ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ QUANG THƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG CHÈ ĐẶC SẢN TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG KĨ THUẬT SSR LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ QUANG THƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG CHÈ ĐẶC SẢN TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG KĨ THUẬT SSR Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. HOÀNG THỊ THU YẾN THÁI NGUYÊN - 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Lê Quang Thƣơng ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Thị Thu Yến - Giảng viên Khoa Khoa học Sự sống - Trƣờng Đại học Khoa học - ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô và tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Khoa học Sự sống, cảm ơn lãnh đạo Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn tới các cán bộ công tác tại Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ, Công ty chè Sông Cầu - Huyện Đồng Hỷ - Thành Phố Thái Nguyên, nhân dân vùng chè Trại Cài - Minh Lập - Đồng Hỷ và Vùng chè Tân Cƣơng - Thành Phố Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp và nhóm nghiên cứu di truyền đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tác giả Lê Quang Thƣơng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Cây chè 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây chè 3 1.1.2. Đặc điểm di truyền của cây chè 4 1.1.3. Tình hình sản xuất chè trên thế giới và ở Việt Nam 5 1.1.4. Đặc điểm một số dòng chè trồng tại Thái Nguyên 9 1.2. Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè ở Việt Nam và thế giới 13 1.2.1. Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè trên thế giới 13 1.2.2. Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè ở Việ t Nam 15 1.3. Một số phƣơng pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu tính đa dạng genome sinh vật 17 1.3.1. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms - đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn) 17 1.3.2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - đa hình độ dài các đoạn đƣợc nhân bản chọn lọc) 18 1.3.3. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 18 1.3.4. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giản) 19 iv Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Vật liệu nghiên cứu 22 2.1.1. Nguyên liệu 22 2.1.2. Hóa chất 22 2.1.3. Thiết bị 23 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.2.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu lá chè 23 2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 23 2.2.3. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose 25 2.2.4. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và kiểm tra độ tinh sạch DNA tổng số 26 2.2.5. Phƣơng pháp PCR - SSR 26 2.2.6. Phân tích số liệu 28 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1. Tách chiết DNA tổng số từ lá chè 29 3.2. Phân tích chỉ thị SSR ở các mẫu chè nghiên cứu 31 3.3. Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu chè nghiên cứu dựa trên phân tích PCR - SSR 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 53 v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh bp Cặp base base pair đtg Cộng sự et al DNA Axit Deoxynucleic Deoxyribonucleic acid EDTA EDTA Ethyen Diamin Tetraacetic Acid kb Kilo base Kilobase = 1000 bp PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction RNA Axit Ribonucleic Ribonucleic Acid TAE TAE Tris acetat EDTA VNTR VNTR Variable Number of Tandem Repeat RAPD DNA đa hình đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên Random Amplify Polymorphism DNA Primer F Mồi xuôi Primer Forward Primer R Mồi ngƣợc Primer Reverse SSR Trình tự lặp lại đơn giản Simple Sequence Repeat AFLP Đa hình độ dài các đoạn đƣợc nhân bản chọn lọc Amplified Fragment Length Polymorphism RFLP Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn Restriction Fragment Length Polymorphism EtBr EtBr Ethidium Bromide dNTP dNTP Deoxynucleoside triphosphate PIC PIC Polymorphism Information Content vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Sản lƣợng chè một số nƣớc trên thế gới 6 Bảng 1.2. Khối lƣợng xuất