ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN NGỌC THỦY TIÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY VIRUS CÚM A(H1N1) TRÊN TẾ BÀO MDCK BẰNG HỆ THỐNG VI HẠT Chuyên ngành: Di Truyền Học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. CAO THỊ BẢO VÂN Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2010 Lời cảm ơn Lôøi caûm ôn Em xin chân thành cảm ơn Cô TS. Cao Thị Bảo Vân đã tận tình quan tâm, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian em thực tập và làm luận văn tại Labo Sinh học phân tử – Khoa Vi sinh Miễn dịch, Viện Pasteur TpHCM. Em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô Phòng Đào tạo sau Đại học, Quý Thầy Cô trong bộ môn Di truyền – Khoa Sinh học Trường ĐH KHTN TpHCM, và Quý Thầy Cô giảng viên thỉnh giảng đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức bổ ích. Em xin chân thành cảm ơn Cô ThS. Kim Dung và anh Thương – Labo Kiểm định – đã tạo điều kiện về hóa chất, thiết bị và hỗ trợ kỹ thuật karyotyping cho em. Em xin chân thành cảm ơn Cô TS. Quế Hương và các anh chị thuộc Labo Arbovirus đã hỗ trợ em thiết bị chụp ảnh nhiễm sắc thể. Chân thành cảm ơn các chị, các bạn của Labo Sinh học Phân tử, nhất là bạn Nhi và bạn Chỉnh, đã cùng trao đổi, chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu và hỗ trợ, giúp đỡ Tiên trong suốt thời gian Tiên thực hiện luận văn và làm việc tại Phòng. Cảm ơn các anh chị và các bạn lớp CH Di truyền K16 cũng như các bạn Hương, Hiền, Ý lớp 00CNSH đã cùng Tiên học tập và động viên Tiên hoàn thành luận văn. … Me ohc sn6e9d me9d xa9d hna fam scuhp jhnah xgn7uhn fu6eihn jt6aht fav xem jhnam jc7ul jihgn, jc7ul jgn6o9d, jc7ul hnis fn6ougn n7o rmac! St6ahn jpus yus me ihk xgn7uhn me i7or rob gn6ohk fav, M6al Gn6on jn6eiv 7uht n6el me r7ohc hna fu6a9d fyagn xgn7uhn f7ut, auq m8an ab st6ous me n6eb n6oul xa9d hna n7o rmac! Me rauc gn7o7uht u6ey fgnuc 6ov F6ot, hna n7o rmac. Cuối cùng, những tình cảm thiêng liêng nhất con xin dành cho bố Dũng, mẹ Châu và chị hai Minh Anh – những người đã luôn dõi theo và kiên nhẫn ủng hộ mọi bước đường con đi… TpHCM, ngày 08 tháng 11 năm 2010 Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên Mục lục i Mục lục Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục i Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình ảnh vi Đặt vấn đề viii Phần 1. Tổng quan tài liệu 1.1. Công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào 1 1.1.1. Ưu điểm của công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào 1 1.1.2. Hệ thống nuôi cấy tế bào với giá thể vi hạt sử dụng trong sản xuất virus 3 1.2. Tế bào MDCK 6 1.2.1. Định nghĩa 6 1.2.2. Lịch sử phát triển dòng tế bào MDCK 6 1.2.3. Một số ứng dụng của tế bào MDCK 6 1.2.4. Ưu điểm của tế bào MDCK 7 1.2.5. Đặc điểm của tế bào MDCK 8 1.2.5.1. Đặc điểm hình thái 8 1.2.5.2. Đặc điểm di truyền 8 1.2.5.3. Đặc điểm sinh lý 8 1.2.6. Điều kiện nuôi cấy tế bào MDCK 9 1.3. Virus cúm A(H1N1) mới 2009 10 1.3.1. Sơ lược về virus cúm A 10 1.3.2. Virus cúm A(H1N1) mới 2009 12 1.3.2.1. Các đặc điểm của virus cúm A(H1N1) mới 2009 12 1.3.2.2. Tình hình dịch cúm A(H1N1) mới 2009 trên thế giới và tại Việt Nam 17 Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên Mục lục Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên ii Phần 2. Vật liệu – Phương pháp 2.1. Vật liệu 20 2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm 20 2.1.1.1. Hóa chất 20 2.1.1.2. Sinh phẩm 22 2.1.2. Dụng cụ 23 2.1.3. Thiết bị 24 2.2. Phương pháp 