BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN VÀO CÂY HOA CẨM CHƯỚNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP Agrobacterium tumefaciens KẾT HỢP SÓNG SIÊU ÂM Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã ngành : 111 GVHD: TS. NGUYỄN THỊ THANH SVTH : TRƯƠNG KHÁNH LINH MSSV : 105111081 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2009 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH SÁCH BẢNG BIỂU v DANH SÁCH HÌNH VẼ vi LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Công nghệ gen thực vật 1 1.1.1. Các phương pháp chuyển gen thực vật 1 1.1.1.1. Phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng sóng siêu âm 1 1.1.1.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium 3 1.1.1.3. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm. 9 1.1.2. Đoạn gen cần tách dòng, gen chỉ thị, gen chọn lọc 12 1.1.2.1. Đoạn gen cần tách dòng và gen ipt (isopentenyl transferase) 12 1.1.2.2. Gen chỉ thị, gen chọn lọc 14 1.1.3. Các phương pháp phân tích cây chuyển gen 16 1.1.3.1. Phương pháp thử khả năng kháng hygromycin, kanamycin, PPT (phosphinothiricin) của cây tái sinh 16 1.1.3.2. Phương pháp thử GUS 16 1.1.3.3. Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 17 1.1.3.4. Phương pháp phân tích điện di 18 1.1.3.5. Phương pháp Southern blot. 19 ii 1.2. Giới thiệu về cây hoa cẩm chướng 21 1.2.1. Khái quát về cây cẩm chướng 21 1.2.2. Đặc điểm hình thái và sự sinh trưởng phát triển của cây cẩm chướng 26 1.2.3. Điều kiện ngoại cảnh 27 1.2.4. Nhân giống cây cẩm chướng 29 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 33 2.1.1. Cẩm chướng 33 2.1.2. Chủng vi khuẩn A.tumefaciens có chứa plasmid pVDH396 tái tổ hợp 34 2.1.3. Môi trường và hóa chất sử dụng 35 2.1.4. Điều kiện thí nghiệm 36 2.2. Sơ đồ qui trình và nội dung nghiên cứu 37 2.3. Phương pháp nghiên cứu 38 2.3.1. Phương pháp khử trùng hạt cẩm chướng 38 2.3.2. Phương pháp khảo sát môi trường tái sinh cây cẩm chướng từ lá 40 2.3.3. Phương pháp khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycine 40 2.3.4. Phương pháp chuyển gen ipt gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciences kết hợp sóng siêu âm 41 2.3.5. Phương pháp nhuộm GUS 42 2.3.6. Phương pháp tách chiết DNA thực vật 44 2.3.7. Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 45 2.3.8. Phương pháp chạy điện di 46 iii CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát nồng độ javel và thời gian khử trùng hạt giống 48 3.2. Kết quả khảo sát môi trường tái sinh cây cẩm chướng từ lá 52 3.3. Kết quả khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycin 57 3.4. Kết quả chọn lọc mô cẩm chướng mang gen chuyển 61 3.5. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện tạm thời của gen chuyển 64 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận 66 4.2. Đề nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TDZ Thidiazuron (N-phenyl-N’-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea) NAA -naphthaleneacetic acid BA N 6 – Benzyladenine MS Murashige and Skoog LB Môi trường Luria-Bertania B5 Môi trường B5 MSB5 Môi trường MS có thay vitamin môi trường MS bằng vitamin môi trường B5. DNA Deoxyribonucleic acid T-DNA transfer-DNA GFP Green fluorescent protein GUSA β-Glucoronidase PEG Polymethylen glycol PCR Polymerase chain reaction