khẩu chè của một số nƣớc xuất khẩu chính giai đoạn 2006-2010 7 Bảng 1.3. Diện tích, sản lƣợng, xuất khẩu chè Việt Nam 9 Bảng 1.4. Cơ cấu giống chè tỉnh Thái Nguyên giai đoạn 2001 - 2010 10 Bảng 2.1. Danh sách tên và đị a điể m thu mẫu của 25 mẫu chè nghiên cứu 22 Bảng 2.2. Danh mụ c các thiết bị, dụng cụ đƣợc sử dụng 23 Bảng 2.3. Danh sách 9 cặp mồi SSR đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 27 Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR - SSR 28 Bảng 2.5. Chu trì nh nhiệ t của phả n ƣ́ ng PCR - SSR 28 Bảng 3.1. Phổ hấp thụ DNA ở bƣớc sóng 260nm và 280nm và nồng độ DNA tổng số của 25 mẫu chè 30 Bảng 3.2. Tổng số phân đoạn DNA của sản phẩm PCR - SSR với 9 cặp mồi 32 Bảng 3.3. Số phân đoạn DNA xuất hiện và số phân đoạn DNA đa hình đối với mỗi mồi 33 Bảng 3.4. Bảng hệ số tƣơng đồng di truyền của 25 mẫu chè nghiên cứu 42 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh một số giống chè đặc sản trồng tại Thái Nguyên 10 Hình 1.2. Đa hình DNA SSR giữa 2 cá thể có motif (AT) n 21 Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 0.8% của 25 mẫu chè nghiên cứu 29 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm SSR của 25 mẫu chè với mồi YS28 34 Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS64 35 Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS27 36 Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS98 37 Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS83 37 Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR - SSR với mồi YTS104 38 Hình 3.8. Điện di sản phẩm PCR - SSR với mồi YS3 39 Hình 3.9. Sơ đồ quan hệ di truyền của 25 mẫu chè nghiên cứu 44 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cây chè (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) thuộc họ chè Theaceae là loại cây trồng lƣu niên có thời gian thu lợi kinh tế kéo dài đến hơn 60 năm. Sản xuất và chế biến chè đã trở thành một trong những ngành kinh tế nông nghiệp quan trọng ở nhiều quốc gia với sản phẩm tạo ra có giá trị xuất khẩu cao. Chè (trà) không chỉ là thức uống giải khát hàng ngày mà còn là một nét văn hóa đặc trƣng, một thứ nghệ thuật (Trà đạo) của ngƣời dân châu Á. Từ những kinh nghiệm dân gian cho đến các nghiên cứu khoa học gần đây đã khẳng định giá trị của cây chè đối với sức khỏe. Ở Việt Nam, phát triển cây chè là một trong 10 chƣơng trì nh trọ ng điể m về phát triển nông nghiệp nông thôn, nƣớ c ta có mộ t số vù ng trồ ng chè lớ n nhƣ : vùng chè Tây Bắc, vùng chè Việt Bắc, vùng chè trung du Bắc Bộ, vùng chè Bắc Trung Bộ , vùng chè Tây Nguyên… [13]. Theo thống kê Việt Nam hiện có khoảng 120 giống chè, bên cạnh các giống chè lai có năng suất cao đang đƣợc trồng phổ biến ở nhiều vùng trong cả nƣớc thì, các giống chè địa phƣơng tuy năng suất không cao nhƣng lại có chất lƣợng tốt, đƣợc coi là đặc sản. Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống cây trồng nói chung và cây chè nói riêng nhƣ RADP, RFLP, AFLP, SSR,… Các phƣơng pháp này đã khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của các phƣơng pháp chọn giống truyền thống bởi đánh giá đƣợc hệ gen của cây trồng. Trong những năm gần đây, diện tích trồng các giống chè địa phƣơng có xu hƣớng giảm, nhiều giống chè quí hiếm sẽ bị mất dần. Nhƣ vậy, việc tìm hiểu và nghiên cứu các giống chè đặc sản của địa phƣơng sẽ góp phần bảo tồn nguồn gen cây chè là rất cần thiết. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA là cơ sở khoa học để đề xuất việc lựa chọn những giống chè có năng suất cao, chất lƣợng tốt, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen. Từ đó tuyển chọn giống chè đặc sản [...]... chọn giống là những vấn đề rất đƣợc quan tâm nghiên cứu Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền một số giống chè đặc sản trồng tại Thái Nguyên bằng kĩ thuật SSR 2 Mục tiêu nghiên cứu Phân tích đƣợc chỉ thị SSR ở các mẫu chè nghiên cứu của một số giống chè đặc sản địa phƣơng Xác định đƣợc khoảng cách di truyền của một số giống chè đặc sản. .. đƣợc trồng ở Thái Nguyên 3 Nội dung nghiên cứu - Thu thập các giống chè đƣợc đánh giá có chất lƣợng tốt và là đặc sản đƣợc trồng tại một số vùng trồng chè ở Thái Nguyên - Thực hiện kỹ thuật PCR - SSR với 9 cặp mồi để đánh giá sự đa dạng trong trình tự genome của chè - Sử dụng phần mềm sinh học phân tử NTSYS version 2.0 để phân tích kết quả của PCR - SSR và chỉ ra đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các giống. .. 