BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HỒ THỊ HỒNG MY XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AXIT BENZOIC VÀ AXIT SORBIC TRONG CÁC LOẠI THỰC PHẨM ĐÓNG GÓI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH MÃ SỐ: 60440118 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS NGÔ VĂN TỨ Huế, Năm 2014 2 MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển dân số, kinh tế, xã hội, khoa học và công nghệ đòi hỏi các mặt hàng thực phẩm phải ngày càng dồi dào và phong phú về số lượng, chất lượng, cũng như chủng loại và thời gian sử dụng. Để đáp ứng nhu cầu đó trong quá trình chế biến thực phẩm các nhà sản xuất thường thêm các chất phụ gia vào thực phẩm nhằm cải thiện chúng. Phụ gia thực phẩm là những chất không được coi là thực phẩm hoặc một thành phần của thực phẩm, chúng có ít hoặc không có giá trị dinh dưỡng, được chủ động cho vào với mục đích đáp ứng yêu cầu công nghệ trong quá trình sản xuất,chế biến, xử lí, bao gói, vận chuyển, bảo quản. [2] Trong đó khâu bảo quản thực phẩm không kém phần quan trọng. Có nhiều cách để bảo quản thực phẩm như phơi, sấy khô, làm lạnh, đóng gói, muối, ngâm tẩm hóa chất. Mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng, trong đó việc sử dụng hóa chất bảo quản là một biện pháp hiện đại, tiện ích, nếu sử dụng đúng liều lượng, giúp bảo quản, làm chậm hư thối, giữ được phẩm chất và vẻ hấp dẫn của thực phẩm, đồ uống, trái cây đóng hộp, bánh mì vv. Trong nhóm chất bảo quản có axit benzoic và axit sorbic được sử dụng nhiều trong thực phẩm nhằm mục đích ức chế sự phát triển của nấm men, nấm mốc gây hư hỏng thực phẩm. Vì lượng nhỏ axit benzoic và axit sorbic trên nền hữu cơ là khó phân tích xác định. Do đó phải lựa chọn phương pháp phân tích hữu hiệu nhất. Có thể phân tích hai axit này bằng nhiều phương pháp khác nhau như quang phổ uv-vis, sắc kí khối phổ, sắc kí lỏng hiệu năng cao… các phương pháp này cho độ nhạy, độ chính xác cao, nên những phương pháp nầy đã được áp dụng để xác định những thành phần riêng lẽ của các chất. Tuy nhiên, cho đến nay việc xác định đồng thời hai axit này trong cùng một đối tượng mẫu chưa được nghiên cứu. Để góp phần phục vụ công tác kiểm tra an toàn thực phẩm, đồng thời tiết kiệm chi phí, rút ngắn thời gian phân tích, chúng tôi chọn đề tài: “ Xác định đồng thời axit benzoic và axit sorbic trong các loại thực phẩm đóng gói bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu : 3 - Xây dựng được qui trình phân tích đồng thời axit benzoic và axit sorbic trong một số thực phẩm đóng gói. - Áp dụng qui trình phân tích vào thực tế kiểm tra một số thực phẩm đóng gói đang được sử dụng rộng rãi. Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Chất bảo quản 1.1.1 Định nghĩa về chất bảo quản 1.1.1 Định nghĩa về chất bảo quả n 1.1.2 Phân loại chất bảo quản 1.1.3 Giới hạn cho phép sử dụng một số chất bảo quản trong thực phẩm 1.1.4 Tác động bất lợi về việc sử dụng chất bảo quản 1.2 Tổng quan về axit benzoic và axit sorbic 1.2.1 Axit benzoic 1 .2.2 Hoạt tính chống vi sinh của axit benzoic 1.2.3 Độc tính của axit benzoic 1.2.4 Axit sorbic 1.2.5 Hoạt tính chống vi sinh của axit sorbic 1.2. 6 Độc tính Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu Mục đích của luận văn là nghiên cứu xác định đồng thời axit benzoic và axit sorbic trong thực phẩm đóng bằng phương pháp HPLC dùng detector DAD. Những nội dung nghiên cứu cụ thể như sau: 1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng để tìm điều kiện thích hợp cho phép xác định đồng thời hỗn hợp các chất nêu trên bằng phương pháp HPLC dùng detector UV: + Xác định bước sóng phát hiện. + Khảo sát tốc độ dòng pha động. + Khảo sát ảnh hưởng độ phân cực của pha động. 2. Khảo sát các điều kiện thủy phân 4 + Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân + Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp khi phân tích đồng thời các chất thông qua độ ổn định, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ). 