AS acetosyringone Hpt hygromycine phosphotransferase Ipt isopentenyl transferase Hyg Hygromycin v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Tham khảo thị trường xuất khẩu hoa cây cảnh tháng 04/2007 25 Bảng 1.2: Tham khảo mặt hàng hoa cây cảnh xuất khẩu trong 10 ngày cuối tháng 07/2007 25 Bảng 3.1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu ở nồng độ javel 1.5% 48 Bảng 3.2: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu ở nồng độ javel 3.0% 48 Bảng 3.3: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu ở nồng độ javel 5.0% 48 Bảng 3.4: Số lượng chồi tạo thành trung bình ở mỗi mẫu sau 8 tuần nuôi cấy 52 Bảng 3.5: Mức độ tương đương của các kết quả thí nghiệm môi trường tái sinh 53 Bảng 3.6: Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho việc chọn lọc dòng chuyển gen 57 Bảng 3.7: Mức độ tương đương của các kết quả thử nồng độ hygromycin 59 Bảng 3.8: Số mẫu còn sống sót trên môi trường tái sinh chứa hygrmycin 12mg/l 61 vi DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Sóng siêu âm và hiện tượng cavitation 2 Hình 1.2: Hình vi khuẩn Agrobacterium dưới kính hiển vi 4 Hình 1.3: Nốt sần gây ra bởi vi khuẩn Agrobacterium trên thực vật. 4 Hình 1.4: Sơ đồ vector Ti plasmid 5 Hình 1.5. Quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật 6 Hình 1.6: Acetosyringone giúp hoạt hóa vùng vir trong quá trình chuyển gen 8 Hình 1.7: Hiện tượng cavitation (sự tạo và vỡ bọt) 10 Hình 1.8: Ảnh hưởng của sóng âm trên tế bào vào trong tế bào nhờ sóng âm. 10 Hình 1.9: Cơ chế chuyển DNA 11 Hình 1.10: Cơ chế chuyển DNA vào trong tế bào nhờ Agrobacterium tumefaciens kết hợp với sóng âm 11 Hình 1.11: Promoter đặc hiệu lão suy SAG12 được kết hợp với gen tổng hợp cytokinin isopentenyl transferase 13 Hình 1.12: Sơ đồ mô tả phương pháp Southern blot. 20 Hình 1.13: Hoa cẩm chướng 21 Hình 2.1: Hoa cẩm chướng 33 Hình 2.2: Hạt cẩm chướng (Dianthus caryophylus) 33 Hình 2.3: Cây cẩm chướng in vitro 33 Hình 2.4: Sơ đồ plasmid pVDH396 mang gen chọn lọc kháng hygromycin (gen hpt), gen gusA và gen ipt 34 Hình 2.5: Gen hpt, gen ipt, gen gusA trong vùng T-DNA của plasmid pVDH396 34 Hình 2.6: Sơ đồ qui trình tạo cây cẩm chướng chuyển gen 37 Hình 2.7: Qui trình khử mẫu 39 vii Hình 3.1: Biểu đồ khảo sát tỷ lệ nhiễm ở nồng độ javel 1.5%, 3.0%, 5.0% và thời gian khử trùng hạt 5 phút, 10 phút, 15 phút. 49 Hình 3.2: Biểu đồ khảo sát tỷ lệ nảy mầm ở nồng độ javel 3.0%, 5.0% và thời gian khử trùng hạt 5 phút, 10 phút, 15 phút 49 Hình 3.3: Sự phát triển của cây sau 13 ngày ở nồng độ javel 3.0% 50 Hình 3.4: Các mẫu khử trùng 5, 10, 15 phút ở javel 3.0% sau 10 ngày 51 Hình 3.5: Các mẫu khử trùng 5, 10, 15 phút ở javel 5.0% sau 10 ngày 51 Hình 3.6: Các mẫu khử trùng 5, 10, 15 phút ở javel 3.0% sau 14 ngày 51 Hính 3.7: Biểu đồ thể hiện mức độ tương đương của các kết quả thí nghiệm môi trường tái sinh 53 Hình 3.8: Biểu đồ khảo sát số chồi tái sinh từ môi trường TS0 đến TS10. 54 Hình 3.9: Biểu đồ so sánh khả năng tạo chồi của nhóm môi trường có nồng độ NAA 0.1 mg/l và nhóm môi trường có nồng độ NAA 0.2 mg/l 54 Hình 3.10: Khảo sát môi trường tái sinh tử diệp cẩm chướng. 