ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THÀNH LUÂN THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN KHÁNG CHẤT DIỆT CỎ GLYPHOSATE Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60.42.014 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. LÊ VĂN SƠN Thái Nguyên - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN . Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Thành Luân XÁC NHẬN CỦA TRƢỞNG KHOA CHUYÊN MÔN XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Lê Văn Sơn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Văn Sơn đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành KS Hồ Mạnh Tường, cán bộ nghiên cứu , Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia về Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện thí nghiệm của đề tài. & Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi bày tỏ lời cảm ơn đến các đồng nghiệp, bạn bè cùng toàn thể gia đình đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên, ngày 16 tháng 04 năm 2014 Tác giả Nguyễn Thành Luân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các hình vii MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Chất diệt cỏ và ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp 3 2.1.1 Cỏ dại và cách phòng trừ 3 2.1.2. Các loại thuốc diệt cỏ đang sử dụng 4 2.2. Chất diệt cỏ glyphosate 8 2.2.1 Cấu tạo và cơ chế hoạt động của glyphosate 8 2.2.2. Tình hình sử dụng thuốc diệt cỏ glyphosate 10 2.3. EPSPS và ứng dụng trong tạo cây trồng kháng glyphosate 13 2.3.1. Cây trồng chuyển gen kháng chất diệt cỏ 13 2.3.2 EPSPS 18 2.3.3. Ứng dụng EPSPS trong tạo cây chuyển gen 19 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1. Vật liệu 22 3.1.1. Thực vật 22 3.1.2. Chủng vi khuẩn 22 3.1.3. Các vector 22 3.1.4. Hóa chất 22 3.1.5. Máy móc và thiết bị 23 3.2. Phương pháp nghiên cứu 23 3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc SP-EPSPS-Cmyc. 23 .tumefaciens CV58 29 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv yển gen. 30 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc SP-EPSPS-Cmyc. 34 4.1.2. Kết quả chuyển cấu trúc pBI121/EPSPS vào cây thuốc lá 42 4.1.3. Phân tích . 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 5.1. Kết luận 49 5. 2. Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase bp Cặp bazơ S3P shikimate phosphate-3 ESP 5 enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate cs cộng sự DEPC Diethy pyrocarbonate dNTP Deoxynucleotide Kb Kilo bazơ LB Luria Bertani PCR Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi polymerase ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long BAP 6-benzyladenine PVDF Polyvinylidene fluoride WT isopropylthio-β-galactoside RNAi wild type SP signal peptide gus β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid MS Môi trường muối cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) OD Optical density Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Phân bố 1 số loại cây trồng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ 14 2.2 Thống kê cây trồng chuyển gen được chấp nhận tại Mỹ 20 3.1 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn 24 3.2 Thành phần phản ứng lai SP-EPSPS-Cmyc vào vector pBI121 25 3.3 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 27 3.4 Thành phần phản ứng PCR với pUC18- F và pUC18- R 28 3.5 Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 31 3.6 Thành phần chạy phản ứng PCR với EPSPS-F và CYMC-R 32 4.1 Kết quả tạo cây thuốc lá chuyển gen SP-EPSPS-Cmyc 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Sơ đồ vector pBI121 22 4.1 Trình tự đoạn gen EPSPS theo NCBI 34 4.2 Trình tự đoạn gen mã hóa cho protein của EPSPS 35 4.3 Trình tự đoạn SP từ Dã yên thảo 35 4.4 Trình tự cấu trúc SP-EPSPS-Cmyc 36 4.5 Trình tự Protein biểu hiện của EPSPS 37 4.