25 2.2.1. Kiểm tra sự hiện diện của mycoplasma trong dịch nuôi cấy tế bào 25 2.2.2. Xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào 25 2.2.3. Nuôi cấy tế bào và virus trên vi hạt Cytodex1 27 2.2.4. Định kiểu nhân (karyotyping) 29 2.2.5. Xác định hiệu giá virus bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu 31 2.2.6. Xác định hiệu giá virus bằng TCID 50 theo Reed – Muench (1938) 32 2.2.7. Xác định liều gây nhiễm MOI 34 Phần 3. Kết quả và biện luận 3.1. Xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong môi trường M0643 [5% CO 2 , 10%FBS] 36 3.2. So sánh hiệu quả nuôi cấy tế bào MDCK trong các môi trường khi thay đổi nồng độ FBS và CO 2 40 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ trypsin TPCK lên sự sống sót của tế bào MDCK 44 3.4. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho virus NIBRG-121xp-E1 48 3.5. Xác định liều xâm nhiễm tối ưu của virus NIBRG-121xp-E1 55 3.6. Khảo sát thời gian bám và tăng trưởng của tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1 61 3.7. Ứng dụng các điều kiện nuôi cấy thích hợp đã được khảo sát để nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng vi hạt Cytodex1 65 Mục lục Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên iii 3.8. Kiểm tra sự ổn định của tế bào MDCK sau nhiều đời cấy chuyền 68 Phần 4. Kết luận và đề nghị 4.1. Kết luận 75 4.1.1. Các điều kiện nuôi cấy tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1 75 4.1.2. Các điều kiện nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng vi hạt Cytodex1 75 4.1.3. Sự ổn định của tế bào MDCK sau nhiều đời cấy chuyền 76 4.1.4. Quy trình nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt. 76 4.2. Đề nghị 77 Các công trình đã công bố 78 Tài liệu tham khảo 79 Phụ lục 87 Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục chữ viết tắt ATCC : American Type Culture Collection (ngân hàng tế bào giống tại Hoa Kỳ) BHK : Baby Hamster Kidney (tế bào thận chuột con) BSA : Albumin from Bovine Serum (albumin từ huyết thanh bê) CDC : Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm Kiểm soát và Ngăn ngừa dịch bệnh) CPE : Cytopathetic Effect (hiệu ứng hủy hoại tế bào) DEAE : Diethylaminoethyl ECACC : The European Collection of Cell Cultures (ngân hàng tế bào châu Âu) EDTA : Ethylene-diamin-tera-acetic acid FBS : Fetal Bovine Serum (huyết thanh bào thai bê) HA : Haemagglutination Assay (phản ứng ngưng kết hồng cầu) MDCK : Madin – Darby Canine Kidney (tế bào thận chó Madin – Darby) MOI : Multiplicity Of Infection (liều xâm nhiễm) PBS : Phosphate Buffered Saline (muối đệm phosphate) PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại gene) TCID 50 : 50% The Tissue Culture Infectious Dose (liều xâm nhiễm của virus gây hủy hoại 50% số giếng tế bào) TPCK : L-tosylamino-2-phenylethyl chloromethyl keton Tolylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl keton Vero : Vervet Monkey Origin (African green monkey kidney) (tế bào thận khỉ xanh châu Phi) WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên Danh mục bảng v Danh mục bảng Trang Bảng 1.1. Một số loại vi hạt thương mại hiện hành 5 Bảng 1.2. Tóm tắt chức năng của các protein trong virus cúm A 11 Bảng 3.1. Nồng độ FBS và CO 2 dùng để so sánh hiệu quả nuôi cấy tế bào MDCK trong môi trường M0643 và M1018 40 Bảng 3.2. Các thông số về đặc điểm tăng trưởng của tế bào MDCK khi nuôi cấy trong các môi trường 43 Bảng 3.3. CPE và hiệu giá (HA và TCID 50 ) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy trên tế bào MDCK ở 37 o C và 35 o C 50 Bảng 3.4. Các liều xâm nhiễm (MOI) của virus NIBRG-121xp-E1 được dùng để khảo sát liều xâm nhiễm tối ưu 55 Bảng 3.5. CPE và hiệu giá (HA và TCID 50 ) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy trên tế bào MDCK trong các môi trường với các liều xâm nhiễm khác nhau 57 Bảng 3.6. Thể tích dịch virus NIBRG-121xp-E1dùng xâm nhiễm tế bào MDCK nuôi cấy trên vi hạt Cytodex1 65 Bảng 3.7. Hiệu giá (HA và TCID 50 ) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy bằng hệ thống vi hạt 66 Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên Danh mục hình ảnh vi Danh mục hình ảnh Trang Hình 1.1. Tế bào được nuôi cấy trên vi hạt Cytodex 4 Hình 1.2. Tế bào MDCK chụp dưới kính hiển vi điện tử (vật kính X10) 8 Hình 1.3. Virus cúm A: cấu trúc virus và 11 protein được mã hóa từ 8 mảnh RNA 11 Hình 1.4. Bộ gene tái tổ hợp của virus cúm A(H1N1) mới 2009 13 Hình 1.5. Hình thái của virus cúm A(H1N1) mới 2009 14 Hình 1.6. Chu trình xâm nhiễm của virus cúm A(H1N1) mới 2009 15 Hình 1.7. Tần suất xuất hiện của các phân type virus cúm trên thế giới từ ngày 19/4/2009 đến 14/8/2010 (WHO, 25/8/2010) 18 Hình 2.1. Tế bào được nhuộm bằng dung dịch trypan blue 21 Hình 2.2. Phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer 26 Hình 2.3. Mô hình đường cong tăng trưởng của tế bào 27 Hình 2.4. Nhân tế bào được nhuộm với dung dịch acid citric-tím tinh thể 29 Hình 2.5. Nguyên tắc của phản ứng ngưng kết hồng cầu 31 Hình 2.6. Phương pháp thực hiện phản ứng HA trên plate 96 giếng đáy chữ V (hoặc U) 32 Hình 2.7. Phương pháp thực hiện TCID 50 trên plate 96 giếng đáy bằng 34 Hình 3.1. Đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong môi trường M0643 [5% CO 2 , 10% FBS] 37 Hình 3.2. Sự tăng trưởng của tế bào MDCK qua 7 ngày nuôi cấy (theo thứ tự từ trên xuống dưới) trong các môi trường với nồng độ CO 2 và FBS khác nhau 39 Hình 3.3. Hiệu quả nuôi cấy tế bào MDCK của các môi trường khi thay đổi nồng độ FBS và CO 2 41 Hình 3.4. Đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong môi trường M1018 [0% CO 2 , 10% FBS] 43 Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên Danh mục hình ảnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên vii Hình 3.5. Sơ đồ phân bố các nồng độ trypsin TPCK trên plate 12 giếng 44 Hình 3.6. Ảnh hưởng của các nồng độ trypsin TPCK lên sự sống sót của tế bào MDCK trong môi trường M0643 (a) và M1018 (b) 47 Hình 3.7. Sơ đồ phân bố các bậc pha loãng virus NIBRG-121xp-E1 trên plate 6 giếng 49 Hình 3.8. CPE và hiệu giá (HA và TCID 50 ) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy trên tế bào MDCK ở 37 o C (a) và 35 o C (b) trong môi trường M0643 53 Hình 3.9. CPE và hiệu giá (HA và TCID 50 ) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy trên tế bào MDCK ở 37 o C (a) và 35 o C (b) trong môi trường M1018 54 Hình 3.10. CPE và hiệu giá (HA và TCID 50 ) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy trên tế bào MDCK trong môi trường M0643 với các liều xâm nhiễm khác nhau 59 Hình 3.11. CPE và hiệu giá (HA và TCID 50 ) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy trên tế bào MDCK trong môi trường M1018 với các liều xâm nhiễm khác nhau 60 Hình 3.12. Hệ thống bình khuấy dùng nuôi cấy tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1 61 Hình 3.13. Thời gian bám và tăng trưởng của tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1 với môi trường M0643 (a) và M1018 (b) 64 Hình 3.14. Kết quả nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt với môi trường M0643 (a) và M1018 (b) 67 Hình 3.15. Tần suất xuất hiện các bộ nhiễm sắc thể của tế bào MDCK nuôi cấy trong các môi trường 71 Hình 3.16. Kết quả định kiểu nhân và so sánh hình thái của tế bào MDCK sau nhiều đời cấy chuyền (đời P12+8 và P12+20) trong môi trường M0643 (a) và M1018 (b) 74 Hình 4.1. Sơ đồ quy trình nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt 76 Đặt vấn đề viii Đặt vấn đề Từ năm 1995, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã khuyến nghị sử dụng tế bào động vật thay thế dần trứng gà trong nuôi cấy virus cúm nhằm tạo ra được một lượng sinh khối lớn virus đảm bảo chất lượng với thời gian sản xuất ngắn nhất và giá thành hợp lý hơn. Trong số các dòng tế bào thường trực đã được kiểm tra, đánh giá thì MDCK (tế bào thận chó), Vero (tế bào thận khỉ xanh châu Phi) và PER.C6 (tế bào võng mạc phôi người) là 3 dòng tế bào đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn để có thể được dùng trong sản xuất virus cúm. Ngày nay, công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào MDCK đang được triển khai nghiên cứu ở nhiều quốc gia và được các hãng dược phẩm, hóa chất uy tín trên thế giới sử dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học, chẩn đoán dựa trên những ưu điểm vượt trội của tế bào MDCK và các hệ thống nuôi cấy với giá thể vi hạt (microcarrier). Với hệ thống vi hạt, việc nuôi cấy tế bào/virus không những có thể được tiến hành ở quy mô hàng ngàn lít mà nó còn cho phép kiểm tra toàn diện và tự động hóa nhiều khâu trong quy trình sản xuất nên góp phần nâng cao chất lượng của sản phẩm tế bào/virus được nuôi cấy. Tuy nhiên, so với hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào trong các bình lên men, công nghệ nuôi cấy tế bào/virus bằng hệ thống vi hạt hiện vẫn là 1 kỹ thuật còn khá mới mẻ ở Việt Nam và cũng chỉ được sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm. Các trận dịch cúm dường như luôn xảy ra trong suốt lịch sử loài người. Trong thế kỷ 20, thế giới đã có 3 thảm họa cúm (1918 – 1929; 1957 – 1958; 1968 – 1969) làm thiệt mạng hàng triệu người. Vào tháng 04/2009, dịch cúm đầu tiên của thế kỷ 21 do virus cúm A(H1N1) mới 2009 đã xuất phát từ Mexico, và chỉ sau 2 tháng, WHO đã công bố đại dịch mức 6 khi virus cúm H1N1/2009 đã lan rộng toàn cầu. Tính đến ngày 06/08/2010, đã có trên 214 quốc gia và vùng lãnh thổ xác nhận có trường hợp nhiễm virus cúm H1N1/2009 với số ca mắc lên đến hàng trăm ngàn người và 18449 người tử vong. Theo báo cáo của Bộ Y tế, đến ngày 20/03/2010, Việt Nam đã xác định được 11202 trường hợp dương tính với virus cúm A(H1N1) mới 2009 tại Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên [...]... Phần 1 1.1 Công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào 1.2 Tế bào MDCK 1.3 Virus cúm A(H1N1) mới 2009 1 Tổng quan tài liệu 1 1.1 Công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào 1.1.1 Ưu điểm của công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào Từ hơn 50 năm qua, hầu hết sinh khối virus cúm đã và vẫn đang được sản xuất trên trứng gà có phôi [14], [42], [44], [46], [57] Tuy nhiên, từ năm 1995, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO)... trong bình nuôi cấy [66] Hình 1.1 Tế bào được nuôi cấy trên vi hạt Cytodex [66] Hệ thống nuôi cấy tế bào với giá thể vi hạt có nhiều lợi thế so với các hệ thống nuôi cấy quy mô lớn khác, bao gồm: • Cung cấp diện tích bề mặt nuôi cấy lớn trong 1 thể