55 Hình 3.11: Sơ đồ khảo sát nồng độ hygromycin trong 28 ngày 57 Hính 3.12: Biểu đồ thể hiện mức độ tương đương của các kết quả thử nồng độ hygromycin 59 Hình 3.13: Mẫu tử diệp trên môi trường tái sinh với các nồng độ hygromycin khác nhau 0 (đối chứng), 4, 8, 12, 16, 20 mg/l sau 4 tuần chọn lọc 60 Hình 3.14: Quá trình chọn lọc mô cẩm chướng mang gen chuyển trên môi trường tái sinh chứa hygomycin 62 viii Hình 3.15: Nhuộm GUS tử diệp cẩm chướng sau 6 ngày ủ với vi khuẩn. 64 Hình 3.16: Nhuộm GUS mô sẹo sau 3 tuần cấy chuyển trên môi trường chọn lọc chứa 12mg/l hygromycin 64 Hình 3.17: Kết quả PCR đối với gen hyt ở D. caryophylus L. sau chọn lọc. 64 LỜI MỞ ĐẦU Cây cẩm chướng du nhập vào Việt Nam từ thập niên 60, chủ yếu được trồng làm cây cảnh, trang trí. Về sau, đến những năm 80, các giống cây cẩm chướng từ các nước Pháp, Hà Lan, Trung Quốc… du nhập vào nước ta. Hiện nay, cây hoa cẩm chướng không chỉ được trồng để trang trí mà được sản xuất để phục vụ mục đích kinh tế, sản xuất hoa cắt cành. Tuy nhiên, hoa do chúng ta xuất khẩu chưa thể cạnh tranh được với các nước lớn do chất lượng và màu sắc hoa không phong phú bằng. Để hướng tới mục đích kinh tế, cần cải thiện và nâng cao chất lượng giống hoa cẩm chướng. Phương pháp khoa học ta có thể áp dụng là phục tráng, lai tạo và chuyển các gen mang đặc tính tốt cho cây. Một trong những yếu tố làm giảm chất lượng hoa là sự lão suy cành hoa sau khi cắt. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã khám phá ra sự lão suy cây có thể khắc phục nhờ hợp chất cytokinin. Tuy nhiên xử lý ctytokinin từ bên ngoài có thể làm chậm sự lão suy lá trong một số loại cây một lá mầm và hai lá mầm, chiến lược chuyển gen sản xuất cytokinin tự điều chỉnh này được kỳ vọng có tiềm năng trong việc làm chậm quá trình lão suy ở một phổ rộng các loại cây trồng. Đề tài “Nghiên cứu chuyển gen vào cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm” với gen chuyển mục tiêu là gen ipt (isopentenyl transferase) tổng hợp cytokinin hướng hẹn sẽ cải thiện và nâng cao chất lượng giống cây hoa cẩm chướng. [...]... thuật chuyển gen trực tiếp bằng sóng siêu âm kể trên, còn nhiều kỹ thuật chuyển gen trực tiếp khác được sử dụng như kỹ thuật chuyển gen qua ống phấn, chuyển gen bằng phương pháp sốc nhiệt, chuyển gen bằng phương pháp điện xung, chuyển gen bằng kỹ thuật PEG (Polyethylen glycol), và hiện đại nhất là chuyển gen bằng súng bắn gen …[3, 4, 5, 12, 28] 1.1.1.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium. .. 6-10 ngày so với đối chứng và hoa cây chuyển gen kém mẫn cảm hơn đối với ethylen ngoại sinh Kết luận quan trọng của nghiên cứu này là có thể sử dụng gen ipt trong nghiên cứu chuyển nạp gen tạo giống cây trồng tăng tuổi thọ của hoa như hoa phong lan, cẩm chướng, lily…  Năm 2006, công trình nghiên cứu "Sự chậm lão suy lá trong cây cỏ linh lăng (Medicago sativa) chuyển gen ipt được kiểm soát bởi promoter... nghệ gen thực vật 1.1.1 Các phương pháp chuyển gen thực vật Chuyển gen là tập hợp nhiều kỹ thuật khác nhau nhằm đưa một gen lạ (một đoạn DNA) vào trong tế bào, gắn gen đó với bộ gen của tế bào làm cho gen lạ tồn tại lâu dài, ổn định và được biểu hiện tạo nên các thể chuyển gen hay sinh vật biến đổi gen (GMO – Genetically Modified Organism) Các kỹ thuật chuyển gen được chia làm 2 nhóm phương pháp: chuyển. .. các cytokinins trong hoa cây thuốc lá cảnh (Petunia) được chuyển gen ipt - promoter SAG12, làm chậm lão suy tràng hoa và giảm sự nhạy cảm đối với Ethylene" Hsiang Chang và cộng sự đã nghiên cứu chuyển gen ipt được điều khiển bởi promoter SAG12 vào cây hoa Dã yên (Petunia hybrida cv ‘V26’) bằng phương pháp dùng vi khuẩn A tumefaciens Kết quả cho thấy hoa của các dòng cây chuyển gen có tuổi thọ dài hơn... sự thực hiện, tạo cây cỏ linh lăng tăng giá trị về chất và lượng khi sử dụng làm nguồn thức ăn gia súc Phương pháp chuyển gen gián tiếp qua A tumefaciens  Một nghiên cứu quan trọng gần đây nhất do hai nhóm nghiên cứu của Mỹ và Nhật Bản ( Rivero và cs, 2007) đã tạo ra cây biến đổi gen có khả năng chống chịu được hạn hán bằng phương pháp chuyển gen ipt vào cây thuốc lá Các nhà nghiên cứu hy vọng phát... chóng tích hợp vào bộ gen thực vật, các gen trên T-DNA sẽ được biểu hiện, sự tổng hợp và giải phóng các hợp chất chuyển hóa mới – các hợp chất mà ta mong muốn sẽ được thực hiện Phương pháp SAAT mới được nghiên cứu và ứng dụng nhưng mang lại nhiều thành công và hứa hẹn trong công nghệ chuyển gen nói chung và chuyển gen thực vật nói riêng [3, 12, 15, 28] 1.1.2 Đoạn gen tách dòng, gen chỉ thị, gen chọn... bào tạo điều kiện cho các gen chuyển hay các vector mang gen chuyển xâm nhập vào tế bào Sau quá trình chuyển gen, dựa vào các gen chỉ thị, thực hiện quá trình sàng lọc để lựa chọn các thể chuyển gen (GMO – Genetically Modified Organism) Nuôi cấy hoặc chăm sóc các thể chuyển gen và kiểm tra sự biểu hiện gen mới trong thể chuyển gen, tiếp tục chọn lọc để tạo được các thể chuyển gen theo ý muốn có tính... đốt mang lá hẹp Cây mọc thành một bụi Hoa dùng cắm lọ nhỏ, cắm bàn chông hay cắm bát Năm 1970, lần đầu tiên các nhà làm vườn Pháp đã tạo ra giống cẩm chướng Remontant, cây cao, ra hoa nhiều lần trong năm Năm 1846, nuôi trồng được nhiều giống cẩm chướng hoang dại và điều khiển chúng ra hoa quanh năm Năm 1852, cẩm chướng từ Châu Âu du nhập vào Mỹ Tại đây đã có nhiều nghiên cứu về cây cẩm chướng Họ đã gây... bào đã được chuyển gen thành công Trong tế bào, hiện tượng cavitation khởi động và điều khiển rất khó, tuy nhiên có thể điều chỉnh nhờ sóng âm tác động đến các bọt khí Tùy vào đối tượng chuyển gen mà thời gian tạo sóng âm và tần số sóng âm được điều chỉnh Để tăng hiệu suất chuyển gen thì các nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào phương pháp chuyển gen dùng Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu... DNA mới, có khả năng xâm nhiễm vào nhiều loại cây, không có tác hại đáng kể cho thực vật Hiện nay, sử dụng virus chuyển gen thực vật còn ít vì DNA virus khó biến nạp vào hệ gen thực vật [ 3, 4, 13] 1.1.1.3 Phương pháp chuyển gen dùng Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm Ứng dụng tạo lỗ tạm thời trên màng tế bào - sonoporation của sóng siêu âm trong chuyển gen vào tế bào và mô phát triển nhanh . Đề tài Nghiên cứu chuyển gen vào cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm” với gen chuyển mục tiêu là gen ipt (isopentenyl transferase) tổng hợp cytokinin. CHÍ MINH KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN VÀO CÂY HOA CẨM CHƯỚNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP Agrobacterium tumefaciens KẾT HỢP SÓNG SIÊU. dung nghiên cứu 37 2.3. Phương pháp nghiên cứu 38 2.3.1. Phương pháp khử trùng hạt cẩm chướng 38 2.3.2. Phương pháp khảo sát môi trường tái sinh cây cẩm chướng từ lá 40 2.3.3. Phương pháp