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pBluescriptII 37 4.7 Kết quả cắt vector pBI121 bằng XbaI/SacI 38 4.8 Khuẩn lạc E.coli DH5α mang plasmid 39 4.9 Kết quả điện di phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng XbaI/SacI và PCR 40 4.10 Kết quả PCR pBI121/EPSPS trong A. tumefaciens 42 4.11 Mảnh lá cảm ứng trên môi trường GM sau 2 ngày 43 4.12 Mảnh lá sau khi đồng nuôi cấy 2 ngày trên môi trường GM 43 4.13 Chồi mọc lên trên môi trường MS + BAP + kanamycin + cefortaxim 44 4.14 Các chồi tái sinh chuẩn bị chuyển sang môi trường ra rễ 44 4.15 Cây hoàn chỉnh chuẩn bị trồng ngoài môi trường 45 4.16 46 4.17 Kết quả lai Western blot 47 4.18 Kết quả kiểm tra các dòng thuốc lá mang gen EPSPS kháng glyphosate 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cỏ dại luôn là một vấn đề lớn với cây trồng. Cỏ dại không chỉ cạnh tranh với cây trồng để lấy nước, chất dinh dưỡng, ánh nắng mặt trời, khoảng không để phát triển mà còn là nơi cư trú cho côn trùng và các loại sâu bệnh gây hại, làm giảm sút chất lượng mùa màng, đem theo hạt giống cỏ dại trộn lẫn với hạt giống cây trồng. Theo phương pháp truyền thống cỏ dại thường được kiểm soát bằng cách: cầy sới, nhổ cỏ, phun thuốc diệt cỏ, hay kết hợp tất cả những tập quán này. Nhưng phương pháp này chỉ áp dụng được trên diện tích rất nhỏ. Biện pháp diệt cỏ hiệu quả cho diện tích canh tác lớn được đưa ra là phun thuốc diệt cỏ một lần trên diện tích lớn. Thuốc diệt cỏ tác động vào một số enzym chủ yếu trong quá trình trao đổi chất của cây, làm rối loạn quá trình tổng hợp hữu cơ của cây và cuối cùng là tiêu diệt cỏ dại. Loại thuốc diệt cỏ hay được sử dụng phổ biến ở Việt Nam là glyphosate và glufosinate. Hai loại thuốc diệt cỏ này rất hữu ích trong việc kiểm soát cỏ dại và ít ảnh hưởng trực tiếp lên vật nuôi và không tổn hại lâu trong môi trường. Chúng có hiệu quả cao nhất và an toàn nhất trong số những hoá chất dùng trong nông nghiệp. Tuy nhiên, hoạt tính tác động lên cỏ dại cũng tác động giống hệt lên cây trồng, kết quả là tiêu diệt cả cỏ dại và cây trồng. EPSPS là enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp các amino acid ng thơm 2 dạng: EPSPS I tồn tại ở thực vật và vi khuẩn, dạng này nó bị ức chế bởi glyphosate. Dạng EPSPS II chỉ có ở một số vi khuẩn như Pseudomonas sp. strain PG2982, Agrobacterium tumefaciens sp. strain CP4 và Staphylococcus aureus… Trong đó EPSPSII từ Agrobacterium tumefaciens sp. strain CP4 có tính kháng glyphosate mức độ cao và đã được nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng. Để giải quyết vấn đề Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 phòng trừ được cỏ dại và đảm bảo được năng suất chất lượng cây trồng, việc chọn tạo được giống cây trồng mang mang gen EPSPS từ A.tumefacien sp. CP4, có khả năng chống chịu được chất diệt cỏ glyphosate là một trong các hướng đi quan tâm nhất hiện nay. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate.” Đề tài được thực hiện nghiên cứu tại phòng Công nghệ tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm khoa học quốc gia Việt Nam. 1.2. Mục tiêu của đề tài Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate. 1.3. Nội dung nghiên cứu 1.3.1. Thiết kế vector chuyển gen - Xác định và sửa đổi trình tự nucleotid gen EPSPS phù hợp biểu hiện trong thực vật. - Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen mang cấu trúc EPSPS mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate. - Chuyển cấu trúc EPSPS vào vi khuẩn A. tumefaciens CV58 - Biến nạp cấu trúc EPSPS vào cây thuốc lá. - Chọn lọc các dòng thuốc lá chuyển gen. 1.3.3. Phân tích - Kiểm tra cấu trúc gen chuyển trong cây thuốc lá chuyển gen - Kiểm tra biểu hiện protein tái tổ hợp trong cây thuốc lá chuyển gen - Đánh giá khả năng kháng glyphosate của cây thuốc lá chuyển gen. [...]... hình sử dụng thuốc diệt cỏ glyphosate Glyphosate được các chuyên gia gọi là chất diệt cỏ “gần như lý tưởng”, do phổ rộng và có độc tính thấp so với các thuốc diệt cỏ khác, glyphosate đã nhanh chóng được nông dân đưa vào sử dụng rộng rãi Thuốc diệt cỏ glyphosate được sử dụng nhiều hơn khi Monsanto giới thiệu cây trồng kháng thuốc diệt cỏ glyphosate, tạo điều kiện cho nông dân tiêu diệt cỏ dại mà không... sinh vật trong đất 2.2 Chất diệt cỏ glyphosate 2.2.1 Cấu tạo và cơ chế hoạt động của glyphosate Glyphosate (N - (phosphonomethyl) glycin) là thuốc diệt cỏ phổ rộng hệ thống sử dụng để diệt cỏ dại, đặc biệt là các loại cỏ lá rộng hàng năm và cỏ để cạnh tranh với các cây trồng thương mại phát triển trên toàn cầu Thuốc diệt cỏ glyphosate được phát hiện là một loại thuốc diệt cỏ bởi nhà hóa học E John Franz... Simazine, Sofit Thuốc diệt cỏ hậu nảy mầm là loại thuốc được dùng muộn hơn, khi cỏ đã mọc, ở giai đoạn non Ví dụ các thuốc trừ cỏ Afalon, Whip S, Oneside, … Thuốc diệt cỏ hoà bản và thuốc diệt cỏ lá rộng: Thuốc diệt cỏ hoà bản chỉ có tác dụng diệt những cỏ họ hoà bản (lá hẹp, gân lá, song song như cỏ lồng vực, cỏ mần trầu, …) Thuốc diệt cỏ lá rộng là thuốc chỉ có tác dụng diệt được cỏ lá rộng bản, gân... cứu đã chỉ ra rằng, gen kháng glyphosate không có lợi thế khi không tiến hành phun glyphosate, vì vậy khả năng chuyển gen kháng glyphosate vào tự nhiên là khó xảy ra Một vấn đề cần lưu ý nữa là việc kiểm soát mức độ gen chuyển của cây trồng chuyển gen GR, cần phải duy trì sự hiện diện của gen chuyển tại một giới hạn quy định của thị trường, có thị trường đòi hỏi giới hạn chuyển gen thấp hoặc không... trừ cỏ Ground Up Gen này được vi khuẩn agrobacterium chủng CP4 chuyển vào cây trồng để tạo ra giống kháng thuốc trừ cỏ Ground Up, cây trồng mang gen này vẫn sống sót sau khi xịt thuốc trừ cỏ Ground Up Trên 90% giống đậu nành tại Mỹ hiện nay đều được chuyển gen kháng Ground Up Đến năm 2008, có 80 triệu ha kháng thuốc trừ cỏ mà chủ yếu kháng thuốc trừ cỏ Ground Up [36, 39] * Giống kháng thuốc trừ cỏ nhóm... thuốc diệt cỏ đang sử dụng Thuốc diệt cỏ tuỳ theo loại khác nhau có thể tác động đến cỏ dại theo nhiều cách khác nhau Người ta phân loại theo kiểu tác dộng của thuốc trừ cỏ như: Thuốc diệt cỏ có tác động chọn lọc và thuốc diệt cỏ có tác động không chọn lọc: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 5 Thuốc diệt cỏ có tác động chọn lọc có nghĩa là thuốc diệt cỏ khi... trừ cỏ, vô hiệu hóa các enzyme kích hoạt của thuốc trừ cỏ, ức chế tác động của thuốc trừ cỏ đối với các protein mục tiêu trong cây trồng, kích thích protein mục tiêu kháng lại thuốc trừ cỏ của cây trồng [26, 39] * Tình trạng cây trồng kháng thuốc diệt cỏ hiện nay Năm 2005, cây trồng kháng thuốc diệt cỏ chiếm diện tích trồng lớn nhất với trên 63,7 triệu ha trong tổng số 90 triệu ha tổng diện tích cây chuyển. .. Herosate Đây là loại thuốc diệt cỏ không chọn lọc dùng để diệt cỏ cho các loại cây trồng không làm đất (thường ở Đồng bằng sông Cửu Long) như đậu nành, đậu xanh, ngô Thuốc được dùng trước khi xuống giống 7-10 ngày để diệt những cây cỏ đã mọc sẵn trên ruộng, glyphosate diệt được hầu hết các loại cỏ trên ruộng, kể cả những loại cỏ khó diệt như cỏ cú, cỏ chỉ, cỏ lông tây, cỏ tranh, lúa mọc lẫn trên ruộng... thấy nếu không có thuốc diệt cỏ, dường như cây trồng kháng thuốc diệt cỏ chuyển gen không có khả năng lan sang các cánh đồng khác hay những môi trường sống tự nhiên so với cây trồng không chuyển gen [26] Cây trồng kháng thuốc diệt cỏ hiện có bán trên thị trường cho thấy rất ít bằng chứng về sự tồn tại lâu dài hay sự xâm lấn của cây chuyển gen đối với các loại cây trồng khác [26] Số hóa bởi Trung tâm Học... chuyển gen được trồng trên toàn cầu [14] Trong các giống cây trồng kháng thuốc diệt cỏ được phát triển thì giống kháng glyphosate và glufosinate chiếm ưu thế Bảng dưới đây cho thấy các nước đã chấp nhận các loại cây trồng kháng thuốc diệt cỏ dùng làm thực phẩm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 14 Bảng 2.1 Phân bố 1 số loại cây trồng chuyển gen kháng thuốc diệt . tiêu của đề tài Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate. 1.3. Nội dung nghiên cứu 1.3.1. Thiết kế vector chuyển gen - Xác định và. trình tự nucleotid gen EPSPS phù hợp biểu hiện trong thực vật. - Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen mang cấu trúc EPSPS mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate. - Chuyển cấu trúc EPSPS. HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THÀNH LUÂN THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN KHÁNG CHẤT DIỆT CỎ GLYPHOSATE Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60.42.014 LUẬN VĂN THẠC SĨ