tích/diện tích nuôi cấy nhỏ và có thể gia tăng diện tích bề mặt nuôi cấy bằng cách gia tăng nồng độ vi hạt, nhờ đó mà mật độ tế bào nuôi cấy được gia tăng... đây, vi c phát triển các chế phẩm sinh học chứa virus cúm bất hoạt có nguồn gốc từ sản phẩm virus được nuôi cấy trên tế bào MDCK hoặc Vero đã gặt hái được nhiều tiến bộ đáng kể với các hệ thống nuôi cấy tế bào bằng chai xoay hay các bình khuấy dung tích lớn sử dụng giá thể vi hạt [18], [57] 1.1.2 Hệ thống nuôi cấy tế bào với giá thể vi hạt sử dụng trong sản xuất virus Cho đến nay, các dòng tế bào cần... 60 người Trong nghiên cứu này, chúng tôi bước đầu xây dựng quy trình nuôi cấy virus cúm A(H1N1) chủng NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt sử dụng tế bào MDCK và vi hạt Cytodex1 Vì virus NIBRG-121xp-E1 là 1 chủng virus mới với các khảo sát ban đầu cho thấy chủng virus này nhân lên rất yếu ngay cả trên trứng gà, và hệ thống vi hạt là 1 phương pháp nuôi cấy mới; do đó, chúng tôi lần lượt tiến hành các... điều kiện nuôi cấy cho tế bào MDCK và chủng virus NIBRG-121xp-E1 Điều này có ý nghĩa hết sức quan trọng vì đây là cơ sở để có thể đưa quy trình nuôi cấy này từ quy mô phòng thí nghiệm ra sản xuất lớn Mục tiêu của đề tài • Chuẩn hóa các điều kiện nuôi cấy tế bào MDCK nhằm nâng số lượng tế bào lên tối đa • Thích ứng và chuẩn hóa các điều kiện nuôi cấy chủng virus NIBRG-121xpE1 trên tế bào MDCK • Áp dụng... chủng virus cúm gia cầm không thể tăng sinh trên trứng gà nếu không được biến đổi di truyền nhưng lại có thể tăng sinh trên tế bào, nhờ vậy vi c nuôi cấy các chủng virus này trên tế bào cho phép sản xuất được các chế phẩm sinh học đối với các chủng virus nói trên [47] Tế bào lưỡng bội tiên phát (primary diploid cell) và tế bào thường trực (continuous cell) là hai loại tế bào thường được dùng để nuôi cấy. .. đáp ứng nhanh hơn, tức thời hơn và nguồn tế bào không bị giới hạn [14], [42], [46] • Quy trình nuôi cấy virus cúm trên trứng gà đòi hỏi nhiều nhân công và hiệu suất của phương pháp này tương đối thấp [42], [57] Trong khi đó, hệ thống nuôi cấy virus cúm trên tế bào có thể giảm 40% chi phí nhân công và hiệu suất được cải thiện gấp 3 lần so với nuôi cấy virus trên trứng [46] • Chất lượng thay đổi của... Cellulose Một số loại vi hạt thương mại hiện hành được liệt kê ở Bảng 1.1 Vi c lựa chọn loại vi hạt thích hợp để sử dụng phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy và hình thái của tế bào Ví dụ như để nuôi cấy virus và thu nhận các sản phẩm từ tế bào thì vi hạt dextran là tốt nhất; nếu tế bào cần được làm bong khỏi bề mặt nuôi cấy thì vi hạt gelatin hay thủy tinh là lựa chọn ưu tiên; nếu tế bào có khả năng bám... mà tế bào MDCK cũng có thể được biến đổi để thích ứng với dạng nuôi cấy huyền phù tế bào [70] Tế bào MDCK thể hiện dương tính với keratin khi được nhuộm bằng thuốc nhuộm immunoperoxidase [71] và phép phân tích bằng huỳnh quang miễn dịch giúp khẳng định tế bào MDCK có nguồn gốc từ thận chó [73] Tế bào MDCK thích hợp cho sự tăng trưởng của một phổ rộng các virus động vật như: virus cúm type A và B, virus. .. sản phẩm từ nuôi cấy trên tế bào cũng gia tăng • Quá trình nuôi cấy tế bào được tiến hành trên 1 hệ thống năng suất cao thay cho vi c dùng nhiều chai nuôi cấy năng suất thấp, nhờ đó mà môi trường nuôi cấy được sử dụng hiệu quả và tiết kiệm hơn • Dễ dàng theo dõi và kiểm soát được các điều kiện nuôi cấy như pH, nồng độ O2, CO2,… do môi trường nuôi cấy luôn được khuấy đều • Dễ dàng lấy mẫu tế bào • Dễ dàng