4. Xây dựng qui trình phân tích và áp dụng vào thực tế: + Xây dựng qui trình phân tích + Kiểm soát chất lượng qui trình phân tích thông qua độ đúng và độ lặp lại + Áp dụng qui trình đã xây dựng được để phân tích một số thực phẩm đóng gói đang lưu hành trên địa bàn thành phố Huế. 2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.2.1 Thiết và dụng cụ 2.2.2 Hóa chất 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu Chọn ngẫu nhiên các mẫu thực phẩm đóng gói trên thị trường Thừa Thiên Huế, bảo quản theo qui định nhãn sản phẩm. Tiến hành xử lí theo quy trình thích hợp trước khi phân tích [9]. 2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời axit benzoic và axit sorbic. 1. Chuẩn bị dung dịch chạy HPLC Quá trình phân tích mẫu được tiến hành trên máy HPLC cột pha đảo C18, với hệ dung môi pha động phân cực, do vậy mẫu phân tích và mẫu chuẩn phải được hòa tan trong nước, dung dịch được lọc qua màng 0,45 µm 2. Khảo sát bước sóng phát hiện Dựa vào tài liệu tham khảo [14], chúng tôi tiến hành khảo sát mẫu chuẩn trên máy HPLC với cột C18, thể tích tiêm 20 µL, detector UV cho phép lựa chọn và xác định λ max của các chất phân tích trên cùng một thí nghiệm. 3. Khảo sát ảnh hưởng của pha động Mục tiêu của khảo sát là tìm ra hệ pha động thích hợp nhất có khả năng tách pic của hai axit benzoic và axit sorbic tốt hơn so với các pic liền kề. 5 4. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng Dựa vào trọng lượng phân tử, cấu trúc hóa học, tính chất hòa tan, tính phân cực của axit benzoic và axit sorbic, kết hợp với việc tham khảo tài liệu của hai hoạt chất trên, chúng tôi sử dụng kỹ thuật sắc ký pha đảo, kỹ thuật này tỏ ra khá hữu hiệu trong việc phân tích axit benzoic và axit sorbic. 5. Khảo sát các điều kiện thủy phân Tiến hành thủy phân mẫu trong môi trường kiềm, để lựa chọn nhiệt độ và thời gian tốt nhất cho quá trình thủy phân vì hai yếu tố này ảnh hưởng nhiều nhất đến kết quả phân tích [15]. 2.3.3 Tính tương thích của hệ thống sắc kí 2.3.4 Thẩm định phương pháp Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp định lượng hai thành phần. 3.1.1. Khảo sát bước sóng phát hiện + Axit benzoic hấp thụ cực đại ở bước sóng từ 210 ÷ 265 nm + Axit sorbic hấp thụ cực đại ở bước sóng từ 235 ÷ 274 nm Ở bước sóng 230 nm cả hai chất đều hấp thụ tốt. Do vậy, chúng tôi chọn bước sóng 230 nm là bước sóng để khảo sát đồng thời hai axit. Hình 3.1: Phổ UV – Vis của axit benzoic và axit sorbic 6 3.1.2. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ dòng tới quá trình tách Pha động lựa chọn là hỗn hợp: kali hyđrophosphat : methanol, với thời gian phân tích cho mỗi lần chạy 21 phút, các thành phần được tách hoàn toàn, phân giải rõ rệt. Bảng 3.1. Kết quả trung bình của thời gian lưu, hệ số đối xứngvà độ phân giải của quá trình tách hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic (n = 6) Thời gian lưu t R (phút) Hệ số đối xứng - S a Độ phân giải axit benzoic axit sorbic axit benzoic axit sorbic 13,277 (SD = 0,012) 19,978 (SD = 0,015) 1,012 (SD = 0,011) 1,233 (SD = 0,019) 10,231 (SD = 0,021) Từ kết quả ở hình 3.1 và bảng 3.1, chương trình sắc ký đã khảo sát cho phép tách hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic hoàn toàn riêng lẻ. Tuy nhiên thời gian phân tích quá dài (t R2 = 19,978 >10 phút) , do đó chúng tôi chọn 2 hướng khắc phục nhược điểm trên là thay đổi tốc độ dòng và độ phân cực của pha động (tỉ lệ pha động). Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ dòng tới quá trình tách (a) (b) 7 (c) Hình 3.2 SKĐ của Hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic ở tốc độ dòng 1,8ml/phút, (b) 1,5ml/phút, (c) 1,0ml/phút Bảng 3.2. Giá trị trung bình các thông số cơ bản của quá trình tách hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic ở tốc độ dòng khác nhau (n=6) Tốc độ dòng ml/phút Các thông số 1,0 1,5 1,8 Thời gian lưu t R1 Thời gian lưu t R2 Hệ số đối xứng S a1 Hệ số đối xứng S a2 Độ phân giải R 10,688 13,277 1,168 1,245 11,94 6,211 6,981 1,201 1,142 10,15 4,112 5,124 1,125 1,127 9,54 Hình 3.5: Sự phụ thuộc thời gian lưu của axit sorbic (◊) và độ phân giải (■) vào tốc độ dòng 8 * Nhận xét: Kết quả các thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ dòng tới quá trình tách được trình bày ở hình 3.2; 3.3; 3.4; 3.5 bảng 3.2 Tốc độ dòng tăng làm cho tốc độ di chuyển của phân tử qua cột sắc ký tăng, sắc ký đồ gọn và cân đối hơn, hệ số đối xứng của các pic giảm, tuy nhiên khả năng cải thiện tính đối xứng của các pic vẫn còn hạn chế (> 1,00). Chúng tôi chọn tốc độ dòng 1,5ml/phút để khảo sát ảnh hưởng độ phân cực của pha động tới quá trình tách hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic. 3.1.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng độ phân cực của pha động tới quá trình tách Khảo sát các tỷ lệ pha động: Tiến hành thử các tỷ lệ pha động kali hyđrophosphat: methanol [50:50], [70:30], [90:10]. Tốc độ dòng duy trì 1,5ml/phút. (a) (b) (c) Hình 3.6. SKĐ hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic với tỷ lệ pha động (a)[50:50], (b)[70:30], (c) [90:10]. 9 Bảng 3.3. Gía trị trung bình các thông số cơ bản của quá trình tách hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic ở tỷ lệ pha động khác nhau (n=6) Pha động [A:B] Các thông số [90:10] [70:30] [50:50] Thời gian lưu t R1 Thời gian lưu t R2 Hệ số đối xứng S a1 Hệ số đối xứng S a2 Độ phân giải R 7,491 10,690 1,245 1,134 11,12 5,970 8,271 1,132 1,152 10,87 5,031 5,701 1,125 1,285 9,35 Hình 3.9. Sự phụ thuộc thời gian lưu của axit sorbic (◊) và độ phân giải (■) vào độ phân cực của pha động 3.2. Khảo sát các điều kiện thủy phân Trong đề tài nghiên cứu này,chúng tôi sử dụng phương pháp thủy phân bằng kiềm. Trong quá trình thủy phân, yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến kết quả của mẫu phân tích là nhiệt độ thủy phân và thời gian thủy phân 3.2.1 Khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình thủy phân Tiến hành khảo sát:để khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic chúng tôi khảo sát một dãy mẫu với nồng độ hỗn hợp chuẩn benzoic và axit sorbic và thêm 25 ml dung dịch NaOH 0,1N, và mẫu nước giải khát 10 [...]... chất với diện tích pic của chúng nằm trong khoảng với + R 2 benzoic = 0,9994 + R 2 Sorbic = 1 22 - Phương pháp có độ lặp lại tốt có sai số tương đối RSD% nhỏ ( n = 5) + axit benzoic : 1,62 % + axit sorbic : 1,26 % - Phương pháp có độ đúng cao, đáng tin cậy : + axit benzoic : 97,10% - 102,47 % + axit sorbic : 96,83% - 100,12 % Kết quả khảo sát càng khẳng định phương pháp định lượng đã xây dựng là đáng... tương ớt hai) thực phẩm 712,43 263,48 Đạt chin su Việt Tiến Cơ sở sản 5 Mẫu tương ớt Khô xuất Lưu 1164,23 Lưu Hương ng Hương - Huế Cơ sở sản 200 6 Mẫu mắm tôm xuất Cô Ri (axit Đạt Cô Ri Huế benzoic) Nhận xét: Chúng tôi đã hoàn thành việc xây dựng phương pháp định lượng đồng thời axit benzoic – axit sorbic trong sản phẩm thực phẩm đóng gói bằng phương pháp HPLC và đánh giá phương pháp... = 230 nm hay λ = 227 nm, 2 Xây dựng được phương pháp định lượng đồng thời hai hoạt chất axit benzoic – axit sorbic trong một số sản phẩm thực phẩm đóng gói đối với mẫu dạng rắn và mẫu dạng lỏng - Thời gian phân tích ngắn từ 1 đến 9 phút - Khoảng tuyến tính đủ rộng cho phép định