100% số phân đoạn đều đa hình [6] Nguyễn Hữu La và đtg (2004) đã sử dụng 10 mồi RAPD trong nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền một số giống chè Shan ở Phú Hộ, Phú Thọ [9] Năm 2009, Trần Đức Trung đã kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị SSR nhằm đánh giá sự đa dạng di truyền các giống chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) ở Việt Nam Kết quả ghi nhận đƣợc sự đa dạng di truyền ở mức độ cao giữa các giống. .. Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, chỉ thị SSR đƣợc sử dụng rất phổ biến Tuy nhiên cho tới nay, số lƣợng chỉ thị SSR đặc hiệu cho cây chè còn rất ít, do đó các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị SSR trong phân tích di truyền hỗ trợ công tác chọn giống chè còn khiêm tốn Sự đa dạng di truyền sẽ chỉ ra đƣợc mức độ sai khác giữa các giống chè nghiên cứu ở mức độ phân tử, đồng thời giải thích đƣợc tính đa dạng. .. thị SSR trong nghiên cứu chọn giống các loại cây trồng 22 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu Lá của 25 mẫu chè đặc sản đang đƣợc trồng tại Thái Nguyên đƣợc thu hái làm nguyên liệu nghiên cứu Danh sách tên và đị a điêm lây mâu của các ̉ ́ ̃ mẫu lá chè nghiên cứu đƣợc trình bày ở bảng 2.1 Bảng 2.1 Danh sách tên và đị a điêm thu mâu của 25 mẫu chè nghiên. .. lƣợng chè và phấn đấu giá chè xuất khẩu bằng với giá bình quân của thế giới 1.1.4 Đặc điểm một số dòng chè trồng tại Thái Nguyên Thái Nguyên là một tỉnh Trung du miền núi, địa hình chủ yếu là đồi bát úp, có độ dốc không lớn [7] Với dạng địa hình này Thái Nguyên rất thuận lợi cho việc phát triển sản xuất chè Những năm gần đây, Thái Nguyên đã chú trọng đến việc chọn lựa, xây dựng cơ cấu giống chè phù... gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền [1] Kỹ thuật RAPD còn dùng để nhận biết, phân loại các giống cây trồng khác nhau nhƣ chè, chuối, lúa mì, đu đủ, đậu tƣơng và phát hiện, bảo tồn sự đa dạng di truyền đặc biệt là các loài quí hiếm hay một số giống thực vật địa phƣơng 1.3.4 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giản) Kỹ thuật SSR còn đƣợc gọi là kỹ thuật microsatellies... và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, xây dựng bản đồ liên kết, phân lập gen, xác định quan hệ di truyền giữa các giống, dòng cây trồng Trong những năm gần đây phƣơng hƣớng sản xuất chè ở nƣớc ta là phát triển di n tích trồng chè, nâng cao năng suất nhƣng phải đảm bảo chất lƣợng chè, phấn đấu giá chè xuất khẩu bằng giá bình quân của thế giới Tuy nhiên trong thực tế sản xuất chè, Việt Nam vẫn... dụng một số cặp mồi SSR thiết kế cho cây chè hoa Camellia japonica để nhận dạng di truyền các giống chè bản địa, phục vụ yêu cầu dán nhãn các sản phẩm chè lƣu hành trên thị trƣờng Nhật Bản [40] Chỉ thị AFLP lần đầu tiên đƣợc áp dụng với cây chè Kết quả nghiên cứu với 32 giống chè Kenya cho thấy sự phân nhóm của ba thứ chè Assam, Trung Quốc và Cambod, trong đó quần thể chè Trung Quốc có mức độ đa dạng di. .. đặc sản trồng tại Thái Nguyên Hiện nay 60% di n tích trồng chè ở Thái Nguyên là giống Trung du Giống chè Trung du (hay còn gọi là chè ta) có đặc điểm búp nhỏ nên năng 11 suất không cao Nhƣng nếu biết cách chế biến, chè Trung du sẽ cho ra sản phẩm có chất lƣợng cao hơn hẳn các loại chè đƣợc làm từ các giống khác, để chế biến loại chè thƣợng hạng tôm nõn thì nhất thiết nên dùng búp chè Trung du Chè Trung . ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ QUANG THƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG CHÈ ĐẶC SẢN TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG KĨ THUẬT SSR . tâm nghiên cứu. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền một số giống chè đặc sản trồng tại Thái Nguyên bằng kĩ thuật SSR . 2 THÁI NGUYÊN - 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ QUANG THƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG CHÈ ĐẶC SẢN TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN