siêu vi sau truyền máu không do viêm gan siêu vi B và có thời kỳ ủ bệnh dài hơn thời ủ bệnh do viêm gan siêu vi A. Sau đó, các tác giả: Bassler và cộng sự (1995), Lee và cộng sự (1993), Livak và cộng sự (1995) chứng minh về mặt huyết thanh học rằng bệnh viêm gan siêu vi loại này không có liên quan gì đến bệnh viêm gan siêu vi A và từ lúc này danh từ “bệnh viêm gan siêu vi không A không B” ra đời. Vào tháng 5 năm 1989 bằng phương pháp ly tâm siêu tốc huyết tương thu từ những con tinh tinh bị bệnh viêm gan siêu vi, Choo và cộng sự (1989) đã tách chiết nucleic acid của virus, tổng hợp cDNA từ RNA tách chiết, chèn vào bộ gen của λgt11 và xâm nhiễm E. coli, thu được có một dòng có phản ứng đặc hiệu với kháng thể có trong huyết thanh người bị bệnh viêm gan siêu vi không A không B sau [...]... đơn giản Đây là phương pháp định lượng có khả năng thay thế cho định lượng bằng Real-Time PCR ở những nơi không có thiết bị chuyên dụng cho Real-Time PCR 3.2.3 PCR định lượng cạnh tranh Phương pháp này nhân bản trong cùng eppendorf một trình tự mục tiêu cần định lượng và một trình tự được gọi là chứng định lượng có nồng độ biết trước Các nồng độ giảm dần của chứng định lượng được cho vào từng phản... kể vào việc hình thành một phương pháp định lượng mới, đó là Real – Time PCR SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 20 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4 QUY TRÌNH REAL-TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG HCV 4.1 Kỹ thuật Real-Time PCR 4.1.1 Nguyên tắc SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 21 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Real-time PCR cũng dựa trên PCR thường, nhưng phương pháp này có thể định lượng được hàm lượng DNA/RNA có trong mẫu nhờ các chất... phosphatase nên sẽ làm gia tăng độ nhạy của kỹ thuật Sau đó, cơ chất phát ánh sáng của alkaline phosphatase là CSPD được cho vào phản ứng và ánh sáng phát ra được phân tích bằng máy đo ánh sáng Hàm lượng trình tự mục tiêu được định lượng bằng giá trị RLU có hàm lượng tương ứng với hàm lượng trình tự đích có trong mẫu ban đầu 3.2.5 Kỹ thuật Real-Time PCR Các kỹ thuật cổ điển như Southern blot hay Northern... đến sự phát triển các phương pháp định lượng dựa trên cơ sở lai phân tử như RNAse protection, dot blot,… Tuy nhiên, các phương pháp này có chung nhựơc điểm là thời gian tiến hành kéo dài và cần một lượng nucleic acid ban đầu lớn Sự ra đời của kỹ thuật PCR đã khắc phục các nhược điểm nêu trên Các phương pháp định lượng dựa trên kỹ thuật PCR như PCR ELISA, PCR định lượng cạnh tranh,… ngày càng phát triển... bản của chứng định lượng và trình tự mục tiêu bằng nhau thì nồng độ thì nồng độ của trình tự mục tiêu chính là nồng của chứng định lượng trong phản ứng đó Thông thường, chứng định lượng được thiết kế sao cho gần giống với trình tự mục tiêu nhất về kích thước, thành phần nucleotide để sự nhân bản của trình tự mục tiêu không bị ức chế bởi chứng định lượng và ngược lại Tuy nhiên, chứng định lượng cũng phải... lượng sản phẩm PCR để suy ra hàm lượng nucleic acid ban đầu thì không chính xác vì các mẫu có hàm lượng nucleic acid ban đầu khác nhau sẽ có hàm lượng sản phẩm PCR tại pha bão hòa như nhau Vấn đề thứ hai là sự tồn tại của các chất kìm hãm phản ứng PCR, cả sau quá trình tách chiết, cũng ảnh hưởng lớn đến hàm lượng sản phẩm PCR sau cùng Nhiều cải tiến nhằm làm cho phương pháp định lượng dựa trên kỹ thuật. .. tương ứng với hàm lượng PCR có trong mẫu Việc định lượng RNA HCV có trong mẫu được thực hiện bằng cách quy giá trị cường độ màu ỡ mỗi vi giếng vào một đường chuẩn xây dựng từ những mẫu có nồng độ RNA HCV biết trước Phương pháp này có khả năng phát hiện HCV với nồng độ là 600IU/ml Độ tuyến tính của phương pháp nằm trong khoảng 600IU/ml đến 850000IU/ml Phương pháp định lượng bằng PCR ELISA có khả năng... RealTime PCR là do các chất phát huỳnh quang có nồng độ xác định có sẵn trong thành phần phản ứng PCR Chất phát huỳnh quang này khác với chất phát huỳnh quang được sử dụng để định lượng Trong phản ứng Real-Time PCR sử dụng Taqman probe thì chính quencher của của Taqman probe sẽ đóng vai trò tạo tín hiệu nền cho phản ứng 4.1.5 Thiết kế đường cong chuẩn cho phản ứng Real-Time PCR Việc định lượng trong... phân biệt được với trình tự mục tiêu bằng cách tăng kích thước hay them vị trí nhận biết của một enzyme cắt giới hạn vào trình tự của chứng định lượng SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 18 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3.2.4 Kỹ thuật Hybrid Capture Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc lai phân tử giữa một mạch của phân tử DNA mạch đôi và phân tử RNA tạo thành một thể lai DNA:RNA Các mẫu được xủ lý bằng dung dịch ly giải... Tổng hợp RNA HCV mạch dương : Sau khi hình thành, chuỗi RNA mạch âm thành khuôn mẫu để tổng hợp bộ gen RNA mạch dương của virus mới Quá trình này được thực hiện bởi HCV RNA polymerase  Sự tạo vỏ ngoài HCV : Sự nảy chồi của HCV, các hạt RNA được tạo vỏ nảy chồi qua màng bào tương  Sự bài tiết HCV kết hợp chủ yếu với lưới nội bào tương với khoảng 1012 virion HCV mỗi ngày 2.3.1.1 Nhiễm HCV cấp HCV được . định nồng độ virus trong máu, kỹ thuật realtime PCR có thể đáp ứng được các yêu cầu đặt ra. Vì vậy, tôi tiến hành tìm hiểu đề tài Tìm hiểu quy trình định lượng HCV bằng kỹ thuật Realtime PCR 3.2.3. PCR định lượng cạnh tranh……………… ………………….19 3.2.4. Kỹ thuật Hybrid……………………… …………………… 20 3.2.5. Kỹ thuật Real-Time PCR ……………… … 20 CHƯƠNG 4: QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT ĐỊNH LƯỢNG HCV. Xác định quy trình về mặt lý thuyết. Dự đoán đánh giá quy trình đề xuất. 5. Các kết quả đạt được của đề tài Tìm hiểu thành công về quy trình định lượng virus viêm gan C bằng kỹ thuật