lượng với nồng độ bất kỳ các chất cần khảo sát nằm trong khoảng tuyến tính - Các phương trình hồi qui được thiết lập cho... đến 1000C độ thu hồi đạt được cao nhất, nên chúng tôi chọn 700C làm nhiệt độ thủy phân mẫu 3.2.2 Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến quá trình thủy phân Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân của hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic, chúng tôi khảo sát một dãy mẫu với nồng độ hỗn hợp chuẩn benzoic và axit sorbic và thêm 25 ml dung dịch NaOH 0,1N và mẫu nước giải khát được thêm... rộng từ 1,00 µg/ml đến 100,00 µg/ml, cả hai chất đều cho ra phương trình hồi qui với r2 gần bằng 1 21 KẾT LUẬN Chúng tôi đã hoàn thành mục tiêu đặt ra của đề tài này: 1.Tìm điều kiện sắc ký phù hợp, ổn định để định lượng đồng thời cả hai hoạt chất axit benzoic – axit sorbic trong một số sản phẩm thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Máy HPLC - Cột pha đảo RP18 (150 × 4,6 mm ; 3µm ) - Dung... là nồng độ chất phân tích) thì đạt yêu cầu + Đối với phép phân tích axit benzoic: 50 RSD(%) = 1,26% ≤ 1 1 (1−0,5 lg109 ) = 4,44% RSDH = 2 2 2 + Đối với phép phân tích axit sorbic: 50 RSD(%) = 1,62% ≤ 1 1 (1−0,5 lg109 ) = 4,44% RSDH = 2 2 2 3.3.5 Xác định độ đúng của phương pháp Tiến hành thêm chính xác một lượng axit benzoic – axit sorbic chuẩn vào mẫu thử Tỷ lệ thêm 80 (µg/mL) ; 100 (µg/ml) ; 120 (µg/ml)... Hình 3.14 Đường chuẩn của axit benzoic (a), axit sorbic (b) 15 + Nhận xét: Qua các phương trình tuyến tính của từng chất chúng tôi nhận thấy có mối tương quan tuyến tính rất chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích píc tương ứng thu được trên sắc ký đồ, khoảng phân tích rộng nồng độ từ 0,25 µg/ml đến 200 µg/ml, hệ số tương quan r2 = 0,9997 đối với axit benzoic và r2 = 1 đối với axit sorbic 3.3.3 Xác định giới... 13.138 Y = 64.115x -2 Axit 0.5 29.015 R=1 sorbic 1.0 61.119 Sy = 49,62 2.0 125.283 LOD = 2,3 µg/mL Phương pháp đạt LOD khá thấp (2,3µg/ml cho mỗi hoạt chất) 2 Giới hạn định lượng Giới hạn định lượng LOQ = (3 - 4).LOD Giới hạn định lượng của axit benzoic: LOQ = 3* 2,3 = 6,9 µg/mL Tương tự giới hạn định lượng của axit sorbic: LOQ = 3* 2,3 = 6,9 µg/mL 16 3.3.4 Xác định độ lặp lại của phương pháp Tiến hành... kiểm tra độ đúng của phương pháp đo axit benzoic C Rev (%) 1/2.RSDHorwitz Kiểm tra (%) 50 ppm 97.42 4,44 Đạt 100 ppm 97,10 4,00 Đạt 150 ppm 102,47 3,76 Đạt Bảng 3.14 Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp đo axit sorbic C Rev (%) 1/2.RSDHorwitz Kiểm tra (%) 50 ppm 98,80 4,44 Đạt 100 ppm 100.12 4,00 Đạt 150 ppm 96,83 3,76 Đạt 18 + Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.9 và 3.10 cho thấy phương pháp đạt được... Áp dụng phương pháp xây dựng định lượng một số mẫu thực phẩm trên thực tế Tiến hành với các điều kiện sắc ký và thao tác như đã xây dựng tùy vào hàm các hoạt chất trong chế phẩm khác nhau có thể pha loãng khác nhau (sao cho nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính xác định của phương pháp đã được xác định) phù hợp với quy trình định lượng đã xây dựng 19 Bảng 3.15 Kết quả định lượng các sản phẩm trong thực . DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HỒ THỊ HỒNG MY XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AXIT BENZOIC VÀ AXIT SORBIC TRONG CÁC LOẠI THỰC PHẨM ĐÓNG GÓI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC. phẩm đóng gói bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao với hai mục tiêu : 3 - Xây dựng được qui trình phân tích đồng thời axit benzoic và axit sorbic trong một số thực phẩm. toàn thực phẩm, đồng thời tiết kiệm chi phí, rút ngắn thời gian phân tích, chúng tôi chọn đề tài: “ Xác định đồng thời axit benzoic và axit sorbic trong các loại thực phẩm